随着人类社会发展持续提速，对洁净能源以及化学品需求也进一步增大^[1]。脂肪酸是一种大宗化学原料，不仅能够通过转酯化反应合成生物柴油，也可以作为诸如化妆品、个人护理产品和工业润滑剂等化工品原料^[2]。目前脂肪酸主要来自动植物油脂，随着其需求量剧增，迫切需要寻找可持续的供给路线^[3]。随着合成生物学的兴起、基因编辑技术的成熟，构建微生物细胞工厂高效合成生物化学品及生物能源成为可能^[4-5]。不同微生物之间存在代谢差异，因此被用于不同目标产物合成，比如生产蛋白^[6]、抗生素^[7]、油脂^[8]等。

脂肪酸是一种化工原料，能广泛应用于生物能源、化妆品、个人护理产品和工业润滑剂等领域。微生物合成是一种潜在的可持续脂肪酸合成路径^[2-3]。目前，通过代谢工程策略改造大肠杆菌^[9]、解脂耶氏酵母^[10]和酿酒酵母^[11]在批式补料条件下脂肪酸产量分别能达到21.5、10.4、10.4 g/L (若无特殊说明，本文所述脂肪酶为游离脂肪酸)。特别是系统改造酿酒酵母初级代谢途径并进一步适应性进化，氮限制批式补料发酵脂肪酸产量最高能达到33.4 g/L^[12]。然而，目前脂肪酸产量还不足以达到工业化水平，除了在这些模式菌株进行进一步代谢工程改造外，尝试其他潜在底盘细胞工厂可能是提高脂肪酸产量的另一种选择。

多形汉逊酵母(Ogataea polymorpha) 是一种非常规酵母(曾用名Hansenula polymorpha)，因能利用甲醇、繁殖快、耐高温、底物代谢图谱广泛、异源蛋白表达能力强等特点备受关注^[12-15]。目前O. polymorph已被用于生产人乳头瘤蛋白HPV16^[16-17]、中性粒细胞刺激因子(GCSF)^[18]、链霉素^[19]和其他蛋白类^[20]化合物以及乙醇等大宗化学品^[21]。这些研究表明O. polymorph具有成为微生物细胞工厂的潜力，应用前景广阔^[22]。特别地，O. polymorpha是一种Crabtree阴性菌株，不积累乙醇等副产物，在化学品生物合成中具有一定优势，有望成为高效合成脂肪酸等产物的细胞工厂。

发酵工程是从微生物代谢机理出发，在发酵过程中通过底物和条件控制^[23]以实现高产量、高底物转化率和高生产强度三者相对统一的发酵过程优化与控制技术，是微生物工业化生产的重要环节^[24]。其中产量是目的产物的最终浓度或质量，转化率是底物最终转化为目的产物的百分数，生产强度是单位时间、单位体积内目的产物的产量，一般情况下，三者无法同时达到最大值，需要对整个发酵过程综合因素进行评价，找到最大经济效应的平衡。

因此，本研究以野生型O. polymorpha NCYC 495为出发菌株，通过高效基因编辑技术，构建了高产脂肪酸的工程菌株。在此基础上，通过发酵条件优化(包括培养基C/N比，发酵温度和pH值等)^[25]，提高工程菌株脂肪酸生产能力。最后，通过采用溶氧(DO) 耦联的批式补料发酵，脂肪酸产量达到18.0 g/L，初步证明了O. polymorph作为微生物细胞工厂具有很大的潜力。

