2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 王永红, 黄帅, 徐平, 李衍常
- WANG Yonghong, HUANG Shuai, XU Ping, LI Yanchang
- K6非典型泛素化修饰研究进展
- Progress in atypical ubiquitination via K6-linkages
- 生物工程学报, 2022, 38(9): 3215-3227
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(9): 3215-3227
- 10.13345/j.cjb.220041
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文章历史
- Received: January 19, 2022
- Accepted: March 28, 2022
- Published: March 31, 2022
引用本文
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2. 军事科学院军事医学研究院 生命组学研究所 国家蛋白质科学中心 (北京) 北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室, 北京 102206;
3. 中国医学科学院蛋白组学与新药研发创新单元, 北京 102206
2. State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences Beijing 102206, China;
3. Research Unit of Proteomics & Research and Development of New Drug, Chinese Academy of Medical Sciences Beijing 102206, China
泛素(ubiquitin)[1]是一种由76个氨基酸构成、在真核生物中广泛存在的小分子蛋白。泛素分子序列高度保守，酵母和人的泛素分子只存在3个氨基酸差别。泛素空间结构是由1个α螺旋和5个β折叠构成的SSHSSS结构[2]。其中，K27、K29和K33处于α螺旋中，K6、K48处于β折叠中，而K11、K63处于中间区域。泛素在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2以及泛素连接酶E3的级联酶促作用下，将泛素分子共价修饰到底物蛋白的赖氨酸残基上发生单泛素化修饰(mono-ubiquitination)；修饰底物的泛素分子可以进一步被泛素分子修饰形成多泛素化修饰(poly-ubiquitination)，使底物蛋白“标签化”。蛋白质发生泛素化修饰后可能影响修饰底物的稳定性、构象、活性、相互作用蛋白或者细胞定位，从而发挥新的调控功能[3]。此外，泛素化修饰为动态可逆的翻译后修饰，可以通过去泛素化酶的作用使得泛素化修饰维持动态平衡[4]。
泛素链拓扑结构的复杂性是其功能多样性的结构基础。泛素分子的7个赖氨酸位点和N端的甲硫氨酸可以继续被泛素修饰进而形成8种不同拓扑结构的泛素链，包含K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63及M1线性链[5]。泛素分子的疏水表面(比如Ile44和Ile36两个疏水表面) 是泛素化信号被识别的结构基础。不同泛素链具有不同的空间结构进而暴露不同的疏水表面，可以被特异性的泛素结合结构域(ubiquitin-binding domain, UBD) 所识别。含有特定UBD的蛋白会识别并传递泛素链所代表的功能信号[6]。K48、K6与K11链采用结构紧凑的空间构象[7-8]，这种构象会将以Ile44为中心，Leu8、Val70和His68组合成的疏水表面暴露在外，有利于相应的泛素结合结构域(UBD) 的识别以快速启动下游效应信号，而K29、K33则采用相对开放且疏松的结构[9]。
