糖尿病(diabetes mellitus) 是世界重大多发性内分泌疾病，2019年我国成年人患病率达到11.2%以上(20–79岁年龄段患者超过1.16亿人)，其中90%以上是Ⅱ型糖尿病患者，糖耐量异常(impaired glucose tolerance，又称糖尿病前期，不加干预或治疗5年内约25%–50%发展为Ⅱ型糖尿病) 3.5亿人以上，用于糖尿病相关的医疗开支高达1 090亿美元^[1-2]。因此，糖尿病的防治具有重要的经济和社会意义。阿卡波糖(acarbose) 是一种由放线菌等产生的假四糖类化合物，其核心结构假二糖阿卡维糖(acarviose) 通过α-1, 4-糖苷键与麦芽糖残基连接^[3-4]。阿卡波糖不仅能够竞争性抑制人小肠α-糖苷酶活性延缓餐后血糖升高，还能够显著降低糖耐量异常转为糖尿病的风险^[5]。由于疗效好、毒副作用小，并能有效预防糖尿病导致的心血管并发症，阿卡波糖广泛用于Ⅱ型糖尿病的治疗和预防，已成为我国口服降糖药中销量最大的品种^[5]。能合成阿卡波糖的微生物包括游动放线菌和链霉菌，由于游动放线菌具有较高的阿卡波糖生产能力，阿卡波糖工业化生产使用犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis) ZJB-08196、游动放线菌Actinoplanes sp. SE50/110及其突变株^{[3-4, 6-7]}，为多级分批补料发酵，发酵吨位30–120 m^{3 [3-4, 8]}。在游动放线菌发酵生产阿卡波糖过程中，会积累大量阿卡波糖结构类似杂质组分，导致纯化难度大^[9-12]。由于缺乏对阿卡波糖及其杂质合成和调控机制的系统了解，难以通过调控来阻断或降低杂质合成，导致需要复杂的多步层析以去除杂质。鉴于阿卡波糖在Ⅱ型糖尿病预防与治疗方面的重要价值，对阿卡波糖及其结构类似杂质合成与调控机制的研究备受学术界和产业界的重视。

笔者及所在团队在阿卡波糖等糖苷酶抑制剂类药物研究方面有着丰富的积累^[13-19]，结合相关报道笔者对阿卡波糖及其结构类似物合成及其调控方面的进展进行总结，以期为阿卡波糖菌种改良、发酵过程控制与优化和代谢调控等提供借鉴。

1 阿卡波糖的合成

目前国内外学者已对阿卡波糖合成途径进行了大量研究，通过基因组学^[20-21]、转录组学^{[19, 21-22]}、蛋白质组学^[23-25]、代谢组学分析^[26-27]，Actinoplanes sp. SE50/110中阿卡波糖的生物合成基因簇(acb基因簇) 及合成机制已经基本阐明^{[3-4, 23]} (图 1A)。acb基因簇编码一系列与阿卡波糖合成、转运、代谢相关的酶，由阿卡波糖的生物合成相关基因acbAB和acbVUSRPIJKLMNOC、转运相关基因acbWXY和acbFGH、细胞外与α-葡萄糖苷和阿卡波糖代谢相关的基因acbDEZ等基因组成(表 1)。阿卡波糖的生物合成分为不饱和环醇的合成(a)、4-氨基-4, 6-双脱氧葡萄糖的合成(b) 和阿卡波糖的合成(c) 3个步骤^{[3-4, 23, 28-30]} (图 1B)。如张丹等在大肠杆菌中异源可溶性表达了Actinoplanes sp. SE50/110 D-葡萄糖-1-磷酸-胸腺嘧啶转移酶(AcbA)、dTDP-D-葡萄糖-4, 6-脱水酶(AcbB) 和氨基转移酶(AcbV)，并以D-葡萄糖-1-磷酸为起始底物，通过体外催化研究脱氧氨基糖单元的生物合成过程和重组酶的酶学性质^[29]。同时通过构建acbA、acbB和acbV的同框缺失和回补突变株，考察了突变株阿卡波糖合成能力。结果表明，分别缺失acbA、acbB和acbV基因后，相应突变株均丧失了阿卡波糖合成能力，而将acbA、acbB和acbV基因分别回补后，各菌株又恢复了阿卡波糖合成能力。研究结果阐明了阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成过程。Zhao等也采用同框缺失和回补策略验证了AcbJ的功能^[30]。因此，组学等生物信息学和基因工程技术等方面的进展为全面解析阿卡波糖生物合成途径和菌种改良提供了高效的工具^{[28, 30-33]}。

