2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 程峰, 魏澜, 王成娇, 薛亚平, 郑裕国
- CHENG Feng, WEI Lan, WANG Chengjiao, XUE Yaping, ZHENG Yuguo
- 甲酸脱氢酶及其在手性生物制造中的应用
- Formate dehydrogenase and its application in biomanufacturing of chiral chemicals
- 生物工程学报, 2022, 38(2): 632-649
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(2): 632-649
- 10.13345/j.cjb.210278
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文章历史
- Received: April 7, 2021
- Accepted: June 24, 2021
- Published: July 15, 2021
引用本文
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2. 浙江工业大学 手性生物制造国家地方联合工程研究中心, 浙江 杭州 310014
2. The National and Local Joint Engineering Research Center for Biomanufacturing of Chiral Chemicals, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang, China
手性化学品被广泛应用于医药、农业、食品、材料等领域，在国计民生中占据极其重要的地位[1]。绿色生物制造手性化学品(手性生物制造)通过工业生物技术实现绿色清洁的生产工艺，是手性化合物制造产业转型升级的“绿色动力”[2]。氧化还原酶大多依赖辅酶NADPH或NADH进行催化反应，是手性化合物合成的重要生物催化剂[3-4]，然而辅酶会随着产物的生成而消耗，同时NAD(P)H的高成本阻碍了其大规模生产[5-6]。因此可以在反应系统中加入第二种氧化还原酶，以牺牲廉价的底物回收辅因子，构建一个高效、低成本的辅因子再生体系[7-8]。在绿色生物制造中，辅酶再生体系已被广泛应用于生产手性氨基酸、手性羧酸、手性醇、手性胺等多类手性化合物[9-11]。
目前，已被用于辅酶再生体系的烟酰胺类氧化还原酶有葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase, GDH)[12]、甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH)[13]、醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)[14]等。其中，FDH催化甲酸盐生成CO2，同时将NAD(P)+还原为NAD(P)H[7]，其构筑的氧化还原生物合成体系具有如下优势[15]：(1) 甲酸盐价格低廉，工业上能够有效控制成本；(2) 甲酸盐是一种小分子，容易透过细胞膜进入细胞，提高了辅酶再生的效率；(3) 副产物仅为CO2，易被排出反应体系，保证了产品纯度，并且CO2是惰性的，不会抑制生产酶的活性；(4) FDH的最适pH范围较广，一般在6.0–9.0之间，扩大了其操作范围。因此，FDH在绿色生物制造领域具有重要的应用价值和工业化前景。
但是，目前所挖掘的大部分FDH活力较低(≤10 U/mg)、热稳定性较差以及仅对辅因子NAD+具有依赖性[15-16]。因此，研究人员正通过基因工程等手段尝试解决这些问题，为生物制造提供催化效率高、稳定性强的辅酶再生体系。本文综述了FDH在酶学性质测定和分子改造方面的研究进展以及FDH辅酶再生体系在绿色生物制造手性化合物中的应用。
1 甲酸脱氢酶简介甲酸脱氢酶可以分为2类[17]：第一类酶蛋白中含有金属离子，如活性中心存在钨、铁、硫、钼、硒等，这类FDH在蛋白结构、分子量及稳定性等方面有很大差异；第二类是NAD+依赖型FDH (EC 1.17.1.9) 和NADP+依赖型FDH (EC 1.17.1.10)，这类酶不含金属离子，可以氧化甲酸盐为CO2，同时将NAD(P)+还原为NAD(P)H (图 1)，是最主要的一类FDH。目前，FDH已经在多种生物中被发现，如细菌[18]、真菌[19-20]等。
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| 图 1 FDH辅酶再生系统 Fig. 1 FDH cofactor regeneration system. |
