2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 王磊, 王绪霞, 李斐, 崔明娟, 杨晓旭, 杨敏, 闫云君
- WANG Lei, WANG Xuxia, LI Fei, CUI Mingjuan, YANG Xiaoxu, YANG Min, YAN Yunjun
- 微生物水泥相关酶的研究进展
- Advances of enzymes related to microbial cement
- 生物工程学报, 2022, 38(2): 506-517
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(2): 506-517
- 10.13345/j.cjb.210127
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文章历史
- Received: February 6, 2021
- Accepted: September 18, 2021
引用本文
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2. 郑州工程技术学院 化工食品学院, 河南 郑州 450044;
3. 武昌首义学院 城市建设学院, 湖北 武汉 430064;
4. 华中科技大学 土木工程与力学学院, 湖北 武汉 430074
2. School of Chemical Engineering & Food Science, Zhengzhou University of Technology, Zhengzhou 450044, He'nan, China;
3. School of Urban Construction, Wuchang Shouyi University, Wuhan 430064, Hubei, China;
4. School of Civil Engineering and Mechanics, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, Hubei, China
微生物诱导碳酸钙沉淀(microbial induced calcium carbonate precipitation, MICP) 是自然界普遍存在的一种生物矿化现象，即利用微生物代谢活动中的矿化行为，诱导碳酸钙沉淀，在微生物细胞外形成方解石等形式的矿化结构，从而能将环境中疏松的岩土颗粒胶结形成具有一定硬度的固化体，表现出特殊的胶结作用，可作为一种新颖的生物胶凝材料——微生物水泥(microbial cement)。目前，已发现的MICP主要有5种机理，分别是尿素水解、反硝化作用、硫酸盐还原、三价铁还原和有机物降解等。其中，尿素水解的碳酸根产率高且量大，成为了研究热点。人们利用这一生物学过程，研发了“微生物水泥”。微生物水泥能显著提高土体的抗压性能，且较传统矿物质水泥具有绿色环保、经济高效等优点，已应用于生态修复、地基加固、裂缝修补、古迹保护、水利工程渗漏封堵等领域。目前，欧盟第七研发框架计划已将MICP确定为低成本、高强度、环境友好型生物水泥开发，美国国家科学研究委员会(National Research Council, NRC) 将MICP确立为一项重要研究课题[1]。当前，研究人员正努力解决生物水泥的强度和耐久性问题，以使其各项性能指标能比拟传统水泥[2-3]。为此，本文主要对微生物水泥相关的分子生物学研究现状进行系统综述，主要包括与微生物水泥胶结功能密切相关的脲酶、碳酸酐酶的基因、蛋白结构、调控机制以及两种酶在MICP过程中的协同关系，以及相关的工程菌构建，并针对当前研究中存在的问题进行了合理展望，试图从生物学角度出发寻求可能的解决方法，比如运用生物信息学、合成生物学等前沿生物技术，构建具有广泛环境适应性的生物水泥工程菌。相信在不久的将来，生物水泥这项新颖技术会迎来发展高潮，产生更加显著的经济和社会效益。