2 阿卡波糖结构类似杂质合成机制

由图 1可知，阿卡波糖代谢途径涉及一系列的合成、转运、代谢、修饰等过程，因而极为复杂。游动放线菌在产生阿卡波糖的同时，还伴随有大量结构类似杂质积累(表 2)，其中，组分A和组分C与阿卡波糖结构极为接近，难以去除^[3-4]。欧洲药典对杂质含量有着严格的规定^[10]，为达到标准，生产中需采用多步层析工艺去除杂质，致使阿卡波糖纯化工艺复杂、步骤长、废水排放多、品质控制难^{[3-4, 8]}。由于对这些杂质合成的分子机制缺乏深入了解，目前只能通过菌种改良和发酵工艺控制来减少组分C的形成^{[3-4, 9, 16]}。这些策略不仅具有一定的盲目性，而且增加了操作复杂性。因此，结构类似杂质形成机制研究是阿卡波糖杂质组分控制的关键。根据相关文献，阿卡波糖部分结构类似杂质形成机制如下。

2.1 组分A的形成

组分A分子中阿卡维糖以1, 4-糖苷键与麦芽酮糖(1-a-葡萄糖-4-果糖) 相连。组分A由阿卡波糖在一定温度下异构化形成，该反应不涉及菌体(酶)^[34-35]。黄剑川等发现在60 ℃、pH 11.0条件下反应3 h，33.6%的阿卡波糖可被转化为组分A^[35]。

2.2 组分B、4a、4b、4c和假阿卡波糖的合成

Hemker等将胞外糖苷转移酶AcbD在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans) TK23中进行了异源表达和酶学表征，发现该酶是目前唯一以阿卡波糖为底物的糖苷转移酶，能够催化阿卡波糖核心基团acarviose转移到麦芽寡糖等糖上的反应，形成阿卡波糖结构类似物，与组分4a、4b、4c、组分B和假阿卡波糖的合成有关，但不能催化组分A、C和D的形成^[34]。

2.3 组分C的合成

从结构可以看出，组分C分子中acarviose以1, 4-糖苷键与海藻糖(1-a-葡萄糖-1-葡萄糖)相连，是发酵后期的代谢产物，含量随着阿卡波糖浓度升高而增加。因此，其合成可能与细胞裂解后释放到发酵液中的糖苷转移酶(glucosyltransferase, GTase) 或海藻糖合成酶有关^{[3-4, 36-37]} (图 2A)。海藻糖是一种在自然界中广泛分布的非还原型二糖，对生物体组织和蛋白质等生物大分子具有非特异性保护作用，既可以作为结构成分，又是一种能源物质^[38-39]。海藻糖的合成和积累是Actinoplanes sp.对高渗透压环境的一种适应^{[9, 17]}。Actinoplanes sp. SE50/110中存在的与海藻糖合成有关的6-磷酸-海藻糖合成酶/6-磷酸-海藻糖磷酸酶(TPP/TPS途径)、海藻糖合成酶(TS途径)、麦芽寡糖基海藻糖合成酶/麦芽寡糖基海藻糖水解酶(TreY/TreZ途径) 中，只有TreY能够催化阿卡波糖转化为组分C^[36]。余贞等利用同源重组技术敲除Actinoplanes 8-22中的treY基因，显著降低了组分C的含量，但不能完全阻断其合成^[40]，Zhao等也通过敲除treY基因抑制了组分C的形成，进一步证明了TreY在组分C合成中的作用^[41]。除TreY外，Choi等也发现Actinoplanes sp. SE50/110突变株CKD48中的一种胞内糖苷转移酶(GTase) 能够可逆催化阿卡波糖生成组分C，作用机制类似于组分C形成机制中的TreY (BⅢ) 途径(图 2B)^[37]。该酶在氨基酸序列上与TreY差异极大，而与放线菌中的TPP (WP_023516388等，88%以上)、TPS (WP_043783590等，70%以上)、TS (WP_023516388等，88%以上) 具有较高相似性。因此，如能在阿卡波糖产生菌中发现类似酶并进行考察将有助于进一步解析组分C合成机制并有助于组分C的控制。