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通过对数据库中已有的甲酸脱氢酶序列进行比对发现，FDH若为同一种属，同源性至少为80%；若不属于同一种属，其同源性也在50%–55%之间，可见FDH是一种序列相对保守的酶[15]。大部分FDH中半胱氨酸残基的数量在每亚基2–9个之间。天然FDH稳定性较差主要是由半胱氨酸残基的化学修饰或氧化引起的[15]，已有研究证明，半胱氨酸残基的定点突变能够增强FDH对反应及其反应化合物的稳定性[21-22]。
一般来说，FDH是由2个相同亚基组成的二聚体，每个亚基包含2个结构域[23]：辅酶结合结构域和底物结合结构域，每个结构域都由交替的α螺旋和β折叠组成，这种结构被称为Rossmann折叠。NAD+依赖型FDH有一个重要特征，它的辅酶结合结构域中存在保守的GxGxxGx17-18D (E)序列(x为任何残基)，属于经典的Rossmann折叠(图 2)[23-24]。带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸残基是辅因子识别的决定因素，它与NAD+腺苷核糖的2′-和3′-羟基相互作用，并排斥NADP+的带负电荷的磷酸基团[25]。基于近些年的文献报道和NCBI数据库，本文在表 1中列出了FDH的不同来源及已解析的蛋白质三维结构PDB号。
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| 图 2 NAD+依赖型FDH结构图 Fig. 2 Diagram of the structure of NAD+ dependent FDH structure diagram. |
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| Domain | Organisms | PDB ID | References |
| Bacteria | Pseudomonas sp. 101 | 2GO1, 2NAC, 6JUJ, 6JUK, 2GUG | [26] |
| Mycobacterium vaccae N10 | – | [18] | |
| Moraxella sp. C2 | 2GSD, 3FN4 | [18] | |
| Burkholderia stabilis 15516 | – | [27] | |
| Granulicella mallensis MP5ACTX8 | 6T8C, 6T9X | [28] | |
| Lactobacillus buchneri NRRL B-30929 | – | [29] | |
| Fungi | Candida boidinii | 5DN9, 2J6I, 2FSS, 6D4B, 6D4C | [30] |
| Candida methylica | – | [20] | |
| Pichia pastoris | – | [31] | |
| Pichia pestrie NRRL-Y-7556 | – | [32] | |
| Aspergillus nidulans | – | [33] | |
| Neurospora crassa | – | [19] |
这类FDH是催化甲酸盐转化为CO2的金属酶，然而这一过程的反应机理尚不十分清楚。Dong等[34]提出了5种假定的机制，结合量子力学和分子动力学(QM/MM) 优化，获得了粗略的催化模型。为了更精确详细描述催化过程中的能量变化，他们对催化口袋大区域(1 121个原子) 进行了QM计算，发现可能的精细机制是：Mo进入FDH的氧化活性位点时，底物甲酸盐并不直接与Mo作用，而是在第二个配体附近。含硫配体从底物中结合氢离子，使Mo(Ⅳ)-SH和硫代碳酸盐离子连接到Cys196位点。当活性部位被氧化回到静息(MoⅥ) 状态时，释放CO2[34]。
1.2.2 不含金属离子的甲酸脱氢酶NAD+依赖型FDH由2个相同亚基组成，不含金属离子，对甲酸盐和NAD+具有高度依赖性。当甲酸盐进入FDH活性口袋时，带负电荷的COOH–与284位精氨酸的侧链相互作用，形成盐桥，并与Asn146的侧链形成氢键。甲酸盐的氢离子转移到NAD+的吡啶环的C4原子上，同时将NAD+还原为NADH，并释放CO2[35-36] (图 3)。
2 FDH的分子改造及酶学性质研究 2.1 分子改造提高FDH的催化效率
FDH作为辅酶再生系统的研究热点，与GDH和ADH等酶相比存在酶活相对较差等应用瓶颈。因此，寻找催化效率高的FDH成为目前研究的重点。
2.1.1 提高NAD+依赖型FDH的催化效率为了获取具有更高NAD+活性的FDH，厦门大学方柏山教授课题组[37]将博伊丁假丝酵母菌(Candida boidinii) FDH (CboFDH) 与其他FDH的空间结构进行比对，基于结构分析和理性设计对靠近酶活性位点的V120和靠近辅酶结合区的N187残基进行定点突变，得到了2个单突变体(V120S、N187D) 和1个双突变体(V120S/N187D)。其中CboFDH V120S/N187D突变体增强了对NAD+的亲和力(表 2)，在187位引入带负电荷的天冬氨酸，使其更易与带正电荷的辅酶结合，对辅酶的催化效率提高了50%。