按照丰度和研究程度，多聚泛素链分为“经典(classical)”泛素链和“非典型(atypical)”泛素链。经典泛素链主要是丰度较高的K48泛素链和K63泛素链，也是目前已知功能最多、研究最深入的泛素链。其中，K48链主要起到介导降解和调控蛋白稳定性的作用[10-11]；K63链主要发挥非降解功能，包括信号转导、DNA损伤修复、线粒体遗传和调控蛋白活性等过程[12]。截至目前，“非典型”泛素链(K6、K11、K27、K29、K33和M1链) 的已知修饰底物和功能相对较少[13]。研究显示，K11链参与内质网相关降解(endoplasmic reticulum-associated protein degradation, ERAD) 和细胞周期调控因子的周期性降解；另外K11泛素链还具有非降解功能，比如参与甲硫氨酸转录因子Met4的转录激活调控[14-15]；K29泛素链能介导底物分别参与蛋白酶体和溶酶体降解途径；K29和K33位的混合泛素链参与AMPK活化的相关激酶系统的调节[16]；其他形式的泛素链与细胞周期、溶酶体降解、激酶识别等一系列过程相关。越来越多的研究表明非典型泛素链对机体具有重要的调控作用。
K6泛素链是迄今为止研究最少的非典型泛素链之一。由于K6泛素链已知的修饰底物相对较少，且调控K6链合成及连接的特异性酶尚不清楚，因此很大程度地限制了对K6泛素链的调控机制、底物筛选以及功能的研究。前期研究发现，K6泛素链可以通过调节机体因子进而影响某些疾病的发生与发展，比如肿瘤抑制因子BRCA1可以自体泛素化形成K6泛素链，从而调控众多生命过程；另外，K6泛素链可以参与线粒体质量控制进而影响帕金森疾病的发生与发展[17]。K6泛素链功能的逐渐发掘以及与人类疾病关系密切，表明其功能与机制研究具有重要的学术价值和临床意义。本文就K6泛素链的结构、生成、识别、移除以及生物学功能等研究进展进行综述。
1 K6泛素链的结构解析泛素链结构的解析是功能研究的重要前提。由于特异性生成非典型泛素链的E2和E3不明确，因此无法通过体外酶促反应合成相应的泛素链。目前K6泛素链的结构信息主要是基于计算机建模或化学合成法合成后，采用核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)、质谱或是X晶体衍射来解析[18-19]。与K48、K11泛素链一样，在溶液中K6泛素链同样采用紧凑的空间构象，其二聚体暴露的疏水表面由Ile44和Ile36表面构成[20-22]。
由于K48泛素链的结构解析比较明确[23]，在探究泛素链的结构时，研究者通常会选择以K48链作为标准进行结构比对。Fushman等[13]使用分子建模来预测是否有其他泛素链具有类似于K48链的闭合构象。结果表明，8种泛素链(二聚链) 可以分为两类：K6、K11、K27或K48链具有闭合构象(图 1)；K29、K33、K63或M1线性链由于空间位阻无法形成紧密接触，因此采用了相对开放松散的空间构象。
除了建模预测空间结构，研究者还通过实验手段检测K6泛素链的构象。Virdee等[18]开发了一种合成均相连接泛素链的新方法——基因编码正交保护和活化连接(genetically encoded orthogonal protection and activated ligation, GOPAL)，它结合了遗传密码扩张和化学选择性蛋白质化学(genetic code expansion and chemoselective protein chemistry) 标记技术，允许在没有细胞合成机制的情况下合成特定的泛素链。他们用这种方法合成了K6连接的二聚体，并使用了胰蛋白酶消化、质谱检测的方式证实了纯化的K6连接的二聚体是通过遗传导向位点的异肽键连接。随后，他们通过X射线晶体学确定K6链二聚体的结构，揭示了K6链二聚体的晶体结构为不对称紧密构象。然而，溶液中的泛素链具有动态性质，与晶体中的结构可能有所差别，他们进一步在核磁共振及单分子水平上研究K6链的结构。结果表明K6链与K48链[23]一样在溶液中可能采用动态变化的构象。随后，Shahul Hameed等[19]使用核磁共振证实了二聚体分子的确以不同的构象存在于溶液中。另外，结构信息显示K6泛素链存在不对称界面，是以Ile44和Ile36为中心的泛素疏水表面相互作用形成的紧凑结构，该结构还具有泛素本身的特征，且疏水相互作用在K6的功能区中占主导地位[24]。这种非共价二聚体排列使每个晶体学独立单体的K6与另一单体的C末端紧密接触[25]。在溶液中含有动态结构的泛素链会因为结构发生改变导致疏水结构区域位点或是折叠方式等发生一定的变化，导致与其结合的物质等随之改变从而影响功能。因此，有可能通过这些物质在溶液中动态结构的信息发现一些新的作用机制。Shekhawat等[26]使用细菌蛋白NleL的E3连接酶活性，通过19F核磁共振发现了形成K6连接的diUb-CF3 (−83.10 pm)。