2.4 组分D的合成

组分D分子中阿卡维糖是以1, 4-糖苷键与甘露糖基葡萄糖(4-O-β-D-mannosyl-D-glucose, Man-Glc) 连接，其形成机制未见报道。而Nakae等发现脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis) NCTC 9343中的UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(N-acyl-D-glucosamine 2-epimerase, AGE, YP_099168.1) 能够转化甘露二糖得到Man-Glc^[42]。通过BLAST比对发现Actinoplanes sp. SE50/110基因组中WP_014695088序列(AGE，由wecB基因编码) 与AGE具有较高序列同源性，可能具有类似功能，通过转化甘露二糖为组分D合成提供前体Man-Glc。

3 阿卡波糖及结构类似杂质合成的调控 3.1 杂质组分的控制

鉴于有限的杂质合成分子机制信息，目前仅有对组分A和组分C进行控制的报道。

3.1.1 组分A的控制

由于阿卡波糖异构化形成组分A反应的温度依赖性，降低后处理过程温度将有助于组分A的控制^[35]。周鲁谨等通过将放罐后阿卡波糖料液预处理阶段中的温度控制为0–25 ℃，显著降低了料液中杂质组分A的含量^[43]。

3.1.2 组分C的控制

目前主要通过菌种改良、添加糖苷酶抑制物质等措施降低组分C的含量。如张琴等利用紫外、亚硝基胍、硫酸二乙酯、亚硝酸等方法对Actinoplanes sp. LA-H6进行诱变，得到一株发酵液中组分C含量显著降低的突变株SIPI-AK^[44]。牛鑫淼利用紫外诱变和微波诱变处理A. utahensis ZJB-08196，获得的两个突变株UN-52和WN-44经基因组重排得到突变株F61，其发酵液中组分C含量降低了18.9%^[45]。Choi等发现加入10 μmol/L井冈霉烯胺(valienamine) 可以将Actinoplanes sp. CKD485-16发酵液中组分C含量减少90%以上^[9]。Cheng等通过渗透压分段控制技术将Actinoplanes sp. A56发酵液中组分C含量从498.2 mg/L降低到307.2 mg/L^[46]。Xue等在发酵过程中加入20 mg/L井冈霉胺(validamine) 后，不仅提高了A. utahensis ZJB-08196阿卡波糖发酵水平，还降低了组分C含量，在分批发酵条件下，与未添加井冈霉胺的对照相比，其阿卡波糖产量从3 560 mg/L增加到4 950 mg/L，而组分C的含量则从289 mg/L降到107 mg/L，分批补料发酵时，阿卡波糖产量达到6 606 mg/L，而组分C含量只有212 mg/L^[16]。

尽管上述措施确实显著降低了组分C的含量，但诱变育种具有一定的盲目性，其他措施除了增加操作复杂性和相对成本以外，还不能直接将发酵液中的组分C相对含量降到药典标准以下，仍需后续多步色谱进行纯化。

3.1.3 前体和小分子信号物

小分子信号物和前体等对微生物代谢具有重要的影响。Xue等发现加入20 mg/L井冈霉胺后，A. utahensis ZJB-08196阿卡波糖产量从3 560 mg/L增加到4 950 mg/L^[16]。通过进一步分批补料发酵，阿卡波糖产量达到6 606 mg/L。作为氨基环多醇，井冈霉胺是一种高效的α-糖苷酶抑制剂，同时也是阿卡维糖的组成部分，阿卡维糖通过1, 4-糖苷键与麦芽糖结合形成阿卡波糖，因而可以作为阿卡波糖合成的前体^[47]。因此，加入井冈霉胺后阿卡波糖发酵水平升高的两个可能原因为：1) 作为抑制剂抑制了与阿卡波糖结构类似物合成有关的α-糖苷酶；2) 作为合成前体，促进了阿卡波糖的合成。