| Enzymes | NAD+ | Formate | References | |||||
| Km (mmol/L) | kcat (s–1) | kcat/Km (L/(mmol·s)) | Km (mmol/L) | kcat (s–1) | kcat/Km (L/(mmol·s)) | |||
| CboFDH WT | 3.400±0.150 | 22.300±0.550 | 6.559 | 3.630±0.100 | 1.530±0.035 | 0.423 | [37] | |
| CboFDH V120S | 8.810±0.180 | 40.630±12.100 | 4.612 | 7.900±0.320 | 5.340±0.210 | 0.676 | [37] | |
| CboFDH N187D | 3.800±0.220 | 28.990±0.056 | 7.629 | 6.700±0.210 | 3.290±0.090 | 0.491 | [37] | |
| CboFDH V120S/N187D | 2.020±0.110 | 18.680±0.390 | 9.248 | 2.500±0.150 | 0.700±0.010 | 0.280 | [37] | |
| PseFDH WT | 0.060±0.005 | 7.300±0.200 | 121.667 | 6.500±0.200 | – | – | [38] | |
| PseFDH A198G | 0.035±0.002 | 7.300±0.100 | 208.571 | 7.500±0.200 | – | – | [38] | |
| MorFDH WT | 0.080±0.007 | 7.300±0.100 | 91.250 | 7.700±0.300 | – | – | [38] | |
| MorFDH A198G | 0.045±0.003 | 7.300±0.300 | 162.222 | 8.000±0.500 | – | – | [38] | |
| BstFDH WT | 1.430 | 1.660±0.100 | 1.161 | ≥150 | – | – | [41] | |
| CmeFDH WT | 0.055 | 1.400 | 25.455 | – | – | – | [38] | |
| GraFDH WT | 6.500 | 5.770 | 0.888 | 80.000 | – | – | [28] | |
| SceFDH WT | 0.036 | 6.500±0.400 | 180.555 | 5.500±0.300 | – | – | [35] | |
Alekseeva等[38]将A198G取代引入假单胞菌Pseudomonas sp. 101 FDH中，减小了198位点与辅酶之间的构象张力，突变体PseFDH A198G的KmNAD+为(0.035±0.002) mmol/L，与野生型相比下降了42% (PseFDH WT的KmNAD+为(0.060±0.005) mmol/L)，但几乎没有改变其对甲酸盐的亲和力(表 2)。
2.1.2 提高NADP+依赖型FDH的催化效率还原型烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADPH) 是所有真核生物、细菌和古菌的基本电子供体[39]，许多工业化物质的生产过程往往涉及NADPH依赖型的酶，这也奠定了NADPH在工业生物合成中广泛应用的基础[40]。
来自洋葱伯克氏霍尔德菌(Burkholderia stabilis) 15516的甲酸脱氢酶(BstFDH) 是首个报道的天然NADP+依赖型FDH，与其他利用NADP+作为氢受体的FDH相比，它对底物和辅因子的亲和力都较低，应用较为困难。华东理工大学许建和、郑高伟教授课题组[27]为提高FDH对NADP+和HCOO−的亲和力，通过序列比对和结构分析筛选有义突变位点(图 4)，得到突变体BstFDH G146M/A287G，使KmNADP+降低至0.09 mmol/L (BstFDH WT为0.19 mmol/L)，同时KmHCOO–也由(51.8±4.4) mmol/L降低为(31.7±3.7) mmol/L，相应地kcat/KmNADP+提高为野生型的1.6倍(表 3)。
| Enzymes | NADP+ | Formate | References | |||||
| Km (mmol/L) | kcat(s–1) | kcat/Km (L/(mmol·s)) | Km(mmol/L) | kcat(s–1) | kcat/Km(L/(mmol·s)) | |||
| BstFDH WT | 0.190±0.010 | 10.500±0.200 | 55.263 | 51.800±4.4 | 10.400±0.200 | 0.201 | [27] | |