1 脲酶 1.1 脲酶的作用机理在MICP过程中，巴氏芽孢八叠球菌(Sporosarcina pasteurii) 等微生物通过表达脲酶使尿素水解，从而迅速提高细胞微环境的pH值与碳酸根浓度，形成诱导碳酸钙沉淀所需要的碱性环境。同时，微生物细胞表面通常带有大量负电荷的官能团，从而吸附溶液中带正电荷的Ca2+，Ca2+遇到高浓度的碳酸根就会形成碳酸钙，并沉淀在细胞表面，随着碳酸钙沉淀的扩大，逐渐将微生物包裹，限制其营养物质的扩散，导致微生物死亡，并最终形成生物矿化体[4]。整个化学反应过程如式(1)–(5)[5]：
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(5) |
微生物作用下的碳酸钙沉积速率与环境因素密切相关，主要由Ca2+浓度、CO32–浓度、环境pH值和有效的成核晶体4个关键因素决定。由于巴氏芽孢八叠球菌产脲酶的活性为目前最高，因此作为MICP功能微生物的代表，研究较为深入。
1.2 脲酶的基因簇结构脲酶基因相对较复杂，通常由3–7个不等的基因组成，不同来源的微生物其脲酶基因簇的结构亦有所不同(图 1)。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 的脲酶基因数目相对比较少，只有ureA、ureB和ureC三个结构基因组成，无需其他辅助基因和调节基因就可以组装成一个完整的脲酶来发挥作用[6]。有些微生物来源的脲酶基因数目较大，不仅包含ureA、ureB 和ureC结构基因，还包含辅助基因(ureD、ureE、ureH、ureF、ureG和ureI等) 和调节基因(ureR等)[7]。而产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes) 的脲酶基因中除包含3个结构基因(ureA、ureB、ureC)外，还包含ureD、ureE、ureF和ureG四个辅助基因(图 1)。豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum) 的脲酶基因与产气克雷伯氏菌的顺序和数量一致，但序列中插入了几个开放阅读框(open reading frame, ORF)[8]。巴氏芽孢八叠球菌(S. pasteurii) 的脲酶基因数目和种类与产气克雷伯氏菌脲酶相同，但基因排列顺序有所不同，其辅助基因ureD位于ureG之后。而胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae) 的脲酶基因簇前面是尿素转运的基因(utp)和编码镍转运的基因cbiK、cbiL、cbiM、cbiQ和cbiO[9]。不同于其他细菌，雪貂螺旋杆菌(Helicobacter mustelae) 脲酶结构基因仅由ureA和ureB组成，而辅助基因则是由ureI、ureE、ureF、ureG和ureH (与其他细菌辅助基因ureD同源) 5个基因组成，位于结构基因的下游，并且在完整的脲酶基因簇以外，还具有第二组结构基因[10]。
虽然不同来源的微生物其脲酶基因簇的结构不同，但结构基因基本是脲酶基因的必备组成，通过图 1可知，大多脲酶基因都含有ureA、ureB和ureC三个结构基因，但螺旋杆菌属的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori) 和雪貂螺旋杆菌(H. mustelae) 结构基因仅由ureA和ureB组成，说明结构基因中ureA和ureB是发挥脲酶活性的必需要素。
1.3 脲酶的蛋白构成细菌的脲酶蛋白结构通常由结构蛋白和辅助蛋白组成。脲酶结构基因ureA、ureB和ureC分别编码脲酶主体结构的γ、β和α三个亚基，除枯草芽孢杆菌外，大多数细菌还需要系列辅助基因协助编码的辅助蛋白才能组装成完整具有活性的脲酶。脲酶活性区域位于α亚基上，每个亚基含有双核镍离子的活性位点[12]。结构蛋白可以通过单体形成更大的三聚体、六聚体复合物结构，比如巴氏芽孢八叠球菌脲酶组成(αβγ)3三聚体结构。