Sun等发现加入适量S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM) (20–100 μmol/L)可以将A. utahensis ZJB-08196阿卡波糖产量提高10%–30%，表明在阿卡波糖合成中，SAM是一种重要的信号物^[15]。众所周知，SAM是一种极为重要的生理活性物质，是生物体内主要的甲基供体，还参与转硫基、转氨基和转核糖基等重要的生化反应^[48]。同时，作为重要的信号分子，SAM也能调控微生物尤其是链霉菌属的代谢^[49-50]。代谢组学研究表明，SAM等小分子物质还可通过调节其他组学(基因组、表观基因组、转录组和蛋白组) 的水平来影响细胞的生理功能^[51]。因此，SAM促进A. utahensis ZJB-08196阿卡波糖合成的机制可能包括两个方面：1) SAM可以作为甲基供体促进4-氨基-4, 6-二脱氧葡萄糖的合成；2) SAM作为信号分子可能促进与ABC转运子相关的寡肽结合组分的表达，而ABC转运蛋白对麦芽寡糖前体合成阿卡波糖起着重要的作用。

李明刚发现在培养12 h后向发酵液中加入60–200 μmol/L γ-丁内酯类物质(γ-丁内酯和2-乙酰丁内酯) 可以显著提高A. utahensis ZJB-08196的阿卡波糖发酵水平^[52]。作为可扩散的低分子量化学物质，γ-丁内酯类是一种激素类的信号分子，可以在纳摩尔浓度下诱发微生物尤其是链霉菌的次级代谢，如在链霉菌中已阐明，γ-丁内酯类化合物通过特定受体蛋白(通常是TetR家族的转录调节因子) 发挥调节作用^[53-54]。对于γ-丁内酯类在阿卡波糖生物合成中的作用，推测其作为信号分子可以与受体蛋白ArpA结合，促进阿卡波糖合成途径中关键调节因子的转录，从而显著提高阿卡波糖发酵水平。

对于上述前体和信号分子调控游动放线菌次级代谢机制方面的深入研究将有助于阿卡波糖生物合成的调控和产量的进一步提升。

3.2 碳源

研究表明游动放线菌产阿卡波糖最适碳源为麦芽糖和葡萄糖。Lee等发现阿卡波糖的麦芽糖基团来自麦芽糖、麦芽三糖或较高分子的麦芽寡糖，添加麦芽糖比添加葡萄糖更有利于Actinoplanes sp. SN223/29生产阿卡波糖^[55]。姜玮等发现将麦芽糖浓度保持在6%–7%可以促进Actinoplanes sp.合成阿卡波糖^[56]。Wang等发现麦芽糖在A. utahensisZJB-08196阿卡波糖发酵过程中可以作为碳源和阿卡波糖分子中的麦芽糖基团供体，也可以作为渗透压调节剂保护细胞正常生理活动^{[14, 17]}。

Wendler等通过比较蛋白组学分析发现阿卡波糖或阿卡维基-葡萄糖的形成取决于提供的碳源，在糖转运蛋白和代谢蛋白表现有显著差异，而acb-基因簇的表达则没有显著差异。在麦芽糖培养基中，麦芽糖诱导的α-葡萄糖苷酶/麦芽糖酶MalL和ABC型糖转运蛋白AglEFG、MalEFG和MstEAF表达水平显著提高。葡萄糖培养基中只有MstEAF大量表达，表明MstEAF是葡萄糖的主要转运蛋白。研究结果表明，阿卡波糖或阿卡维基-葡萄糖的形成差异与糖的转运较acb-基因簇表达水平更密切相关^[25]。