| BstFDH G146M/A287G | 0.090 | 8.820±0.030 | 98.000 | 31.700±3.7 | 8.710±0.220 | 0.275 | [27] | |
| LbFDH WT | 0.120 | 3.510 | 29.250 | 49.800 | 2.500 | 0.050 | [29] | |
| GraFDH WT | 0.850 | 3.960 | 4.659 | 200.000 | [28] | |||
| LjFDH WT | 29.500 | 0.005 | 0.001 | 6.100 | 1.300 | 0.213 | [42] | |
| CboFDH D195Q/Y196R/Q197N |
0.029 | 0.790 | 27.241 | – | – | – | [30] | |
| MycFDH 3M (C145S/D221Q/C255V) |
0.920±0.100 | 7.890±1.260 | 8.576 | 113.000 | – | – | [43] | |
| MycFDH 4M (C145S/A198G/D221Q/C255V) | 0.147±0.020 | 3.080±0.100 | 20.952 | 98.000±13.000 | – | – | [43] | |
| PseFDH V9 (A198Q/D221Q/C255A/H379K/S380V) | 0.026±0.001 | 3.690±0.030 | 141.923 | 24.000±2.400 | 3.600±0.100 | 0.150 | [26] | |
根据近些年文献报道，本文将不同来源的NAD+依赖型FDH的野生型及突变体的动力学参数进行总结，如表 2所示，目前FDH的KmNAD+在(0.035–8.810) mmol/L之间，kcatNAD+在(1.40–40.63) s–1之间。其中，来源为Pseudomonas sp. 101的野生型FDH对NAD+的催化效率最高，其突变体PseFDH A198G在目前已报道的NAD+依赖型FDH中催化效率最高。
本文进一步对NADP+依赖型FDH的野生型和突变体的动力学参数进行总结(表 3)，目前FDH的KmNADP+在(0.026–29.500) mmol/L之间，kcatNADP+在(0.005–8.820) s–1之间。野生型FDH中对NADP+亲和力最高的是布氏乳杆菌LbFDH，其KmNADP+为0.12 mmol/L，催化效率为29.25 L/(mmol·s)。PseFDH V9为目前对NADP+亲和力最强、催化效率最高的FDH突变体。
2.2 分子改造改善FDH的稳定性在反应过程中，酶活性的丧失通常与催化过程的化学修饰和热变性有关。半胱氨酸残基是FDH中最关键的残基，因为在几乎所有的FDH中，半胱氨酸残基在酶活性中起着重要的作用。FDH中的半胱氨酸残基的存在能够使巯基被氧化[44]，导致FDH失活。大多数情况下，低于40 ℃的变性也是由半胱氨酸残基的化学修饰或氧化引起的[43]。
2.2.1 C145和C255位点对PseFDH和MycFDH稳定性的影响PseFDH和来自母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae) N10的MycFDH只有2个氨基酸残基不同，同源性达99.5%。对PseFDH的结构进行分析，每个亚基上有7个半胱氨酸残基，分别在5、145、182、248、255、288和354位(图 5)。Tishkov等[45]发现PseFDH突变体C255S和C255M的化学稳定性与野生型相比提高了2个数量级，然而这两种突变影响了FDH与辅酶NAD+的结合。Savin等[44]通过研究发现，PseFDH野生型对H2O2不稳定，用Ala替代Cys255使失活速率常数降低了50%，同时提高了该酶的热稳定性；进一步引入C145S位点的突变，形成的PseFDH C145S/C255A突变体对H2O2稳定性最高，其失活速率常数降低了95%。Hoelsch等[43]对MycFDH也进行了类似突变，在MycFDH A198G/D221Q的基础上对2个半胱氨酸残基进行定点突变(C145S/C255V)，不仅提高了其对4-氯乙酰乙酸乙酯(ethyl 4-chloroacetoacetate, ECAA) 的耐受性，而且催化效率也提高为原来的6倍。该突变体在30 ℃、pH 7.0的条件下，KmNADP+为(0.147±0.02) mmol/L。
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| 图 5 PseFDH中半胱氨酸残基的位点示意图 Fig. 5 Structure diagram of cysteine residues in PseFDH. |