1 材料与方法 1.1 实验菌株构建

本实验所需菌株如表 1所示，出发菌株O. polymorpha NCYC 495购自中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC，编号2.2412)。出发汉逊酵母为亮氨酸缺陷型，为了构建产脂肪酸微生物细胞工厂，本实验室设计了基于CRISPR/Cas9的高效基因组编辑系统^[26]，用于敲除基因faa1 (图 1A)。具体构建步骤如下：首先，构建靶向基因faa1的sgRNA表达载体，以leu2作为筛选标记，其中20 bp靶向序列为5′-ATTGATCCTAACGATAAGCG-3′；接着，构建供体DNA分子，分别扩增基因faa1编码区上下游各1 000 bp序列，通过融合PCR方法获得完整供体DNA片段；将sgRNA表达载体和供体DNA以各500 ng的量，电击转化进入整合有Cas9蛋白的重组汉逊酵母，于SD平板37 ℃静置培养2–3 d；转化子经液体SD培养基培养后，提取基因组作为模板，并以引物p311 (5′-TAGTCGAGTACTGAGGGGCG-3′)和p159 (5′-TTGCACCAGGAGGAGTACCT-3′)进行PCR验证。阳性克隆在电泳检测中获得更短条带(图 1B)，将阳性克隆在YPD培养基中进行连续传代丢失质粒。质粒丢失后的菌株命名为23-3。为了避免营养缺陷型对后续实验中细胞生长与脂肪酸合成的影响，将Opleu2基因进行了原位回补。以菌株CGMCC 2.2497基因组作为模板，扩增具有完整功能的Opleu2基因片段，上下游各含1 000 bp序列作为同源臂，以1 μg分别电击转化菌株495和23-3，于SD-LEU平板进行筛选，利用菌株生长作为筛选压力，获得的转化子经测序验证正确后，分别命名为FD06和FD09。

1.2 主要试剂和仪器

葡萄糖、无水磷酸二氢钾、琼脂粉、七水硫酸镁购自生物工程(上海) 股份有限公司，无氨基酵母氮源购自北京酷来搏科技公司，蛋白胨购自北京奥博星公司，酵母粉购自Oxoid公司，硫酸铵和微量元素溶液中的各种试剂购自天津市科密欧化学试剂有限公司，Macy UV-1 100紫外可见分光光度计，美析(中国) 仪器有限公司；ZQZY-CF8三层组合全温振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；Sigma 1-16高速离心机，美国SIGMA公司；Gas Chromatograph-Trace 1 300，美国Thermo公司；生物传感分析仪SBA-40D，山东省科学院生物研究所；平行生物反应系统(Parallel Bioreactor Systems-DASGIP)，德国Eppendorf。

1.3 实验方法 1.3.1 种子液培养

从–80 ℃取出保存的O. polymorph产脂肪酸工程菌甘油管，于YPD平板划线活化，培养3 d后，从中挑取单菌落于SD平板划线，继续培养2 d。再从活化的SD平板中挑取3个单菌落于3管3 mL优化过的初始Delft培养基^[27]中，于37 ℃、200 r/min恒温摇床培养16–18 h。Delft培养基成分：20 g/L C₆H₁₂O₆，14.4 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L MgSO₄·7H₂O，2 mL/L微量元素和1 mL/L维生素，用3 mol/L KOH调pH值至5.6。微量元素配方(g/L)：FeSO₄·7H₂O 3.0，ZnSO₄·7H₂O 0.45，CaCl₂·2H₂O 4.5，MnCl₂·2H₂O 1.0，CoCl₂·6H₂O 0.3，CuSO₄·6H₂O 0.3，H₃BO₃ 1.0，KI 0.1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.4，Na₂EDTA·2H₂O 19，最终pH为4.0。维生素溶液配方(g/L)：D-C₁₀H₁₆N₂O₃S 0.05，D-C₉H₁₆CaNO₅⁺ 1.0，C₁₂H₁₇ClN₄OS·HCl 1.0，C₈H₁₀NO₅P 1.0，C₆H₅NO₂ 1.0，C₇H₇NO₂ 0.2和C₆H₁₂O₆ 25。按照初始OD₆₀₀为0.1接种至20 mL发酵培养基，发酵培养基同为20 g/L葡萄糖Delft。SD培养基为20 g/L葡萄糖，6.7 g/L无氨基酵母氮源，固体平板加入2%琼脂粉。

种子液洗涤，取5 mL种子液培养基1 000×g离心5 min，用等体积无菌水洗涤两次之后测OD₆₀₀，进行体积换算后接种。

1.3.2 培养基碳氮比优化

第一组碳氮摩尔比为6、15、60、300、600、1 200，第二组碳氮摩尔比为60、120、180、240、300。首先配制1 L不含硫酸铵的Delft培养基，20 g C₆H₁₂O₆，14.4 g KH₂PO₄，0.5 g MgSO₄·7H₂O，2 mL微量元素和1 mL维生素。其中葡萄糖为400 g/L母液，单独灭菌后加入，微量元素和维生素过滤除菌后加入。分别按照每瓶18 mL分装至100 mL锥形瓶，最后参照表 2加入70 g/L(NH₄)₂SO₄和灭菌水至20 mL。每样3个平行，接种后于37 ℃、200 r/min恒温摇床发酵。