2 K6泛素链检测技术的研究泛素化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与调控诸多生物学过程。精准检测底物蛋白上的泛素链信号是功能研究的前提和基础。目前，泛素化信号的检测与鉴定主要依赖抗体法和质谱法。
抗体法检测底物的泛素链类型通常分为两种策略：(1) 依赖于泛素链特异性的抗体直接检测底物上存在的泛素链类型。目前商业化泛素链的抗体主要为K48/K63/K11和M1链抗体，缺乏其他非典型泛素链的抗体，且抗体的特异性和效价不高，使用范围不广；(2) 结合分子遗传学手段进行检测，通过细胞内过表达单K保留或者单K突变的人工泛素，通过检测人工泛素分子上的标签，来正向、反向证明底物蛋白的泛素链类型。该策略依赖于标签抗体，检测特异性强，但是操作复杂、操作流程长。
另外，研究显示不同的泛素抗体对不同的泛素链的亲和力和识别效率不尽相同[27]。例如，来自Dako的抗泛素抗体不识别M1线性链以及K48和K63链，相比之下，FK1抗体优先结合K48连接的寡聚体，而FK2抗体优先结合M1线性链而非K48或K63泛素链。因此，选择使用哪种抗泛素抗体对于检测结果至关重要。目前，由于缺乏针对K6泛素链的检测与富集的有效抗体，验证底物是否发生K6泛素链修饰，主要是通过细胞内表达K6单保留(其他K突变为R) 和K6单突变(其他K保留) 的人工泛素分子，通过检测人工泛素N端的标签(如Myc、Flag或者HA标签)，确定底物是否发生了K6泛素链修饰。这种策略的验证过程复杂且不稳定，假阳性和假阴性偏高都限制了该方法的应用范围。
质谱法是一种可以大规模检测蛋白质信号以及位点等的方法，在靶向鉴定与定量泛素链类型、大规模表征泛素化修饰位点等方面发挥着重要的作用。泛素化蛋白经过胰蛋白酶消化处理后，会产生K-ε-GG特征肽段，提供泛素化修饰位点的信息；泛素链同样会产生特征肽段代表不同的泛素链信息，利用该方法可以实现对K6泛素链的鉴定与定量。由于经过胰蛋白酶酶切，将底物与泛素链切开，失去了空间对应关系。只能判断底物的修饰位点，存在哪些泛素链类型，但是无法确定两者的对应关系。另外，有的类泛素化修饰，比如ISG15和Nedd8修饰经胰蛋白酶处理后同样会产生K-ε-GG肽段，通过质谱法无法区分这种假阳性干扰。
Middle-down质谱法，包括在自然条件下限制性酶切消化泛素链，特别是在Arg74之后进行切割，这个方法到目前为止已被证明适用于支链检测，且已经被用来估计细胞中支链的丰度，并检测特定的链构型，包括那些由分支的K6/K48、K11/K48和K29/K48连接组成的链[28]。在最近的一项研究中，一种基于工程病毒蛋白酶(LbPro) 活性的中下游法被用来检测体外和细胞内的支链，该酶具有高度特异性切割泛素Arg74的能力。这种方法被称为Ub-Clip的方法，它能够量化细胞中的支链，且使用此方法检测到多达20%的聚合泛素是以分支链形式存在[29]。将这些方法应用于K6非典型泛素链的鉴定与定量，可能为解析K6泛素链的功能研究提供技术支撑。
除了抗体法与质谱法以外，泛素结合结构域(UBD) 也可用于识别和结合泛素修饰。目前已确定了20多种不同的UBD家族[30]，但是，不同的UBD对不同类型的泛素链有不同的偏好[31]。例如：Hhr23A和MUD1的泛素相关结合域偏好K48链[32]；而NPI4锌指结构域偏好K63链[33]。由于UBD偏好链的特性，使得人工构建的UBD用于泛素链的检测富集出现了偏差。本实验团队发明了一种可以结合多聚泛素链进行检测的新技术-人工串联杂交UBD (tandem hybridization of UBD, ThUBD)[34]。相较于天然UBD，ThUBD与泛素化蛋白结合的亲和力强。此外，它对所有7个赖氨酸连接的链显示出几乎无偏差的高亲和力。然而目前仍然无法特异性地识别K6非典型的泛素链，未来发展能够针对K6泛素链特异性的泛素结合材料对于K6泛素链的研究具有重要意义。
此外，Michel MA等证明了K6 Affimer的技术可以在内源水平上检测细胞中K6链的丰度信号[35]。他们建立了一个稳定的T-REx 293细胞系，在细胞系中诱导表达全长血凝素(hemagglutinin, HA) 标记的细菌效应器NleL。与未诱导表达的细胞系相比，他们发现诱导表达NleL时整体泛素化信号没有显著变化，但利用K6 Affimer检测样本的信号会增强，证明了K6 Affimer可以用于检测细胞中K6链修饰的底物。
