2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 李杰, 赵运英, 邓禹
- LI Jie, ZHAO Yunying, DENG Yu
- 高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建
- Engineering Saccharomyces cerevisiae for efficient production of glucaric acid
- 生物工程学报, 2022, 38(2): 705-718
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(2): 705-718
- 10.13345/j.cjb.210151
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文章历史
- Received: February 21, 2021
- Accepted: March 28, 2021
引用本文
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2. 江南大学 生物工程学院, 江苏 无锡 214122
2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
D-葡萄糖二酸(D-glucaric acid) 是存在于自然界中的一种具有高附加值的有机酸，被广泛应用于食品、化工和医药等领域，如降低类固醇和部分非类固醇，化学防癌等[1]。根据2004年美国能源部发布的十佳最具价值的利用生物法生产生物基产品的研究报告，葡萄糖二酸被认为是“最具价值的生物炼制产品(top value-added chemicals from biomass) 之一”[2]。目前，葡萄糖二酸的工业生产主要通过化学氧化法，包括硝酸和TEMPO电化学氧化法[3]，但是化学法生产的反应条件非常苛刻，同时会对环境产生较大的污染[4]。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 具有出色的抗逆性和低pH发酵能力，并具有相对清晰的遗传背景和基因组易于遗传改造的特点，因此被认为是代谢工程改造生产有机酸的优秀真核微生物模型[5]。Shiue等将外源miox4和udh基因引入酿酒酵母细胞进行异源表达，实现了通过葡萄糖和外加肌醇在酿酒酵母细胞中产葡萄糖二酸，之后又利用蛋白融合技术提高了此代谢途径中MIOX4的稳定性，使葡萄糖二酸的产量提高了65%[6]。将难以表达的蛋白质融合到亲和标签上，在许多情况下可促进蛋白质的正确折叠，并增加蛋白质的表达、溶解度和半衰期[7]。本实验室前期工作中利用酵母基因组含有大量delta重复序列这一特点，将拟南芥的肌醇加氧酶基因miox4和丁香假单胞菌的葡萄糖醛酸脱氢酶基因udh在delta位点高效表达，并敲除了肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1) 的转录抑制因子Opi1，得到了工程菌Bga-3，该菌株在5 L发酵罐中能够积累6.0 g/L的葡萄糖二酸[8]。前期研究发现，在该途径中葡萄糖二酸合成途径中关键酶MIOX4和Udh的表达量和活性都较低，而且酵母细胞中肌醇的转运效率也非常低[8]，这些因素都限制了葡萄糖二酸的合成。因此，如何强化葡萄糖二酸合成途径和提高肌醇转运效率，都是进一步提高工程菌Bga-3产葡萄糖二酸能力需要解决的关键问题。本研究首先过量表达酵母细胞自身的肌醇转运蛋白Itr1，通过提高工程菌摄取胞外肌醇的能力来促进葡萄糖二酸的积累。然后通过不同的寡肽连接子(linker) 将MIOX4和Udh进行融合表达，筛选效率最高的MIOX4-Udh融合蛋白，进一步提高葡萄糖二酸合成途径的效率。最后弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1，大幅度提高了葡萄糖二酸的产量，为酿酒酵母菌的代谢改造提供了理论基础。
1 材料与方法 1.1 菌株与质粒本实验所用菌株和质粒见表 1。
| Strains | Relevant genotypes | Sources |
| S. cerevisiae BY4741 S. cerevisiae CEN.PK2-1C |
MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0 MATa leu2-3, 112, ura3-52, trp1-289, his3-Δ1, MAL2-8c |
Lab store Lab store |
| BY4741 opi1∆ | MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, opi1∆ | [8] |
| Bga-0 | BY474 opi1∆ contains the episome pY26-miox4-udh plasmid | [8] |
| Bga-3 | Integrating the exogenous genes miox4 and udh into the delta locus of BY474 opi1∆ strain | [8] |
| Bga-3-Itr1 | Replace the promoter of the inositol transporter to PTDH3 of Bga-3 strain | This study |
| A3 | Integrate the MIOX4-Udh fusion protein (linker 4) into the delta site of the Bga3-Itr1 strain | This study |