脲酶基因簇中的辅助基因ureD、ureE、ureF、ureG、ureH和ureI等编码相应辅助蛋白，从而协助将Ni2+转运到无活性的酶原上，以激活脲酶活性。其中，辅助蛋白UreE可以结合细胞中的镍离子，在脲酶激活过程中作为镍离子的载体。辅助蛋白UreH是脲酶的伴侣蛋白，与脲酶蛋白组成复合物，维持脲酶蛋白构象或者阻止无效镍离子的结合。UreF和UreG形成一个复合物，能够促进镍离子有效结合到活性位点。UreI可能是位于细胞内膜上的尿素转运通道，可以根据pH值的改变调节细胞外尿素向细胞质内的转运，从而调节细胞质内脲酶的活性，如图 2可见微生物脲酶的组装过程[7]。
在细菌生长过程中，脲酶基因的调控机制主要分为以下3种：
(1) 氮源调控。这类微生物能够利用脲酶分解尿素产生NH4+，将其作为氮源。例如，产气克雷伯氏菌在含氨等氮源丰富的培养基上不会合成脲酶，而在低氮条件下则能合成脲酶，其氮调节系统(ntr) 是脲酶基因表达调控的主要机制，其中ntrA编码σ54，ntrC编码调节蛋白，能激活依赖σ54的启动子的转录。而在低氮条件下，磷酸化的ntrC能够激活σ54聚合酶的转录，提高氮同化控制蛋白(Nac) 的含量，然后Nac结合到ureD上游的σ70启动子区，从而激活脲酶的转录[13]。
(2) 氨根调控。尿素水解作用产生的氨虽然可以作为细菌代谢的氮源，但浓度过高也会对组织产生毒害作用。因此，当环境的铵根浓度较高时，则会抑制脲酶表达，如克雷伯氏菌[14]。
(3) pH调控。脲酶表达受pH调控，在酸性条件下，脲酶合成增多，在中性条件下，脲酶开始降解。例如，pH值对唾液链球菌脲酶操纵子的诱导表达调控受到邻近的启动子PureI的阻遏调控[15]，具体表现为：在pH 5.5时，脲酶合成增多，且比pH 7.0时的脲酶活性高100倍[16]。
MICP最常用的巴氏芽孢八叠球菌，其在不同生长时期的脲酶活性也不同，培养初期脲酶活性迅速上升，在对数期达到最高活性，之后缓慢下降。巴氏芽孢八叠球菌的最适环境pH值为9.25，当外界pH高于这个值时，细菌会通过自身代谢下调脲酶活性，防止pH值过高造成的不利于菌体生长情况的发生[17]。对数期后脲酶活性的下降很可能与培养基中菌体代谢产物的积累以及环境pH值的升高有关。因此，在开展MICP胶结过程中，要注意代谢产生的铵根离子浓度和体系pH值过高产生的不利因素，从而影响矿化效率。
1.5 脲酶基因工程菌虽然野生巴氏芽孢八叠球菌在生物水泥的应用方面已有很多研究报道，但目前对于脲酶工程菌的研究仍停留在前期探索阶段。早在20世纪90年代初，Kim等[18]曾将巴氏芽孢八叠球菌的脲酶操纵子基因插入pBR322重组质粒，并在大肠杆菌中表达，以研究脲酶操纵子基因对脲酶活性的作用机理。后来，Bergdale等[19]在此基础上将巴氏芽孢八叠球菌的脲酶基因和胞外聚合物EPS基因导入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 中，获得既能诱导产生方解石沉淀又能产生EPS的重组体，重组菌株诱导产生CaCO3沉淀的速率与巴氏芽孢八叠球菌相当，通过扫描电镜观察到了CaCO3晶体和胞外EPS层的复合体有较好的融合，为生物复合材料的研制提供参考。Connolly等[20]则将巴氏芽孢八叠球菌的脲酶基因分别导入能表达绿色荧光蛋白GFP的绿脓杆菌和大肠杆菌中，脲酶基因ureDABC和ureFG分别连接到载体pJN105中，使用阿拉伯糖诱导的启动子pBAD来快速调控脲酶的表达(图 3)。构建出两种新型模式生物，通过GFP在荧光显微镜下的成像作用，方便进行矿化过程中微生物和碳酸钙时空分布的机理研究。可见，虽然有学者利用分子生物学手段对脲酶进行了表达和研究，但重点是研究其分子调控机理，构建的基因工程菌脲酶活性并没有明显的提升，因此，尚无公开文献报道成功构建出高效表达脲酶的工程菌。