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CboFDH的每个亚基包含2个半胱氨酸残基，即Cys23和Cys262，其中的巯基容易被氧化。为了得到稳定性更高的CboFDH，Slusarczyk等[21]构建了CboFDH C23S和CboFDH C23S/C262A突变体，在Cu(Ⅱ) 存在的情况下这两个突变体的酶活都没有受到影响，反应的最适温度和动力学参数也没有明显改变，而野生型酶活下降至15%–30%左右。
2.3 分子改造转变FDH的辅酶偏好性尽管NAD+和NADP+的结构相似，但大部分FDH仅对上述2种辅酶其中的1种表现出显著的偏好性[46]。目前，大约80%的野生型FDH是典型的NAD+依赖型，仅少数为NADP+依赖型[28-29]，这也阻碍了FDH在NADPH再生系统中的应用，因此改变FDH的辅酶偏好性具有极其重要的意义。
近年来，很多文献报道了反转FDH辅酶偏好性的实例，但改造后的FDH催化效率以及对底物的亲和力仍不理想[38, 47]。有研究认为，理性设计或定向进化几乎无法产生kcat更高的NADP+依赖型FDH突变体[5]，因此获得高效的NADP+依赖型FDH需要从高活力NAD+依赖型FDH出发改造其辅酶偏好性。
2.3.1 转变CboFDH的辅酶偏好性CboFDH的辅酶偏好性已被广泛研究，其单突变体D195S、双突变体D195S/Y196H和三突变体D195S/Y196H/K356T对NAD+的酶活(野生型为2.2 U/mg) 分别为1.5、1.3、1.3 U/mg，它们对NADP+的酶活从0.001 3分别增加到0.083、0.190、0.360 U/mg[15]。
Wu等[30]通过结构和功能分析，推测CboFDH的Asp195、Tyr196和Gln197残基在识别辅因子方面发挥关键作用(图 6)。因此同时对CboFDH的Asp195和Tyr196残基进行位点饱和突变，经筛选得到两个对NADP+偏好性提高的突变体D195Q/Y196R和D195S/Y196P，其动力学参数如表 4所示。进一步，在D195Q/Y196R的基础上引入Q197位点的突变，以天冬酰胺代替197位的谷氨酰胺，该突变体对NADP+的Km下降到0.029 mmol/L，是CboFDH D195Q/Y196R的一半。
| Enzymes | NADP+ | NAD+ | References | |||||
| Km(mmol/L) | kcat(s–1) | kcat/Km (L/(mmol·s)) | Km(mmol/L) | kcat(s–1) | kcat/Km(L/(mmol·s)) | |||
| CboFDH WT | – | – | – | 0.051±0.006 | 3.400±0.070 | 66.667 | [30] | |
| CboFDH D195Q/Y196H | 1.700±0.080 | 0.440±0.030 | 0.259 | 1.800±0.090 | 0.490±0.030 | 0.272 | [51] | |
| CboFDH D195Q/Y196R | 0.050±0.010 | 0.570±0.040 | 11.400 | 0.084±0.009 | 0.450±0.010 | 5.357 | [30] | |
| CboFDH D195S/Y196P | 0.110±0.030 | 0.310±0.030 | 2.818 | 0.196±0.03 | 3.140±0.130 | 16.020 | [30] | |
| CboFDH D195Q/Y196R/Q197N | 0.029±0.005 | 0.790±0.020 | 27.241 | 0.360±0.03 | 0.620±0.030 | 1.722 | [30] | |
| PseFDH WT | 100.000 | 1.300±0.100 | 0.013 | 0.060±0.005 | 7.300±0.200 | 121.667 | [38] | |
| PseFDH D221S | 0.190±0.030 | 1.700±0.200 | 8.947 | 0.710±0.045 | 5.000±0.300 | 7.042 | [38] | |
| PseFDH A198G/D221S | 0.280±0.025 | 1.800±0.200 | 6.429 | 0.540±0.042 | 5.000±0.200 | 9.259 | [38] | |
| PseFDH A198G/D221Q | 0.067±0.009 | 3.000±0.100 | 44.776 | 1.300±0.400 | 1.200±0.100 | 0.923 | [26] | |
| PseFDH A198G/D221Q/C255A | 0.120±0.020 | 2.00±0.100 | 16.667 | 4.600±0.700 | 1.420±0.080 | 0.309 | [26] | |