| K3 | Integrate the MIOX4-Udh fusion protein (linker 9) into the delta site of the Bga3-Itr1 strain | This study |
| L3 | Integrate the MIOX4-Udh fusion protein (linker 12) into the delta site of the Bga3-Itr1 strain | This study |
| A3-DZWF1 | Replace the promoter of the ZWF1 gene of the A3 strain with PBBP1 | This study |
| K3-DZWF1 | Replace the promoter of the ZWF1 gene of the K3 strain with PBBP1 | This study |
| L3-DZWF1 | Replace the promoter of the ZWF1 gene of the L3 strain with PBBP1 | This study |
大肠杆菌培养用LB培养基，酿酒酵母用YPD、SD-URA和SD-HIS培养基的配制见参考文献[8]。
1.3 方法 1.3.1 ITR1启动子的替换为了将肌醇转运蛋白编码基因ITR1的启动子换成组成型强启动子，首先以pHAC181质粒[9]为模板，通过引物LEU2-2F/LEU2-2R扩增获得LEU2片段，以BY4741基因组为模板，通过引物PTDH3-F/PTDH3-R扩增获得的TDH3基因的启动子PTDH3，最后通过引物LEU2-2F/PTDH3-R将上述2个片段进行融合，获得LEU2-PTDH3片段。通过ITR1-NF/ITR1-NR引物扩增整带有ITR1启动子同源臂的LEU2-PTDH3片段，并转化到Bga-3菌株中，提取转化子的基因组，通过引物PTDH3-CHECK-F2/ ITR1-CHECK-R2进行PCR检测，正确的转化子再通过测序进行进一步确认。将ITR1基因的启动子替换为TDH3的启动子的菌株命名为Bga3-Itr1。
1.3.2 miox4-udh融合片段的构建和筛选分别以Bga-3[8]的基因组为模板，先以MIOX4-LF/MIOX4-LR为引物扩增PTEF1-miox4，分别以UDH-F0、UDH-F1、UDH-F2、UDH-F3、UDH-F4、UDH-F5、UDH-F6、UDH-F7、UDH-F8、UDH-F9、UDH-F10、UDH-F11、UDH-F12/UDH-R为引物扩增获得13个带有不同寡肽连接子的udh-Tcyc1片段。将上述PTEF1-miox4和带不同linker的udh-TCYC1，通过引物MIOX4-LF/UDH-R两个片段进行融合PCR，获得13个不同的PTEF1-miox4-udh-TCYC1-delta2片段，再通过MIOX4-LF/TCYC1-(opi1)R引物扩增获得带有OPI1基因启动子同源臂的PTEF1-miox4-udh-TCYC1片段；以Bga-3的基因组为模板，通过HIS3- (opi1)F/HIS3-(opi1)R引物扩增HIS3片段。所有引物序列见表 2。
| Primer names | Sequences (5′→3′) |
| MIOX4-LF | CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCAGCTGGAGCTC |
| MIOX4-LR | CCAACGCAGATTTTCAGGG |
| UDH-F0 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F1 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGGGCTCTGGCATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F2 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGGGAAGTGGCGGTGGAGGTTCAATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F3 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGGGCAGTGGTGAGGCGGCAGCTAAAATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F4 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGGGTTCTGGAGAGGCGGCTGCTAAAGAAGCCGCAGCGAAGATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F5 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGGGCAGTGGGATGGGTTCATCAAGCAATATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F6 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGCCGACGCCCACGCCCATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F7 