在鉴定K6链的技术中，除了Affimer技术以外，本实验室发展了一种基于内源表达人工泛素的策略，实现对K6泛素链修饰底物的正向筛选。其核心的原理是细胞内除了野生型的泛素分子外，还表达一种N端带有亲和纯化的标签(比如多聚组氨酸或者生物素标签) 的人工泛素分子，该分子的其他赖氨酸都突变为精氨酸，只保留K6位点，该分子只能生成K6泛素链而不能生成其他泛素链。通过亲和纯化并结合定量蛋白质组学策略实现正向筛选带有K6链的底物蛋白。我们证明了表达人工泛素的菌株生长与代谢等特征与野生型细胞无显著差异，为筛选正常生理条件下的修饰底物提供了前提；另外证明了人工泛素可以有效地掺入泛素链并生成K6泛素链。诸多数据表明该筛选方法高效特异，为修饰底物的筛选和功能研究提供了候选蛋白(数据未发表)，为进一步开展K6非典型泛素链的功能研究提供了重要参考。
3 K6泛素链的生成与识别早期，Lam等[36]在研究牛26S蛋白酶体PA700调控复合物中泛素异肽酶的特异性试验中发现，PA700除了可拆卸K48链以外还可拆卸K6和K11多聚泛素链。Baboshina等[37]在酵母蛋白Rad6 (Ubc2) 的催化反应中观察到了K6链的产生且该过程不依赖E3。随着研究的深入，K6泛素链的生物学功能被逐步揭开。
最初，研究者发现肿瘤相关因子BRCA1/ BARD1异二聚体与K6泛素链存在关联。Wu-Baer等[38]通过突变泛素的第6位赖氨酸为精氨酸(K6R)，发现催化生成泛素链的含量降低，证明了BRCA1/BARD1催化形成K6连接的泛素聚合物。Morris和Solomon[39]证明了K6泛素链的形成是在BRCA1/BARD1异二聚体催化作用下形成的，且参与了DNA复制和修复过程(图 2)。而后，Hiroyuki Nishikawa等[40]用质谱分析再次证实了BRCA1-BARD1催化K6连接的多泛素链的形成，且证明了K6泛素链具有稳定BRCA1/BARD1异二聚体，抑制其蛋白质降解的作用(图 2)。
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| 图 2 K6泛素链的生成与移除 Fig. 2 Generation and removal of K6 ubiquitin chain. A：DNA损伤修复；B：促进K6形成的E3；C：与K6结合的E2；D：UBXN1的N端的UBA结构域结合BRCA1上的K6链；E：可移除K6链的两种去泛素化酶 (A) DNA damage repair. (B) E3 that promotes the formation of K6. (C) E2 that binds to K6. (D) The N-terminal UBA domain of UBXN1 binds to the K6 chain on BRCA1. (E) Two types of deubiquitination enzyme that can remove the K6 chain. |
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另外，越来越多研究发现能够生成K6泛素链的关键酶。比如，Ben-Saadon等[41]研究发现Ring1B会生成K6、K27和K48的混合多聚泛素链；Lin等[42]发现一种来自肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7的细菌效应子E3连接酶NleL (非Lee编码的效应子连接酶) 可以催化K6和K48链的形成(图 2)；Hospenthal等[43]使用NleL体外生成大量K6连接的polyUb，从而能够对这种非典型的泛素链类型进行详细的生化和结构分析，且证明它可以同时利用K6和K48进行泛素链的延伸；Nguyen等[44]研究发现泛素连接酶UbcM2会促进少量K6链的生成，由于UbcM2高度保守且参与了细胞增殖、发育和细胞抗氧化等生物学过程，因此暗示K6泛素链可能参与了上述过程的调控(图 2)。