| PseFDH A198G/D221Q/C255A/S380V | 0.057±0.004 | 2.090±0.050 | 36.667 | 7.800±1.400 | 0.760±0.070 | 0.097 | [26] | |
| PseFDH V9 (A198Q/D221Q/C255A/H379K/S380V) |
0.026±0.001 | 3.690±0.030 | 141.923 | 5.400±0.700 | 1.500±0.100 | 0.278 | [26] | |
| MycFDH WT | ＞40.000 | – | – | – | – | – | [43] | |
| MycFDH 3M (C145S/D221Q/C255V) |
0.920±0.100 | 7.890±1.260 | 8.576 | 1.090±0.040 | 8.220±0.100 | 7.541 | [43] | |
| MycFDH 4M (C145S/A198G/D221Q/C255V) |
0.147±0.020 | 3.080±0.100 | 20.952 | 4.100±0.170 | 5.180±0.090 | 1.263 | [43] | |
| CmeFDH WT | – | – | < 10−6 | 0.620±0.300 | 0.200±0.100 | 0.323 | [16] | |
| CmeFDH 195S | 5.00±1.200 | 0.040±0.090 | 0.008 | 1.100±0.500 | 0.220±0.100 | 0.200 | [16] | |
| CmeFDH D195S/Q197T | 4.600±3.000 | 0.260±0.100 | 0.056 | 0.220±0.030 | 0.200±0.010 | 0.909 | [16] | |
| CmeFDH D195S/Y196L | 2.000±0.600 | 0.100±0.020 | 0.050 | 0.700±0.200 | 0.200±0.100 | 0.286 | [16] | |
2006年，Tishkov等[48]报道了辅酶特异性由NAD+转变为NADP+的突变体PseFDH T5M8，它在NADP+条件下的酶活是NAD+的3.5倍，被用于合成手性醇和内酯[49-50]。野生型PseFDH在pH 6.0–9.0之间时KmNAD+不变；而该突变体T5M8只有在pH值为6.0–7.0才能与辅酶结合，pH值在8.0时，其KmNADP+增加了10倍以上[48]。为了解决这个问题，该实验室创建了第二代和第三代突变体PseFDH T5M9和PseFDH T5M10，将其与NADP+结合的最适pH扩大至6.0–9.0和6.0–10.0。
Alekseeva等[38]发现D221S可以使PseFDH对NAD+的亲和力降低，并增加其对NADP+的亲和力(KmNADP+为0.19 mmol/L)，如果同时引入突变A198G则可以提高对NADP+的催化效率(表 4)。近期，Calzadiaz-Ramirez等[26]通过同时突变多个氨基酸残基构建了一个 > 106的突变体文库，通过筛选得到一系列FDH突变体，这些突变体都表现出对NADP+的高亲和力，KmNADP+值在0.026–0.130 mmol/L之间(表 4)。PseFDH V9在这些突变体中动力学参数最佳，其KmNADP+为0.026 mmol/L，kcat/KmNADP+为141.923 L/(mmol·s) (PseFDH WT的kcat/KmNAD+为121.667 L/(mmol·s))，同时该突变体对甲酸盐的亲和力和催化效率也有所提升。如图 7所示，该突变体的5个位点均在辅酶附近，A198位被甘氨酸取代，为辅因子NADP+提供了更多空间；D221突变为谷氨酰胺消除了天冬氨酸与磷酸基团的静电排斥作用；H379被赖氨酸取代，与NADP+的2′-磷酸基团建立了盐桥；C255A突变位于辅因子周围，丙氨酸取代体积较大的半胱氨酸为这个区域提供了更多空间；S380V突变引入了脂肪族侧链，提高了结合口袋区域的疏水性。该突变体不仅改变了辅酶偏好性而且保留了野生型PseFDH的高催化效率，成为目前动力学参数最佳的NADP+依赖型FDH。
Hoelsch等[43]为得到催化效率高的NADP+依赖型的FDH，利用基因工程方法对MycFDH进行改造，辅酶附近的关键残基如图 8所示。得到的MycFDH 3M是当时活力最高的NADP+ (10.25 U/mg) 依赖型FDH，但KmNADP+比MycFDH 4M高了一个数量级(表 4)。MycFDH 4M在30 ℃、pH为7.0的条件下Vmax为4.00 U/mg，KmNADP+降低至0.147 mmol/L (MycFDH WT为40 mmol/L)，对NADP+催化效率显著提高。实验结果表明，MycFDH 3M对NAD+和NADP+的动力学参数几乎相同，是双依赖型突变体。当反应体系需要NADH和NADPH同时再生时，MycFDH 3M将成为一种更有效的催化剂。