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGCCTACCCCTACCCCGACGCCCACTCCGATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F8 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGCCCACGCCTACTCCCACACCCACGCCCACGCCAACACCGACACCTATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F9 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGGAAGCTAAAAAGAAAATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F10 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGGAGGCAAAAAAAAAAGAAGCCAAAAAGAAAATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F11 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGGAGGCCAAAAAAAAAGAAGCAAAAAAAAAGGAAGCCAAAAAGAAAATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-F12 | TCCCTGAAAATCTGCGTTGGTCCTCATCCAATAACAACAATAATAACAACAACAACAATATGGCCTCCGCTCATACTACGC |
| UDH-R | ACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTAAAAGGGAATCTGCAATTCTACAC |
| delta1-F | GGCTGGCAACTAATAGGGAC |
| pHAC181-F | AAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGC |
| pHAC181-R | GAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC |
| HIS3-(opi1)F | AATATCAATGGGAGGTCATCG |
| HIS3-(opi1)R | CCCACGTTACTCCTCGAGATAAGTTGGTCAACATTGATTTCGAGATTCCGACGCATCTGTGCGGTATTTC |
| MD-Check-(opi1)R2 | ACGTTCTGGCCTGATATGC |
| MD-Check-(opi1)F2 | TGATGATCTTACCCGTTTGC |
| MD-Check-(opi1)HisR | ATCACACCACTGAAGACTGCG |
| TCYC1-(opi1)R | GAGGTGGAAAAAAAAAAAATAAGAACGCCCGATTTTACCCGGTTGCATATTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAG |
| LEU2-2F | ACGTCTAAGAAACCATTATTATCATG |
| LEU2-2R | AAAGCGTTTCCGAAAACGAG |
| PTDH3-F | GCGCTCGTTTTCGGAAACGCTTTTGCCTCATCAGTAAGACCCG |
| PTDH3-R | TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG |
| ITR1-NF | TAGTTGAGAAAAGACCTTTCACACTTGGGCTTTTCTTTGGCAGGTGTTTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATG |
| ITR1-NR | ACATTTGATTGCGATGTCTTTGACGTGAGATATGGTATGTGTATTCCCATTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG |
| PTDH3-CHECK-F2 | AGCGCAACTACAGAGAACAGG |
| ITR1-CHECK-R2 | TTTGACGTGAGATATGGTATGTG |
| delta1-F | GGCTGGCAACTAATAGGGAC |
| TADH1-R | GCTAAATGATGCTCAGGCGCCGAAATAATTTAATTAACAATTCTTCGCCAGAGG |
| URA3-MU-F | GGCGCCTGAGCATCATTTAGCTACAGGCAAGCGATCCGTC |
| URA3-MU-R | CACTGGCCGTCGTTTTACAACGTTTCGCCCTTTGACGTTG |
| UDH-R3 | AAAAGGGAATCTGCAATTCTACAC |
| ZWF1-RT-F | CTACCAAGATCTTCGGTTATGCCC |
| ZWF1-RT-R | GCAAGGCCAGATAGAAGAGACGG |
| PGK1-RT-F | TACGTTGTCTTGGCTTCTCACTTGG |
| PGK1-RT-R | TTGGAAGCCTTGACCTTTTGACC |
将上述带有同源臂的HIS3和PTEF1-miox4- udh-TCYC1的2个整合片段转化BY4741opi1∆菌株，将其整合到酿酒酵母BY4741opi1∆菌株中OPI1基因的启动子上，涂布SD-HIS平板，以组氨酸为标记进行筛选。挑取转化子菌株进行发酵后，通过葡萄糖二酸的产量筛选最优的MIOX4-Udh融合蛋白。