1.3.3 批式补料发酵罐

首先在3 mL Delft中准备一级种子液，过夜培养后转接100 μL至20 mL Delft培养基中，37 ℃、200 r/min培养。发酵罐初始培养基为每罐300 mL Delft，配方与摇瓶相同。补料培养基为碳氮摩尔比为120的培养基，成分为500 g/L C₆H₁₂O₆，15 g/L KH₂PO₄，2.5 g/L MgSO₄·7H₂O，9.17 g/L (NH₄)₂SO₄，10 mL/L微量元素和5 mL/L维生素。

采用溶氧关联补料。将平行生物反应器设置为当发酵罐溶氧超过30%则进行自动补料，低于30%或高于70%停止补料，补料速率为3 mL/h；温度维持在37 ℃，pH维持在5.6；采用2 mol/L KOH和2 mol/L HCl调节pH。

1.3.4 测定方法

菌体浓度用紫外分光光度计在波长600 nm下进行测定。葡萄糖浓度用生物传感分析仪进行测定。取样品于1.5 mL离心管，13 000×g离心3 min，取上清，稀释糖浓度至1 g/L以内，取25 μL进样。

脂肪酸提取方法：将发酵液稀释后取100 μL加入到100 μL去离子水和10 μL氢氧化四乙胺中，再加入200 μL甲酯化试剂(200 mmol/L碘甲烷-二氯甲烷溶液，含100 mg/L十五烷酸作为内标物)，1 600 r/min振荡30 min。之后2 000×g离心10 min，取下层有机相部分，挥发干后用200 μL正己烷重悬进样。

脂肪酸含量测定采用美国赛默飞气相色谱仪Gas Chromatograph-Trace 1 300。方法如下：进样口温度为280 ℃，采用氢火焰离子检测器(FID)，温度为250 ℃，分析毛细管柱型号为HP-5 (30 m×0.25 cm，0.25 μm膜厚度)。分离载气为氮气，流速1 mL/min。升温程序：初始温度40 ℃保留2 min，以30 ℃/min升至180 ℃，接着以4 ℃/min升至200 ℃保留1 min，最后以2 ℃/min升至240 ℃并维持10 min。

2 结果与分析 2.1 脂肪酸合成O. polymorph工程菌构建

在微生物细胞中，脂肪酸的生物合成前体为乙酰辅酶A (acetyl-CoA)，乙酰辅酶A首先作为脂肪酸合酶的起始单元，并在乙酰辅酶A羧化酶(Acc1) 催化下延伸成丙二酸单酰辅酶A，脂肪酸合酶(Fas) 依次催化丙二酸单酰辅酶A的脱羧延伸，依次添加二碳单位，合成脂酰辅酶A，最后经过硫酯酶催化释放脂肪酸。细胞内存在逆途径，通过脂酰辅酶A合成酶重新激活脂肪酸合成脂酰辅酶A，用以控制细胞内的脂肪酸稳态(图 1A)。汉逊酵母中脂酰辅酶A合成酶由faa1基因编码。为了增加脂肪酸的积累，我们敲除了faa1基因(图 1B)。为了避免营养缺陷型对菌株生长的影响，进一步回补了leu2基因，分别获得对照菌株FD06和faa1Δ菌株FD09 (表 1)。由图 1C和1D可见，faa1敲除后略微降低了细胞的生长速率，但大幅度提升了脂肪酸积累，产量从0.13 g/L提高到0.69 g/L。汉逊酵母主要合成16碳和18碳的直链脂肪酸，其中棕榈酸(C16)，油酸(C18-1) 和亚油酸(C18-2) 占比最大，达到90%以上；棕榈油酸(C16-1) 和硬脂酸(C18) 含量很少；且对照菌株与faa1Δ菌株在脂肪酸组成方面没有显著的差异(图 1E–1F)。因此，后续脂肪酸合成条件的优化均采用菌株FD09进行实验。