2018年，英国剑桥大学桑格研究院完成了巴氏芽孢八叠球菌全基因组的测序工作并对外公布(NCBI：NZ_UGYZ01000002)，目前一共注释了3 215个基因[21]，其中与MICP相关的脲酶、碳酸酐酶等基因均能找到对应的基因序列。有理由相信，利用基因组信息、分子生物学和合成生物学技术手段，未来可以得到更适合工程化应用的新型高效MICP工程菌。近期笔者实验室通过合成生物学等技术手段，已在枯草芽孢杆菌中实现了脲酶的高效表达。
2 碳酸酐酶碳酸酐酶(carbonic anhydrases, CA) 是一类能高效催化二氧化碳、水与碳酸、H+之间可逆反应的含锌金属酶，pH值在4.0–9.0之间且温度低于65 ℃的条件下能够保持较高活性和稳定性[22]。碳酸酐酶的催化反应速率非常快，不同家族的催化速率一般为(104–106)/s[23]。因此，其有望在MICP中帮助有效提升生物矿化的速率而备受关注。
2.1 碳酸酐酶的基因家族至今，已发现有α、β、γ、δ、ζ、η等6个不同家族的碳酸酐酶，每个家族之间的氨基酸序列无明显同源性。在六大家族中，α-CA常见于哺乳动物、原生动物、藻类、植物、细菌、真菌和古菌中，β-CA在高等植物的叶绿体中，以及在细菌、真菌、藻类、古菌中亦可以找到，γ-CA主要存在于一些细菌和古菌中，δ-CA与ζ-CA主要存在于海洋硅藻中，η-CA目前发现主要存在于疟原虫中[24]。虽然这六大家族酶结构相似度不高，但每种酶的活性中心都有一个对催化过程起着重要作用的金属离子，而加快CO2水合的核心机理正是金属离子对CO2的亲核攻击[25]。表 1列出了常见细菌的碳酸酐酶。
| Gram negative/ positive |
Genus/species | CA family | ||
| Gram-negative | Neisseria gonorrhoeae | α | – | – |
| Helicobacter pylori | α | β | γ | |
| Escherichia coli | – | β | γ | |
| Haemophilus influenzae | – | β | – | |
| Brucella suis | – | β | γ | |
| Salmonella enterica | – | β | – | |
| Vibrio cholerae | α | β | γ | |
| Sulfurihydrogenibium yellowstonense | α | – | γ | |
| Sulfurihydrogenibium azorense | α | – | γ | |
| Porphyromonas gingivalis | – | β | γ | |
| Ralstonia eutropha | α | β | γ | |
| Burkholderia pseudomallei | – | β | γ | |
| Gram-positive | Mycobacterium tuberculosis | – | β | γ |
| Clostridium perfringens | – | β | γ | |
| Streptococcus pneumoniae | – | β | γ | |
| Bacillus subtilis | – | β | γ | |
| Leifsonia xyli | – | β | γ | |
| Staphylococcus aureus | – | – | γ | |
| Enterococcus faecalis | – | – | γ | |
对比可以发现，革兰氏阳性菌中不含有α-CA，但都含有γ-CA，有些学者认为革兰氏阳性菌出现的年代较早[27]，而α-CA可能是由γ-CA进化而来，除了可以催化加速CO2水合之外，还衍生出了酯酶活性[26]。分离自美国黄石公园温泉的Sulfurihydrogenibium yellowstonense YO3AOP1的碳酸酐酶(SspCA)[28]，以及从亚速尔群岛温泉极端微生物Sulfurihydrogenibium azorense中分离的碳酸酐酶(SazCA)[27]均为典型的α-CA。而幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌(Vibrio cholerae) 和真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha) 则具有α、β和γ型的碳酸酐酶。