1.3.3 MIOX4-Udh融合蛋白的delta位点整合以Bga-3基因组为模板，通过引物delta1-F/ TADH1-R扩增获得delta1片段；再以MIOX4-LF/ MIOX4-LR为引物扩增PTEF1-miox4片段，以UDH-F4、UDH-F9、UDH-F12和UDH-R为引物扩增获得3个带有不同寡肽连接子的扩增udh-TCYC1-delta2序列，然后通过引物MIOX4-LF和UDH-R将上述2个片段进行融合，获得3个带有不同寡肽连接子的PTEF1-miox4-udh-TCYC1- delta2片段；以pRS316质粒[10]为模板，通过引物URA3-MU-F/URA3-MU-R扩增获得URA3序列。最后将上述3个片段用引物delta1-F和UDH-R3进行融合PCR，获得delta1-URA3- PTEF1-miox4-linker(4, 9, 12)udh-TCYC1-delta2。所有引物序列见表 2。
将上述delta1-URA3-PTEF1-miox4-linker(4, 9, 12) udh-TCYC1-delta2片段转化Bga3-Itr1菌株。将其整合至酿酒酵母Bga3-Itr1菌株的delta位点，涂布SD-URA平板。挑取转化子菌株进行发酵后，通过葡萄糖二酸的产量筛选最优菌株。
1.3.4 ZWF1基因的弱化表达为了弱化表达磷酸戊糖途径中的葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1，通过以下方法将其启动子替换为BBP1基因的启动子：首先以酵母菌CEN.PK2-1C的基因组为模板，以MET-F/ MET-R为引物扩增获得MET筛选标签，然后以BY4741基因组为模板，通过引物PBBP1-F/PBBP1-R扩增获得BBP1基因的启动子PBBP1，通过引物MET-F/PBBP1-R将上述2个片段进行融合，获得MET-PBBP1片段。通过PBBP1-MET-F/ ZWF1-NR引物扩增带有ZWF1启动子同源臂的MET-PBBP1片段，并转化到A3、K4和L3菌株中，提取转化子的基因组，通过引物PBBP1-check-F/ ZWF1-check-R进行PCR检测，正确的转化子通过测序方法进行进一步确认。
1.3.5 酵母基因组提取方法(1) 挑取酵母单个转化子，接种于YPD培养基中，30 ℃培养至饱和。
(2) 将过夜培养的菌体收集到1.5 mL离心管中，10 000 r/min离心1 min收集菌体(约30–50 μL)。
(3) 加入与收集的细胞体积相当的酸性玻璃珠、400 mL STES溶液(0.2 mol/L pH 7.6的Tris-Cl，0.5 mol/L NaCl，0.1% (M/V) SDS，0.01 mol/L EDTA)，400 μL酚/氯仿/异戊醇。
(4) 重复振荡5×30 s，中间把离心管置于冰水上。加入TE缓冲液200 μL，迅速混合后，80 000 r/min离心5 min。
(5) 将上清溶液转移到新的1.5 mL离心管中，加入1/10体积3.0 mol/L的NaAc溶液，2倍体积无水乙醇，混匀，置于–20 ℃大约1 h，10 000 r/min离心10 min，弃上清。
(6) 加入1 000 μL 75%的乙醇洗涤，10 000 r/min离心5 min，弃上清。
(7) 室温干燥DNA 10 min，加入50 μL的TE缓冲液或ddH2O (含RNase，终浓度为20 μg/mL)，55 ℃消化30 min。电泳检测，置于–20 ℃备用。
1.3.6 RT-qPCR检测ZWF1基因的表达量通过热酚法提取酿酒酵母的总RNA：将菌株培养到对数生长期后，8 000 r/min离心1 min收集菌体，并用DEPC水洗一遍。向菌体内加入等量的酸性玻璃珠，并加入400 μL TES溶液(200 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)) 和400 μL水饱和酚溶液，放置振荡器上振荡1 min，65 ℃预热5 min，然后振荡30 s。循环5次。放置在冰上5 min，12 000 r/min、4 ℃离心15 min收集上层水相部分并将其转移到一个新的1.5 mL EP管中，加入400 µL酸酚溶液，12 000 r/min、4 ℃离心15 min收集上层水相，加入400 µL氯仿溶液，以12 000 r/min、4 ℃离心5 min。将上层的水相部分转移到一个新的1.5 mL EP管中，加入40 μL的3 mol/L NaAc溶液和1 mL预冷无水乙醇溶液，12 000 r/min、4 ℃离心10 min。弃掉上清液，用70%乙醇溶清洗一遍，晾干后加入50 µL的DEPC水溶解RNA。
根据CW Biotech提供的HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit中用户操作手册按步骤去除基因组DNA并逆转录合成cDNA。根据CW Biotech提供的UltraSYBR Mixture (lyophilized powder) 中用户操作手册进行qRT-PCR。分别对Bga-3和K4-DZWF1菌株中ZWF1基因和内参基因PGK1进行PCR扩增。数据通过2–ΔΔCt方法进行处理[11]。
1.3.7 酿酒酵母摇瓶和5 L发酵罐发酵培养方法酿酒酵母摇瓶和5 L发酵罐发酵培养方法见参考文献[8]。
1.4 分析方法取发酵液之后通过高效液相色谱(HPLC)[12]检测葡萄糖二酸的浓度，检测方法见参考文献[8]。