2.2 Ogataea polymorph脂肪酸最佳碳氮摩尔比(C/N)

根据文献[28]报道，产油微生物能在氮限制条件下大量积累油脂。因此尝试优化碳氮摩尔比(C/N) 来提高脂肪酸的产量。固定20 g/L葡萄糖作为碳源，通过调整硫酸铵浓度将碳氮摩尔比设置为6、15、60、300、600、1 200，在摇瓶中考察细胞生长以及脂肪酸产量。由图 2B生长曲线可知，C/N低于60时酵母生长速率基本一致，说明C/N低于60时氮源足够支持酵母正常生长，且不会影响生长速度。随着C/N提高，脂肪酸产量显著增加(图 2A)。但当C/N高于300时，酵母生长受到限制(图 2B)。尽管C/N为300和60时脂肪酸产量一样，但C/N为300时，葡萄糖消耗明显下降且不能耗完(图 2C)，表明氮源限制超过了细胞生长所需的最低要求。当C/N提高到1 200时，葡萄糖几乎没有消耗(图 2C)，且脂肪酸产量和细胞生长急剧下降(图 2A–2B)。在C/N低于60时，细胞生长和葡萄糖消耗虽然很快，但不利于脂肪酸合成。因此，最优C/N应在60–300之间。

我们进一步细化脂肪酸发酵培养基C/N，探究了C/N比为60、120、180、240、300时O. polymorph产脂肪酸能力。当C/N为120时，脂肪酸产量达到最高值1.42 g/L (图 3A)。与前期结果相似，随着C/N提高，酵母生长和葡萄糖消耗明显降低(图 3B–3C)，当C/N为120时葡萄糖在96 h刚好能够耗尽，脂肪酸产量也最高。因此，我们确定O. polymorph产脂肪酸的最佳C/N为120，即在尽量不影响生长的情况下，能最大限度将葡萄糖转化为脂肪酸。值得一提的是，在C/N为120条件下，葡萄糖消耗曲线几乎呈一条直线，表明在此C/N下耗糖速率为定值(图 3C)。这对于工业化补料具有重要研究意义，有助于计算补料速率和设计补料策略。

2.3 培养条件对O. polymorph产脂肪酸影响 2.3.1 培养温度对O. polymorph生长和脂肪酸产量的影响

为了探究不同温度下O. polymorph的生长和产脂肪酸能力，在C/N分别为60和120的Delft培养基中，比较不同种子液培养温度和发酵温度对酵母的影响。分别设计4组不同种子液培养温度-发酵培养温度进行比较，分别为：30 ℃-30 ℃，30 ℃-37 ℃，37 ℃-30 ℃，37 ℃-37 ℃，发酵液分别用C/N为60和120的Delft培养基。

结果再次表明，C/N为120更有利于细胞生长和脂肪酸合成(图 4)。种子液培养温度对细胞生长和脂肪酸产量影响很小，发酵时培养温度对脂肪酸合成有很大影响。当C/N为60，发酵培养温度为37 ℃时，酵母生长更快(图 4C)，脂肪酸产量也更高(图 4B)。当C/N为120时，细胞生长略微有所提高(图 4D)，脂肪酸产量显著提升，产量提高了52%，最高产量达到1.86 g/L (图 4B)，得率为(0.076±0.002) g/g葡萄糖。

2.3.2 种子液状态对O. polymorph生长和脂肪酸产量的影响

种子细胞的活性与状态可能对细胞生长和脂肪酸产量有较大影响，因此采用培养不同时期的种子细胞进行脂肪酸发酵生产。分别选取对数生长期前期(OD₆₀₀=4)、中期(OD₆₀₀=8) 和后期(OD₆₀₀=14) 的种子细胞，接种到发酵培养基中进行培养。并且清洗种子细胞以减少种子培养液中的代谢物对后期发酵的影响。结果表明，种子液的状态对最终生物量没有影响(图 5)。种子液OD₆₀₀在8左右时，脂肪酸产量最高。另外，清洗种子液对脂肪酸产量影响较小。这些结果说明采用对数中期的种子细胞进行发酵，有利于O. polymorph高效合成脂肪酸。

2.3.3 O. polymorph产脂肪酸最佳pH

我们前期发现C/N会影响细胞的生长和脂肪酸合成，测定不同C/N发酵终点pH值，发现pH值变化与C/N呈正相关(图 6A)。在pH为5.6的初始培养基中，高C/N培养基pH值几乎没有变化，而低C/N pH明显下降，最低达到2.7左右，明显偏酸性。因此，我们尝试对发酵培养基pH进行优化。在C/N为120的培养基中分别调初始pH为4.4、5.4、6.4和7.4。发现初始pH值越低，O. polymorph生长越好，能更快达到平台期(图 6B)，表明菌株更偏好酸性环境。而脂肪酸产量随着pH值升高逐步提高，在pH 6.4时脂肪酸产量达到最高值1.85 g/L (图 6C)。另外，我们在实验中发现pH为6.4的条件下脂肪酸会以固体颗粒析出，而pH为4.4时并未发现这种情况。这在一定程度上解除了底物抑制，有利于脂肪酸合成。