2.2 碳酸酐酶的蛋白构成目前，碳酸酐酶已发现的有α、β、γ、δ、ζ、η等6个不同家族，其中α、β和γ三个结构研究得较为清楚，其蛋白三维结构如图 4所示。对比上述蛋白三维结构可以发现，γ-CA的催化腔最小，β-CA的催化腔较大，而在α-CA的最大，因此γ-CA的催化效率比α-CA和β-CA都要低，α-CA的催化效率相对最高。由此，在寻找高活性碳酸酐酶时，一般均是围绕α-型的碳酸酐酶开展的[26]。
Sulfurihydrogenibium yellowstonense YO3AOP1的碳酸酐酶SspCA是典型的α-CA二聚体结构，每个单体含有一个三角锥活性中心，由Zn2+和His89、His91、His108组成畸变四面体，其中导致CO2水化的核心机理是Zn2+对于CO2的亲核攻击。SspCA的二聚体结构，主要由α-螺旋和小β-折叠的10个平行的β-折叠组成，其活性中心位于一个圆锥形体腔中，其蛋白质表面含有较多的带电氨基酸，形成一个较复杂的离子网络，可能这也是SspCA热稳定性更高的原因[28-29]。
Sulfurihydrogenibium azorense的碳酸酐酶SazCA的单体结构主要由10个平行的β-折叠，周围再环绕着3个α-螺旋、310-螺旋和小β-折叠组成。不同来源的α-CA中，由Cys24与Cys178所组成的二硫键相对保守。SazCA与SspCA的结构有61.3%的相似度，SspCA上的Glu2和Gln207残基被SazCA的His2和His207取代，这种取代可能影响了His64的pKa值，进而增强了其质子穿梭能力[30]，这些结构信息为设计高催化活性的α-CA提供了重要理论参考。
2.3 碳酸酐酶基因工程菌由于碳酸酐酶能够捕获燃烧废气中的CO2，从而减少碳排放量，因此近年来碳酸酐酶工程菌的研究成为一个热点。一些学者从自然界中筛选具有耐热、耐碱碳酸酐酶基因的微生物资源直接进行异源高效表达。Jun等从杀鲑异弧菌(Aliivibrio salmonicida) 中克隆到了碳酸酐酶基因ASCA，经过密码子优化和去除信号肽，可实现ASCA (mASCA) 的高效表达，并且在10–60 ℃，pH 6.0–11.0的范围内表现出稳定的活性。当pH值为10.0时，mASCA活性可以保持稳定48 h[31]。侯娟等将嗜热蓝细菌(Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCTE542) 的碳酸酐酶基因Ecah在大肠杆菌细胞中异源高效表达，得到的碳酸酐酶ECAH经过50 ℃处理30 min后，酶活比对照提高了8%[32]，增强了嗜热碳酸酐酶催化转化高温烟道中CO2的性能。
虽然已经从自然环境中筛选到了很多新型的碳酸酐酶，但仍不能有效满足工业对碳酸酐酶的需求，有学者利用蛋白质工程等生物技术手段对碳酸酐酶进行修饰来进一步提升其酶活或抗逆性能。正如以高活性的碳酸酐酶SazCA为模本，在其N端引入耐热的SspCA中的基因结构，以期得到超级碳酸酐酶SupCA，虽然最终效果没有达到预期，但也为后继碳酸酐酶超级工程菌的设计提供了一定的参考[33]。蔡丽希等对碳酸酐酶的热稳定性机制的研究进行了总结和分析，认为蛋白中的二硫键和分子构象的刚性有助于提升碳酸酐酶的热稳定性[34]。二硫键可降低解旋状态下CA的构象熵，从而维持其热稳定性；而生物信息学揭示酶的刚性越强其热稳定性越强，为更高性能的碳酸酐酶工程菌的设计提供了指导。
3 脲酶与碳酸酐酶在MICP过程中的协同关系在自然情况下，CO2的水合反应速率非常低，仅为1.3×10–1/s[35]，极大限制了碳酸钙沉淀的产生，这也是MICP反应缓慢的主要原因。而自然界存在的碳酸酐酶，在其作用下CO2水合速率最高可达1.4×107/s[36]，达到自然情况下的108倍左右，因此，在其催化下可有效提升生物矿化速率。CO2水合需要经过如下历程[24]：