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| 图 8 MycFDH、辅酶及关键氨基酸残基的结构示意图 Fig. 8 Structure diagram of MycFDH with coenzyme and key amino residues. |
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Gul-Karaguler等[47]曾报道过一种来源于甲基假丝酵母菌(Candida methylica) 的CmeFDH的单突变体CmeFDH D195S，与野生型有相似的KmNAD+，该突变体虽然能够催化NADP+进行反应，但突变体对NAD+的催化效率(kcat/Km)仍比NADP+高40倍。
Özgün等[16]采用了理性设计和定向进化相结合的定点饱和突变的方法，将NAD+依赖型CmeFDH的辅酶特异性改变为NADP+。在CmeFDH辅酶结合域的195、196、197位点进行了两轮诱变和筛选，得到的CmeFDH D195S/Q197T突变体对NAD+的催化效率较野生型提高了80%，同时对NADP+的催化效率提高为原来的5.6×104倍；CmeFDH D195S/Y196L突变体对NADP+的催化效率提高为原来的5×104倍(表 4)。
3 FDH在手性生物制造中的应用 3.1 FDH在手性氨基酸中的应用早在19世纪末期，生物工程专家已构建了甲酸脱氢酶/亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase，LeuDH) 的吨级酶生物反应器[52]。近年来，基于FDH的辅酶再生系统在手性化合物合成中得到了广泛应用。例如，Liu等[53]报道了在FDH辅酶再生系统辅助下LeuDH催化1.5 mol/L三甲基丙酮酸转化为L-叔亮氨酸的路线(图 9)，其6 h转化率为99%，时空产率为786 g/(L·d)，产物e.e.值＞99%。
L-2-氨基丁酸作为抗惊厥药物和抗结核药物的前体，是化学和制药工业的重要中间体。在亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸的反应中(图 10)，笔者课题组[54]构建了亮氨酸脱氢酶/甲酸脱氢酶共表达菌株，在不添加辅酶的情况下，180 g/L的L-苏氨酸在反应8 h后底物转化率达到99%，产物L-2-氨基丁酸的时空产率为19.3 g/(L·h)，e.e.值＞99.5%。
L-草铵膦是大品种手性农药，目前市售的外消旋草铵膦中只有L构型具有除草效果，D构型不仅没有除草效果还会对环境造成污染。笔者课题组以谷氨酸脱氢酶(glufosinate dehydrogenase，GfDH) 为催化剂，不对称胺化2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸(2-oxo-4-[(hydroxy)(-methyl) phosphinyl]butyric acid，PPO) 生成L-草铵膦[55-56]，构建了甲酸脱氢酶(LbFDH) 胞内辅酶再生体系(图 11)，转化率为99%，获得的L-草铵膦e.e.值> 99%[55]。
江南大学聂尧教授课题组[57]利用D-氨基酸脱氢酶(D-amino acid dehydrogenase，D-AADH) 与甲酸脱氢酶(BstFDH) 构建了氧化-还原生物合成体系(图 12)，80 mmol/L的L-苯丙氨酸反应6 h后加胺还原为D-苯丙氨酸，转化率接近100%，产物得率 > 91%，e.e.值> 99%。此外，该体系也能催化多种天然或非天然的L-氨基酸合成相应的D-氨基酸，包括L-高苯丙氨酸、2-氯-L-苯丙氨酸、3-氯-L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-正缬氨酸和L-谷氨酸等，大部分产物的e.e.值都大于99%。
中国科学院天津工业生物技术研究所朱敦明、吴洽庆教授课题组[58]构建了L-苏氨酸裂解酶(L-threonine ammonialyase，L-TAL)、D-氨基酸脱氢酶与甲酸脱氢酶多酶催化合成D-2-氨基丁酸的路线(图 13)，200 mmol/L的L-苏氨酸反应24 h，转化为D-2-氨基丁酸的产率 > 90%，e.e.值> 99%。
3.2 FDH在手性羟酸中的应用
江南大学刘立明教授课题组[59]构建了2个级联反应路线，分别使100 g/L蛋氨酸前体酮在R-立体选择性的脱氢酶/CboFDH或S-立体选择性的脱氢酶/CboFDH的作用下，不对称还原生成(R)-羟基蛋氨酸(图 14A) 或(S)-羟基蛋氨酸(图 14B)，反应9 h后的转化率均 > 95%，产物的e.e.值均 > 99%。
He等[60]构建了(2S, 3S)-2, 3-丁二醇脱氢酶(BDH)/甲酸脱氢酶氧化-还原生物合成体系(图 15)，将40 g/L 2, 3-丁二醇催化合成(2S, 3S)-2, 3-丁二醇，反应21 h后产率＞98%，e.e.值＞98%。