2 结果与分析 2.1 肌醇转运蛋白的过量表达有利于葡萄糖二酸的积累酿酒酵母细胞中有2个肌醇转运蛋白，Itr1和Itr2[13]。Itr1对肌醇具有高亲和力，是主要的肌醇转运蛋白，Itr2是一个肌醇低亲和力转运蛋白[14]。为了提高工程菌摄取胞外肌醇的能力，本研究将Itr1的启动子换成组成型启动子PTDH3进行过量表达，以提高肌醇的转运效率。将pHAC181质粒[9]上扩增的LEU2与以BY4741为模板扩增的PTDH3融合获得LEU2-PTDH3 2 951 bp (图 1A)，并转化Bga-3菌株，正确的转化子通过引物PTDH3-CHECK-F2/ITR1-CHECK- R2检测后能够扩增出550 bp片段(图 1B)，获得Bga3-Itr1菌株。以没有替换启动子的Bga-3作为对照，在相同培养条件下进行摇瓶发酵。结果显示，发酵240 h后，过量表达ITR1基因的酿酒酵母菌株培养基中的肌醇浓度较Bga-3降低了10% (图 2A)，被转运到胞内的肌醇增加了0.63 g/L，葡萄糖二酸积累量提高了26%，浓度达到3.79 g/L (图 2B)。菌体的生长情况也较好(图 2C)。这也说明胞外肌醇摄取量的提高有利于葡萄糖二酸的合成。
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| 图 1 在Bga-3工程菌种过量表达肌醇转运蛋白Itr1 Fig. 1 Overexpression of the inositol transporter Itr1 in Bga-3 strain. (A) PCR amplification of LEU2-PTDH3. (B) Detection of the integration of PTDH3. Lane 1 is DL5000 marker. |
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| 图 2 过量表达Itr1对葡萄糖二酸产量的影响 Fig. 2 Effect of overexpression Itr1 on the production of glucaric acid (A), cell growth rate (B), and residual myo-inositol in the culture medium (C). |
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本研究设计了12个可以连接多种蛋白的寡肽连接子将MIOX4和Udh连接进行融合表达(1–12)，同时以无寡肽连接子，即将MIOX4和Udh直接进行融合表达的情况作为对照(0) (图 3A–3B)。扩增HIS3片段(1 445 bp) 和上述13个融合片段PTEF1-miox4-udh-TCYC1电泳结果如图 3C–3D所示。将上述片段整合到BY4741opi1∆缺失株的OPI1基因的启动子上，正确的转化子通过引物MIOX-RT-R/UDH-RT-R检测后能够扩增出525 bp片段(图 3E)。筛选整合成功的转化子与Bga-0菌株(BY474 opi1∆菌株含有游离质粒(pY26-miox4-udh)) 在相同培养条件下进行摇瓶发酵(图 4)，测定整合了不同寡肽连接子连接的MIOX4-Udh融合蛋白对葡萄糖二酸产量的影响。结果显示，通过寡肽连接子GSG(EAAAK)2、(PT)7P、(EA3K)3 (linker4、9、12) 融合表达MIOX4-Udh的菌株与游离质粒表达相比葡萄糖二酸积累量显著提高，其中linker12(EA3K)3连接子的效果最强，其葡萄糖二酸产量达到1.46 g/L，是表达游离质粒菌株Bga-0的4.84倍，较没有连接子连接的MIOX4-Udh的菌株(linker0) 葡萄糖二酸的产量提高近一倍。
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| 图 3 MIOX4-Udh融合蛋白的构建 Fig. 3 Construction of MIOX4-Udh fusion protein. (A) Schematic diagram of miox4 and udh fusion connection with different linkers. (B) Schematic diagram of integrating the MIOX4-Udh fusion protein to the opi1 promoter of opi1Δ. (C) PCR amplification of HIS3 from Bga-3. Lane 1 is DL5000 marker, lane 2 is HIS3. (D) PCR amplification of PTEF1-miox4-udh-TCYC1 from Bga-3. Lane 0–12 is MIOX4-Udh fusion protein. (E) Detection of the integration of MIOX4-Udh fusion protein with different linkers. The DNA molecular weight standards is DL5000 marker. |
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| 图 4 MIOX4-Udh融合蛋白的筛选结果 Fig. 4 Screening of MIOX4-Udh fusion protein. (A) Glucaric acid production. (B) Cell growth rate. |