4 K6泛素链的移除泛素化修饰是一种可逆的翻译后修饰，但参与K6泛素链移除的关键酶和机制的研究尚浅。有研究从K6泛素链形成因子以及参与的生物学过程寻找线索，来发现哪些蛋白可能参与K6泛素链的移除。Wu-Baer等[45]在筛选特异性结合自体泛素化BRCA1的蛋白质时，发现UBXN1蛋白可以结合自泛素化的BRCA1/ BARD1异二聚体，UBXN1的N端的UBA结构域结合BRCA1上的K6链，而其C端序列以泛素非依赖的方式与BRCA1/BARD1相互作用，与UBXN1结合显著抑制BRCA1/BARD1的E3连接酶活性，降低了K6泛素链的形成效率(图 2)。
此外，有研究[46]显示线粒体损伤会刺激Parkin在线粒体上组装K6、K11和K63链，而USP30是一种位于线粒体的泛素特异性去泛素化酶，可以高效特异地移除线粒体上的K6链[47]。Gersch等[48]同样证实了USP30可以调节K6泛素链(图 2)。而Durcan等[49]则发现另一种去泛素化酶USP8可以优先从Parkin上去除非规范的K6泛素链；在他们之后的研究[50]中发现PARK2在其自身上主要形成K6泛素链，而USP8可以优先移除K6泛素链，从而调节该途径中PARK2的活性和功能。此外，Ordureau等[51]揭示了一种驱动Parkin募集和线粒体泛素化以响应线粒体损伤程序的反馈机制。由此，便可了解到K6泛素链在线粒体质量控制中的重要性。除此之外，Ring1B和Bmi1会生成K6、K27和K48的混合泛素链[41]；而ARF似乎可以选择性地阻止Ring1B自身泛素化[52]。HUWE1在全局范围内丢失会降低K6链的水平[36]。Mevissen等系统地表达了OTUD去泛素化酶，通过体外反应显示OTUD3可以优先去除K6和K11连接的双泛素链[53-54]。
5 K6泛素链的生物学功能与相关疾病 5.1 癌症据世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research On Cancer, IARC) 发布全球最新癌症数据，2021年全球新发癌症病例1 929万例，死亡病例996万例，其中乳腺癌新增人数达226万，肺癌为220万，乳腺癌正式取代肺癌成为全球第一大癌症。癌症是由各种辐射或者化学污染、环境污染等引起体内基因发生突变的疾病[55]。BRCA1是一种直接与遗传性乳腺癌有关的抑癌基因。在BRCA1发生突变的情况下，患上乳腺癌的几率高达85%，许多家族性遗传乳腺癌的发生均有BRCA1的突变发生[56]。内源性BRCA1容易形成BRCA1/BARD1异二聚体[41, 57]，且BRCA1/BARD1异二聚体主要催化K6泛素链的形成[38]。同时，BRCA1又可作为多泛素化底物在体内经历自泛素化，自泛素化会导致大部分K6链与BRCA1共轭，使得BRCA1和BARD1多肽在体内共表达时彼此稳定。此外，USP30可特异降解K6泛素链且USP30是组合抗癌治疗的潜在靶标[58]。Wang等[59]发现USP22可以去除PD-L1和CSN5的K6、K11、K27、K29、K33和K63连接的泛素链，从而抑制癌症的发生。
5.2 帕金森疾病帕金森病(Parkinson’s disease, PD) 又名震颤麻痹，是一种常见于老年人的神经系统变性疾病。线粒体质量控制与编码帕金森疾病的基因有关[60]，因此，靶向精准地调控线粒体质量给帕金森病的治疗带来了希望。近年来，K6泛素链在帕金森疾病发生、发展中的作用也逐渐被重视起来。Ordureau等[61]研究发现K6和K63链在线粒体质量控制中发挥重要作用。如前所述，去泛素化酶USP30特异性移除线粒体上的K6链，拮抗由泛素连接酶Parkin和蛋白激酶PINK1驱动的线粒体上的K6链。USP30的过度表达会去除附着在与帕金森相关的受损线粒体上的泛素，降低了线粒体质量控制的能力[62]。Gersch等[48]的研究中证明靶向降低USP30活性则会增强神经元中线粒体的降解。他们的实验表明Parkin和USP30都分别显示了对K6泛素链的组装或拆卸偏好，证明了K6的特异连接可修饰线粒体底物，且K6泛素链参与线粒体稳态维持[63] (图 3)。此外，Durcan等[50]揭示了一种新的控制机制，即通过去泛素酶USP8选择性地去除非典型的K6连接的泛素链来控制介导帕金森病的线粒体，确立了去泛素化在线粒体调控中的功能性作用[50]。
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| 图 3 K6泛素链的生物功能 Fig. 3 Biological functions of K6 ubiquitin chain. A：维持线粒体稳态；B：抑制蛋白质降解；C：细胞周期与DNA修复 (A) Maintain mitochondrial homeostasis. (B) Inhibit protein degradation. (C) Cell cycle and DNA repair. |