Weng等以阿卡波糖工业生产菌A. utahensis ZJB-08196突变株ZJB-03852为研究对象，基于游动放线菌基因组信息，利用转录组分析对不同碳源培养条件下A. utahensis ZJB-03852的表达谱进行差异分析^[19]。对差异表达基因进行途径分析、互作分析及关联分析的结果显示，糖转运及细胞色素氧化酶模块在葡萄糖与麦芽糖混合培养基中显著富集，而铁蛋白代谢相关基因在葡萄糖培养基中表达显著增加。

解慧欣等考察了麦芽糖及转运蛋白对游动放线菌生产阿卡波糖的影响，也发现麦芽糖浓度提高能够显著促进转运蛋白基因acbW的转录^[57]。表明acbWXY编码的转运蛋白在阿卡波糖的生产过程中至关重要，且强化该外运途径可有效提高阿卡波糖产量。

3.3 分子水平调控

近年来基因组^[20]、比较基因组^[21]、转录组^[22]、蛋白组^{[25, 58]}和代谢组^[26-27]分析等生物信息学和分子生物技术方面的进展^{[41, 59]}为游动放线菌阿卡波糖及其结构类似物生物合成和调控机制以及生产性能提高提供了高效的工具。在代谢调控方面，根据组学分析和预测，Actinoplanes sp. SE50/110基因组中有900个以上与转录调控有关的基因，其中697个注释为转录调控子(GenBank: LT827010.1)^{[20-22, 24-25]}，有很多参与糖代谢调控。而分子结构分析表明，阿卡波糖及其结构类似杂质的合成应该与糖类尤其是麦芽糖的代谢密切相关^[3-4]。

3.3.1 阿卡波糖调控蛋白C的影响

Wolf等将链霉菌Streptomyces spp.中阿卡波糖生物合成基因簇的LacⅠ家族调控蛋白与Actinoplanes sp. SE50/110基因组进行比对，确定了一种阿卡波糖调控蛋白C (AcrC)，利用PCR-targeting技术敲除了Actinoplanes sp. SE50/110 acrC基因，经发酵试验、全基因组DNA微阵列杂交和RT-qPCR等研究了ΔacrC突变株以解析其结合域^[11]。结果表明，AcrC可以结合到Actinoplanes sp. SE50/110 acbE和acbD基因间隔区并作为这些基因的转录抑制子而负调控其表达。但AcbD和AcbE仅与细胞外α-葡萄糖苷和阿卡波糖代谢相关，并不直接参与阿卡波糖的合成。同时也发现AcrC的表达可以影响生长初期阿卡波糖的形成，在麦芽糖基础培养基摇瓶培养47.5 h后，ΔacrC突变株和野生菌的阿卡波糖最大生产速率分别达到(5.9×10⁻³±0.7×10⁻³) h^–1和(5.5×10⁻³±0.4×10⁻³) h^–1，但最终阿卡波糖产量分别为0.93 g/L和0.98 g/L，并没有显著差异。有趣的是，AcrC并不调节malEFG操纵子。

3.3.2 转录调控子MalT的影响

Droste等发现Actinoplanes sp. SE50/110存在一大段基因组区域(ACSP50_3900到ACSP50_3950)，其中39个基因的转录方式一致，具有麦芽糖依赖性。转录调控子MalT被鉴定为该麦芽糖调控大片段基因组区域的激活子^[60]。利用CRISPR/Cas9技术和来自缓慢爱格士菌(Eggerthella lenta) 的强启动子PgapDH^[32]分别构建了malT敲除和过表达突变株，通过转录组差异分析揭示了MalT对该区域51个基因中的40个基因有激活作用，但对麦芽糖代谢基因没有影响。与许多其他细菌相比，MalT是该区域的一种麦芽糖依赖型激活子但并不是mal基因的激活子，并不调控麦芽糖代谢相关基因^[60]。