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Delta序列位于酿酒酵母的逆转录转座子Ty上的长末端，是一类高重复率的DNA序列，酿酒酵母染色体DNA中至少含有100个delta重复序列[15]。目前，可将外源基因插入酿酒酵母基因组的delta序列上使其稳定表达，这种方法相对比较成熟且重组效率较高。本研究基于同源重组原理，将前期筛选到的3个连接子GSG(EAAAK)2、(PT)7P、(EA3K)3(linker4、9、12) 连接的活性较高的MIOX4-Udh融合蛋白整合到过量表达ITR1 Bga3-Itr1菌株的delta位点进行高效表达(图 5)，以提高葡萄糖二酸的产量。酿酒酵母中的delta位点较多，拷贝数有差异，转化整合模块时整合位置是随机的[16]。随机挑取约300个转化子在试管培养条件下发酵后，最终获得葡萄糖二酸产量较高的3株菌株，分别命名为A3、K4、L3 (图 6A)。
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| 图 5 酿酒酵母中葡萄糖二酸高效生物合成途径的构建策略 Fig. 5 Construction strategies for over-producing glucaric acid in S. cerevisiae. |
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| 图 6 表达MIOX4-Udh融合蛋白的酿酒酵母重组菌的筛选及摇瓶发酵结果 Fig. 6 Screening and shake flask fermentation of the recombinant S. cerevisiae strains that express the MIOX4-Udh fusion protein. (A) Screening result of the recombinant strains. (B) Glucaric acid production. (C) Cell growth rate. |
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以没有用linker连接的Bga-3为对照菌株，将上述筛选到的产葡萄糖二酸产量较高的3株菌株A3、K4、L3进行补料分批发酵，培养基为添加60 mmol/L肌醇的YPD培养基，分别在发酵24 h和48 h时添加5 g/L葡萄糖，取发酵后的样品通过HPLC检测葡萄糖二酸的产量，最终发酵结果如图 6B和6C所示。实验结果显示，A3、K4和L3菌株的生长情况较对照菌株Bga-3没有明显的差异。K4菌株发酵后的葡萄糖二酸产量最高，在发酵240 h时葡萄糖二酸的产量达4.3 g/L，较对照菌株Bga-3的葡萄糖二酸产量提高了约40%。
2.4 弱化葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1高产葡萄糖二酸为了进一步提高葡萄糖二酸的产量，我们将上述筛选到的A3、K4、L3菌株的编码磷酸戊糖途径中葡萄糖6-磷酸脱氢酶的ZWF1基因的启动子替换为BBP1基因的启动子进行弱化表达。把融合片段MET-PBBP1 (2 900 bp) (图 7A) 整合到A3、K4、L3菌株的基因组上，在SD-MET的平板上进行筛选。提取转化子的基因组进行PCR检测(图 7B，lane 2–4)，获得重组菌A3-DZWF1、K4-DZWF1和L3-DZWF1。
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| 图 7 在A3、K4和L3菌株中弱化表达ZWF1基因的验证结果 Fig. 7 Attenuated expression of ZWF1 gene in selected A3, K4 and L3 strains. (A) PCR amplification result of MET-PBBP1. (B) Detection results of the integration of PBBP1. Lane 1 is DL5000 marker. Lane 2–4 is the detection of A3-DZWF1, K4-DZWF1, and L3-DZWF1, respectively. |
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以Bga-3为对照菌株，上述3个重组菌在摇瓶发酵时，K4-DZWF1菌株在发酵240 h时葡萄糖二酸的产量最高，可以达到为5.5 g/L (图 8)，较K4菌株提高了27.9%，较对照菌株Bga-3产量提高了约60%。qRT-PCR检测结果显示，K4-DZWF1菌株中ZWF1基因的表达量较K4菌株降低了近3倍(图 9)。
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| 图 8 弱化表达ZWF1基因的酿酒酵母重组菌的摇瓶发酵结果 Fig. 8 Shake flask fermentation of the recombinant S. cerevisiae strains with weakened expression of ZWF1 gene. (A) Glucaric acid production. (B) Cell growth rate. |
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| 图 9 ZWF1的相对转录水平检测结果 Fig. 9 Relative transcription expression levels of ZWF1. |