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已有的许多研究证明，K6泛素链参与了几种因子对DNA的调控作用。如与K6有关的BRCA基因作为HR修复的关键抑癌基因起到抑癌作用，其编码的蛋白可修复S期产生的重组DNA损伤[29] (图 3)。Morris等[39]通过免疫组织化学方法证明在体内伽马辐射引起损伤后，BRCA1与泛素结合结构物共定位于复制叉和DNA修复位点，且内源性BRCA1形成泛素结合结构物需要K6链的参与。因此，BRCA1定向的泛素连接发生在S期，并响应复制压力和DNA损伤。此外，人们认为K6泛素链会影响DNA损伤附近修复因子的浓度，从而在信号放大中起作用或使DNA缩聚和/或影响核小体和染色质组装[39]。Jung等[64]用顺铂处理的HeLa细胞进行的细胞分离实验显示，DNA损伤后染色质相关的pol Ⅱ蛋白水平增加，且体外转录抑制可促进泛素残基K6、K48和K63的pol Ⅱ泛素化；而UbIA-MS方法确定TAB2和TAB3为新型K6双泛素相互作用物，显示了一类单泛素和K6双泛素相互作用物，其结合作用是由DNA损伤诱导的[65]。近些年的研究也证实DNA损伤反应(DNA damage response or DNA damage repair, DDR) 是由K6连接的泛素化控制的[66-69]。
除此之外，K6泛素链还可以特异有效地抑制蛋白质降解[67] (图 3)；MGRN1能通过K6泛素链修饰α-tubulin来确保适当的聚合[68]。泛素分子本身可以在K6和K48上发生乙酰化修饰进而抑制泛素链的形成和延长[69-70]。这种乙酰化是通过占位泛素的赖氨酸残基，从而抑制泛素化来提高靶蛋白的稳定性。此外，本实验室还设计了反向研究K6链功能的策略，通过保留其他赖氨酸位点而突变K6位点(K6R) 造成细胞内缺失K6泛素链。然后通过深度覆盖的SILAC定量蛋白质组学策略，比较了野生型和K6R突变菌株，差异蛋白功能分析显示K6链的缺失会引起氨基酸代谢、糖代谢以及DNA损伤修复等过程的紊乱(数据未发表)，为进一步探究K6泛素链的广泛功能提供了有价值的数据集。
6 展望泛素以其独特而复杂的连接方式，构成了7种多聚体泛素链以及1种线性泛素链，共同构成了生物功能繁多的泛素密码，参与着机体的疾病以及其他生物学功能。随着研究技术的提升，“非典型”泛素链的研究逐步成为泛素化研究领域的重要方向，同时也是研究热点和挑战。目前，K6泛素链在肿瘤抑制因子BRCA1、机体的DNA修复、线粒体调控及肿瘤抑制[29]等方面的作用也日益凸显。此外，除了常规的这些功能外，K6链也可能作为信号分子传递特定的生物学功能。目前，仍然缺乏特异性研究K6泛素链的方法，主要原因是缺乏针对K6泛素链特异性的抗体。K6非典型泛素链在细胞内的含量相对较低，另外泛素和泛素链的序列和空间结构在不同真核生物中广泛存在且高度保守，使得目前产生特异性高且亲和力强的抗体存在挑战。因此，寻找能够与K6泛素链特异性结合的材料显得尤为重要。我们认为通过系统评价不同UBD对K6泛素链的亲和特性进而构建高亲和力、高特异性的K6链结合材料是解决K6泛素链检测与富集的重要技术策略。此外，目前利用模式生物，通过遗传改造手段进行K6链的底物筛选与功能研究也是重要的研究策略和有效手段。
未来，随着泛素化底物富集技术及定量蛋白质组学发展的进步，探究更多非典型泛素链修饰的底物逐渐成为了可能。比如上文中提到的本实验室的研究工作，很好地揭示了K6泛素链功能的重要性。我们有理由相信，随着进一步开发K6非典型泛素链的检测与富集技术，会有越来越多的新修饰底物被发现，进而揭示其新的生物学功能。但对于K6链的研究，还有很多难点与挑战需要我们去解决，比如发现K6链在E1、E2、E3作用下进行组装的机制；特异性去除K6链的去泛素化酶的发现；特异性识别K6泛素链的UBD结构域及富集K6链的方法等等。在研究这些难题的基础上，我们可以探究其在不同生物学过程中的作用；探究其在不同疾病过程中的作用与调控机制，从而发展精准的临床检测与治疗策略。
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