2.4 批式补料脂肪酸发酵

有研究报道，溶氧关联补料策略能够提高O. polymorph在批式补料过程中合成植酸酶的效率^[29]。溶氧关联补料操作简便，易于自动化控制，有望提高O. polymorph在批式补料过程中的脂肪酸产量。本研究分别将溶氧阈值设置为15%和30%两组，当溶氧超过设定值时，发酵罐会自动补料，溶氧低于设定值或高于70%时，停止补料。我们初始的培养基为Delft培养基，含有20 g/L葡萄糖(C/N为17.5)，葡萄糖耗尽时开始补料。补料培养基为葡萄糖浓度500 g/L、C/N为120的培养基。我们发现O. polymorph生长旺盛，在13 h初始培养基中葡萄糖即消耗殆尽(图 7A)。相比于前期批式发酵过程，补料后O. polymorph增长速率有所降低，但OD₆₀₀最高能达到221。脂肪酸产量随着菌体生长而增加(图 7A)。另外，在发酵过程中会有较多脂肪酸析出，并黏附于发酵罐壁和其他器件上。因此在发酵终点取样后，还需将发酵罐壁、搅拌桨、pH电极和溶氧电极等处的脂肪酸刮下，搅拌均匀后再取样。最终脂肪酸产量分别达到18.0 g/L和17.3 g/L (图 7B)，得率均能达到(0.08±0.003) g/g葡萄糖。这表明溶氧阈值设置为15%和30%都能获得很好的脂肪酸产量。

我们发现，工程菌在52–71 h生长会出现一段停滞期，菌株完全不生长。推测可能是溶氧充足条件下O. polymorph呼吸作用太强，更快地消耗碳氮源导致。后期之所以生长可能是细胞自噬为自身提供了新的氮源。经过计算发现，这段时间的C/N在70左右，因此推断在发酵罐中，O. polymorph产脂肪酸细胞工厂的最佳C/N应小于70。

3 总结与展望

为了拓展脂肪酸生物合成路线，本研究构建了O. polymorph脂肪酸生物合成菌株，并优化了发酵工艺。采用葡萄糖作为发酵底物与其他工程菌进行更直观的比较。首先在摇瓶水平探究了C/N对O. polymorph生长和脂肪酸合成的影响，最佳C/N为120。进一步对发酵液温度、种子培养状态和发酵液pH值进行优化，确定工程菌在37 ℃、种子液OD₆₀₀为6–8、培养基初始pH为6.4、C/N为120时，摇瓶中脂肪酸产量最高可达1.86 g/L，显著高于已报道代谢工程菌株大肠杆菌(1.1 g/L)^[9]、酿酒酵母(1.2 g/L)^[12]以及解脂耶氏酵母菌株(0.5 g/L)^[9]。值得一提的是，这些工程菌株都经过系统代谢工程改造，而本研究O. polymorph仅敲除faa1基因并进行发酵条件优化就能提高脂肪酸产量至1.86 g/L，表明其作为底盘生物具有一定的潜力。最后，优化了批式发酵条件，通过溶氧关联补料能够使微生物保持旺盛生长，并发现脂肪酸生产和生长相偶联，最终脂肪酸浓度达到18.0 g/L，得率能达到0.08 g/g葡萄糖，为理论得率的26%。尽管O. polymorph展现了脂肪酸的生物合成潜力，但与工程化解脂耶氏酵母(得率0.14 g/g葡萄糖)^[10]和酿酒酵母(得率0.1 g/g葡萄糖)^[11]仍有差距，这可能是由于前体乙酰CoA或者NADPH供应不足。将来对O. polymorph进一步代谢工程改造，有望进一步提高脂肪酸生产能力。

本研究为O. polymorph高产脂肪酸微生物细胞工厂构建与工艺优化做了一定探索，证明O. polymorph作为细胞工厂生产化学品具有一定的潜力^[30]。随着未来代谢工程和新的在线检测技术的发展，将进一步从分子水平和发酵水平提高O. polymorph的脂肪酸生产能力，并拓展O. polymorph的产物谱；还将尝试以甲醇作为底物进行脂肪酸生产，降低生产成本^[12]。