3.3.3 途径特异性转录调控蛋白AmlR的功能

Schaffert等研究了Actinoplanes sp. SE50/110中麦芽糖/麦芽糊精的代谢^[12]。通过生物信息学分析定位了一个假定的麦芽糖酶基因amlE (ACSP50_2474)，位于一个上游有编码PurR/ LacⅠ转录调控蛋白基因(amlR (ACSP50_2475)) 型操纵子，下游有一个编码含有假定涉及c-di-GMP信号的GGDEF-EAL-domain蛋白的基因。利用CRISPR/Cas9技术构建了敲除amlE和amlR基因的突变株，通过培养试验和功能分析，确定了AmlE对Actinoplanes sp. SE50/110麦芽糖利用极为重要。野生型中没有检测到麦芽糖磷酸化酶活力或其编码基因。在葡萄糖培养基中生长时，野生菌aml操纵子的转录被抑制，但ΔamlR突变株中则没有这种抑制。尽管AmlR很明显是aml操纵子的一个途径特异性转录调控蛋白，ΔamlR突变株在葡萄糖培养基中的生长被严重抑制，同时伴随着不同功能族的一些基因的差异表达。这是由位于amlE下游假设参与第二信使c-di-GMP代谢的ACSP50_2473所导致。因此，麦芽糖不仅是Actinoplanes sp. SE50/110最重要的碳源，其代谢也和核苷信使系统c-di-GMP耦联。

3.3.4 基因组规模代谢网络模型构建

为全面了解Actinoplanes sp. SE50/110细胞代谢，Wang等基于基因组注释、生化反应数据库和文献挖掘重建了一个包含1 028个基因、1 128种代谢物和1 219个反应的基因组规模代谢网络模型(genome-scale metabolic model) iYLW1028^[28]，分别确定了122个和81个对菌体在阿卡波糖合成培养基(麦芽糖) 和蔗糖培养基中生长的关键基因，并阐明了SE50/110中阿卡波糖生物合成途径(图 3)。基于模型预测，向培养基中加入精氨酸和组氨酸分别使阿卡波糖产量增加了78%和59%。此外，根据模型预测和7.5 L发酵罐溶氧控制发酵，证明溶氧对阿卡波糖产量也有显著影响，有限的溶氧水平更有利于阿卡波糖合成。并且，也鉴定了高产阿卡波糖所需过表达的基因(如ACPL_1861、ACPL_6461、ACPL_1328和ACPL_6750等)。模型预测组分C由TreY催化7-磷酸阿卡波糖合成，而treY基因不是菌株生长和阿卡波糖合成必需基因。由于还有其他两个海藻糖合成途径可以合成菌体生长必需的海藻糖，敲除treY基因将有助于阿卡波糖合成和下游处理。敲除treY基因显著降低甚至阻断组分C形成的报道确证了该预测的准确性^[40-41]。该模型有助于优化游动放线菌的阿卡波糖生产和系统代谢工程。

3.3.5 生物合成途径关键酶强化

Schaffert等将强启动子引入pSET152系统，在Actinoplanes sp. SE50/110中过表达了acbC基因，其编码的环化酶AcbC催化阿卡波糖生物合成的第一步反应，使7-P-景天庚糖(sedo-heptulose 7-P) 发生分子内环化得到2-epi-5-epi-valiolone，并将该菌的初级代谢(磷酸戊糖途径) 和次级代谢(阿卡波糖合成) 耦联^[32]。但过表达acbC基因并没有增加阿卡波糖产量，过表达最强的突变株阿卡波糖产量反而轻微下降。LC-MS分析表明这种现象是由过表达突变株积累的中间体1-epi-valienol-7P所导致的负反馈抑制造成的。这也是后续阿卡波糖生物合成步骤的瓶颈之一。该过表达系统为研究单个基因的功能提供了有效的工具。