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将K4-DZWF1菌株在5 L发酵罐中进行分批补料发酵。在发酵过程中，肌醇浓度添加量为60 mmol/L。当菌株生长进入对数期后，分别在24 h进行第一次补料，浓度为5 g/L葡萄糖，发酵48 h再一次补加5 g/L葡萄糖。结果显示，在发酵264 h时，葡萄糖二酸产量最高，达到10.85 g/L，较前期研究报道的6.0 g/L[8]提高了80% (图 10)。
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| 图 10 酿酒酵母重组菌5 L发酵罐分批发酵结果 Fig. 10 Fed-batch fermentation of the recombinant S. cerevisiae strains in a 5 L fermenter. (A) Glucaric acid production and cell growth rate. (B) Glucose consumption and residudal myo-inositol. |
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酿酒酵母具有耐受低温、可低pH发酵、没有噬菌体感染、适合大规模发酵、易分离和高抗逆性等特点，且可以作为单细胞蛋白用于饲料、食品等行业。因而酿酒酵母已经广泛用于产有机酸的相关研究[17]。Prather课题组将外源miox4和udh基因引入酿酒酵母细胞进行异源表达，实现了在酿酒酵母细胞中利用葡萄糖和外加肌醇产葡萄糖二酸[18]。
肌醇作为一种许多生物生长的必需营养物，同时也是磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)合成的前体，PI在细胞信号转导和细胞内结构方面亦具有重要作用[19]。人体和一些微生物主要通过2种途径获得肌醇。一种是通过肌醇转运蛋白将肌醇从细胞外转运到细胞内，另一种是细胞通过两个关键酶的催化自身合成肌醇[20]。酿酒酵母细胞有肌醇合成途径，可以通过Ino1 (肌醇-3-磷酸合成酶) 和Inm1/2 (肌醇单磷酸酶) 将葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇[20-21]，其中INO1基因的表达受肌醇浓度的负调控[22]，而INM1基因受肌醇正调控[23-24]。在葡萄糖二酸合成过程中，肌醇是肌醇加氧酶MIOX4的底物，由于MIOX4的不稳定性，细胞内高浓度的肌醇有助于维持其稳定性。本研究发现，通过将酿酒酵母自身的肌醇转运蛋白编码基因ITR1的启动子替换为组成型启动子PTDH3进行过量表达后，细胞摄取胞外肌醇的能力有所提高，从而使肌醇更多地流向葡萄糖二酸合成途径。在YPD培养基中进行补料分批发酵时，肌醇的利用率和葡萄糖二酸的产量都有明显的提高。
有研究发现，在该代谢途径中MIOX4表达水平远低于Ino1和Udh，由于MIOX4的不稳定性，在稳定期时即使在没有葡萄糖二酸的情况下，MIOX4的活力也会迅速下降[1]。因此，MIOX4的稳定性是葡萄糖二酸合成途径的限速步骤。本研究运用寡肽连接子将肌醇加氧酶MIOX4和糖醛酸脱氢酶Udh进行融合表达，有效地提高了葡萄糖二酸合成途径的效率和葡萄糖二酸的产量。此外，途径基因的拷贝数及表达的稳定性也会影响酵母菌株葡萄糖二酸的积累。本研究选择酵母基因组中的delta序列作为整合位点进行外源基因的表达，获得多拷贝delta位点整合型的表达菌株，从而增加了葡萄糖二酸合成途径相关基因的拷贝数。
葡萄糖-6-磷酸是合成肌醇的前体，本研究通过弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1，使葡萄糖二酸的产量在摇瓶发酵条件下提高到5.5 g/L，较相同发酵条件下的出发菌株Bga-3提高了60%；在5 L发酵罐中，该菌株的葡萄糖二酸最高产量达10.85 g/L，为目前报道的最高值(表 3)。在后续的实验中，可以从以下两个方面继续展开研究。
| Hosts | Pathways or genes | Production (g/L) | Carbon sources | References |
| P. pastoris GS115 | mMIOX, udh | 6.61 | glucose, myo-inositol | [26] |
| E. coli MG1655 (DE3) | INO1, SUMO-mMIOX, udh | 4.85 | myo-inositol | [6] |
| S. cerevisiae CEN.PK2-1 | mMIOX, udh | 1.60 | glucose, myo-inositol | [18] |
| E. coli cell-free lysates | mMIOX, udh | 7.30 | sucrose | [27] |
| E. coli cell-free lysates | udh | 9.60 | glucuronic acid | [28] |
| S. cerevisiae BY4471 | AtMIOX, udh | 6.00 | glucose, myo-inositol | [8] |
| S. cerevisiae BY4471 | AtMIOX, udh | 10.85 | glucose, myo-inositol | This study |
(1) 葡萄糖二酸的前体物质肌醇有内源合成途径和外源转运途径，后续研究可以削弱与肌醇竞争葡萄糖的其他途径以增加内源肌醇的积累，同时通过增加外源肌醇添加量[25]来提高葡萄糖二酸的产量。
(2) 在发酵过程中，培养基成分差异会影响菌体的生长和葡萄糖二酸的产量，后续可以通过对肌醇浓度、补料时间浓度进行优化来提高葡萄糖二酸的生产能力。
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