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| 图 15 (2S, 3S)-2, 3-BDH与FDH催化合成(2S, 3S)-2, 3-丁二醇 Fig. 15 Synthesis of citronellal from (2S, 3S)- 2, 3-butanediol by (2S, 3S)-2, 3-BDH and FDH. |
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Knaus等[61]描述了胺脱氢酶(amine dehydrogenases，AmDH) 与甲酸脱氢酶组成的氧化-还原生物合成体系(图 16)，将50 mmol/L对甲氧基苯基丙酮转化为对应的(R)-胺，24 h反应后转化率为91%，产物得率82%，e.e.值> 99%。
为了更直观地展示FDH在手性生物制造中的应用，我们将手性化学品的生物制造具体参数总结于表 5，包括了FDH的催化效率、产物的光学纯度，以及生物催化的底物转化率(或产物得率) 和时空产率。改造提高FDH的催化效率和稳定性能够显著提高手性生物制造的产物得率和时空产率，贴近工业生产要求。例如，MycFDH C145S/D221Q/C255V突变体不仅改变了MycFDH的辅酶偏好性，提高其对NADP+的催化效率，还提高了对ECAA的化学稳定性，与MycFDH D221G构建的辅酶再生系统相比反应产率提高39%[43, 62]。LeuDH与FgFDH偶联合成L-2-氨基丁酸[54]的时空产率达到463.2 g/(L·d)，比偶联GDH辅酶再生系统的生物合成体系提高1倍[63-64]。GDH辅酶再生系统具有再生效率高、辅底物(葡萄糖) 价格低廉等优点，但葡萄糖同时被氧化并生成葡萄糖酸，不仅使反应pH下降，而且增加产物分离纯化的成本。据文献报道，在生产L-叔亮氨酸的工艺中，LeuDH偶联GDH辅酶再生体系反应的时空产率虽然比偶联FDH辅酶再生体系高20%，但其产物分离纯化较困难[53, 65]，生产成本反而更高。D-氨基酰化酶(D-aminoacylase，D-AA) 催化合成D-氨基酸的合成路线无辅酶再生系统[66]，24 h转化率为91.1%，e.e.值为86.7%，均低于D-氨基酸脱氢酶(D-AADH) 与FDH辅酶再生系统组合时的反应参数(4 h转化率为100%，e.e.值大于99%)。Wang等[67]报道2, 3-丁二醇催化合成(2S, 3S)-2, 3-丁二醇的生物制造路线，分别描述了无辅酶再生系统、GDH辅酶再生系统和FDH辅酶再生系统对催化反应的影响，结果如表 5所示，无辅酶再生系统的时空产率为64.8 g/(L·d)，产物得率为82.5%；GDH和BDH共表达的时空产率为67.2 g/(L·d)，产物得率为85.4%；FDH和BDH共表达的时空产率为86.4 g/(L·d)，产物得率为91.8%。由此可见，引入辅酶再生系统可提高(2S, 3S)-2, 3-丁二醇的产率，FDH和BDH共表达可提高对NADH的利用率及手性化合物产率，并且在该反应体系中无有机酸的产生，使产物分离纯化更简便。
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综上所述，FDH已被广泛应用于生产手性氨基酸、手性羟酸、手性醇、手性胺等工业领域，在氧化-还原生物合成体系中通过再生辅因子以减少NAD(P)H的外源添加量，从而降低成本，副产物CO2可直接排出反应体系，产物分离纯化更简单高效。由此可见，FDH在氧化-还原生物合成体系中的应用会愈发广泛。
4 总结与展望近年来，酶法制备手性化合物已被证明是实现绿色生物制造的重要途径，特别是氧化-还原生物合成体系得到了越来越广泛的应用，其反应过程往往涉及NAD(P)H等辅酶，成本高昂无法大规模生产，故构建高效的辅酶再生体系成为亟须解决的问题。其中，FDH辅酶再生体系已成为辅酶再生领域的研究热点，针对FDH与其他辅酶再生体系的酶相比存在催化效率较低、稳定性较差、对辅因子和底物的亲和力较低等问题，酶学专家和生物化工工程师们通过定向进化、理性设计和半理性设计改造筛选催化效率高、稳定性强、辅酶偏好性强的FDH。
本文总结了近些年通过酶分子改造的方法提高FDH的稳定性、优化动力学参数、改变辅酶偏好性的研究，虽然FDH的酶活有所提升，但是目前将其应用于工业上的实例还比较少。因此，后续的研究可侧重于以下两个方面：(1) 通过基因组挖掘、宏基因组筛选等方法筛选出新的酶活更高的野生型NAD+或NADP+依赖型FDH，扩大FDH基因文库。(2) 在目前研究基础上，利用蛋白质工程对FDH继续改造，获得催化活性更高、稳定性更强的FDH，筛选出具有工业属性的FDH，使FDH辅酶再生体系更好地服务于绿色生物制造。
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