3.3.6 转录和转录后调控

Droste等通过RNA-seq和由生物反应器获得的最新的蛋白组学数据，分析了Actinoplanes sp. SE50/110生长过程中基因表达动态。系统聚类分析揭示了在生长过程中具有相同转录动力学的共表达基因。除了一个预期的在初级代谢到次级代谢转换阶段的代谢开关，还观察到从生长初期到稳定期所有阿卡波糖合成基因转录丰度都在持续下降，下降幅度最大的是单顺反子转录的acbA、acbB、acbD和acbE基因。结果证实了acb基因转录和阿卡波糖合成速率具有相同趋势。但蛋白组动态与相应的基因转录动态并不一致，说明各Acb蛋白具有不同的稳定性或转录后调控，反之也表明阿卡波糖生物合成中的瓶颈。同时也发现包括11个转录调控子(如ACSP50_0424)、2个σ因子在内的一些基因在培养期间与acb基因簇共表达，这些基因在之前的研究中没有受到重视。因此，高时间分辨率的基因组范围的转录组和蛋白组分析将有助于阿卡波糖的生物合成途径及其转录和后转录调控研究^[58]。

3.3.7 代谢支路的影响

缺乏对阿卡波糖及其结构类似物杂质合成机制的深入了解制约了阿卡波糖产量的提升。Zhao等发现在发酵液中1-epi-valienol和valienol与阿卡波糖摩尔比极高，是与阿卡波糖生物合成不直接相关的支路产物^[30]。而这些支路产物的合成与氨基脱氧己糖生物合成效率不足有关。通过减小流向支路产物的代谢通量和强化氨基脱氧己糖供给对阿卡波糖的生物合成进行了有效调控，显著提高了阿卡波糖产量。充分说明了阿卡波糖生物合成途径的可调控性，也彰显了在提升微生物药物生产水平过程中评估副产物积累的重要性。

3.3.8 小分泌蛋白Cgt的影响

蛋白组学^[23]和转录组学^[22]分析发现Actinoplanes sp. SE50/110会高分泌表达一种具有一个碳水化合物结合域(carbohydrate-binding module) 的小分泌蛋白Cgt (约占总分泌蛋白的8%)，其表达具有碳源依赖性^[22-23]，但碳源对其表达的调控机制还有待于解析。Schaffert等利用CRISPR/Cas9技术构建了Actinoplanes sp. SE50/110 Δcgt突变株以考察Cgt的功能，发现突变株的生长、渗透压和pH耐受性与原始菌株相比没有显著差异，但在含麦芽糖培养基中阿卡波糖产量较原始菌株提高了8%–16%。鉴于敲除cgt对acb-基因簇表达没有显著影响，阿卡波糖产量的提升可能与敲除cgt基因减轻了菌株合成Cgt的代谢负担有关，这些节约的资源流向了阿卡波糖合成途径^[61]。

上述研究从各个层面探究了阿卡波糖及其结构类似杂质的合成及调控机制，但从结果来看，还处于初级阶段，需要结合组学分析、基因工程改造等手段进行系统全面的研究。

4 总结与展望

鉴于阿卡波糖在Ⅱ型糖尿病的治疗中的重要性及其工业化生产中面临的问题，对生产阿卡波糖的游动放线菌进行研究很有必要。综上所述，阿卡波糖产生菌中阿卡波糖及其结构类似物，尤其是结构类似杂质的合成及调控机制还没有完全解析。可能参与杂质形成和调控的基因的发掘，杂质形成途径和机制及其调控、与阿卡波糖代谢的关联等还有待深入研究。阿卡波糖是典型的微生物次级代谢产物，而微生物次级代谢涉及复杂的代谢合成网络和多个基因，往往是由一系列基因控制，不仅有合成基因，还有调控、修饰、转运等相关的基因，这些基因以基因簇的形式存在，途径复杂，结构类似物众多，因此其高效调控一直极具挑战。近年来，迅速发展的基因工程、基因组工程和合成生物学等技术已在微生物次级代谢途径研究和菌株改造方面得到应用，并显示出良好的应用前景^[62-66]，这为研究阿卡波糖及其结构类似杂质形成和调控机制提供了借鉴。阐明这些机制将有助于阿卡波糖生产菌的改良，并为其他微生物次级代谢产物合成优化提供借鉴。同时，作为一种化学原料药，遗传改造的阿卡波糖菌种用于生产之前时应严格遵循国家食品与药品监督管理局发布的《已上市化学药品变更研究的技术指导原则》等文件的要求申请相关批文^[67-68]。