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(6) |
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(7) |
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(8) |
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(9) |
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(10) |
式(6) 为气态的CO2溶于水形成松散的水化CO2的过程，在碱性条件下，CO2与水反应生成H2CO3 (式7)，这也是该反应过程的限速步骤，但是碳酸酐酶可有效催化该反应。水合后的H2CO3电离出H+和HCO3– (式8)，碱性条件进一步生成CO32–和H2O (式9)，再与环境中的Ca2+生成CaCO3沉淀(式10)。
在MICP的应用研究中，目前得到公认且效果最好的是以巴氏芽孢八叠球菌为代表的脲酶水解途径，通过检索与分析其在NCBI数据库中公布的全基因组信息可以发现，与MICP密切相关的功能基因主要包括脲酶和碳酸酐酶两类。如图 5所示，在MICP过程中，脲酶的主要功能是将尿素分解为NH3和CO2，溶于水显碱性可以提高细胞微环境的pH值，而碳酸酐酶可以加速气态的CO2的水合并形成HCO3–和CO32–，为矿化物沉降提供必要条件[37]。因为巴氏芽孢八叠球菌既有脲酶也有碳酸酐酶，所以其矿化效果才是目前已发现的自然菌株中最为突出的。
碳酸酐酶可有效促进生物矿化。在自然情况下，CO2的水合反应速率相当低，极大地限制了碳酸钙沉淀的产生。但当上述反应有碳酸酐酶催化时，CO2水合速率迅速提升，可达到自然情况下的108倍。因此，生物诱导碳酸钙矿化快速沉积需要脲酶分解尿素提高环境的pH值，碳酸酐酶促进CO2的迅速水合形成大量的CO32–，进而与环境中的Ca2+形成碳酸钙沉积。
4 总结与展望MICP具有广泛的应用领域，如生态修复[38]、地基加固[39]、裂缝修补[40]、古迹保护[41]、水利工程渗漏封堵等，其最大的优势是生态相容性好[42]。其中土体加固、裂缝修补、生态修复和石质文物保护等方面最具优势，是其他传统技术无法比拟，但也存在矿化速率低、硬度低和环境适应性受限的问题，因此尚未见到大规模实际工程应用，这也为MICP的研究提供了方向。
4.1 加快生物水泥矿化速率巴氏芽孢八叠球菌虽然是生物水泥应用研究中常用菌种，但其矿化速率仍无法在较短时间内达到预期强度以满足大规模实际工程的应用。目前报道的MICP应用研究多数处于实验室研究阶段，效果还无法与常规矿物质水泥的强度相媲美，完全达到工程化要求的尚不多见，因此，需要更深入的基础研究和技术研发与完善[43-44]。为了提升生物水泥的矿化速率，MICP的研究一直围绕更高脲酶活性的菌种进行筛选[45]，以期通过加速尿素的分解来快速产生CO32–，但却忽略了菌种碳酸酐酶的活性。碳酸酐酶可以将游离态的CO2加速水合，转化为HCO3–与CO32–，如果具有MICP的微生物能够将空气中的CO2加以利用，将进一步加速CaCO3沉积[34]。目前，已经有学者已经注意到了脲酶与碳酸酐酶在CaCO3沉积过程中的协同效应[46]，如果在提升脲酶活性的基础上，同时提升碳酸酐酶的活性，并平衡好彼此的协同关系，将能够显著提升生物水泥矿化的速率[47]。
4.2 提升生物水泥的性能目前，利用MICP研发的生物水泥，因其硬度还达不到现有矿物质水泥的硬度标准，故未能在生产生活中得到大规模实际应用。因此，有学者尝试通过延长钙化时间来增加胶结体的强度，或在胶结体系中添加一些纤维材料，改进后的胶结体强度有所提升[48-49]。另外，受水泥改性研究[50-51]的启发，可尝试筛选一株既有高活性的脲酶和碳酸酐酶，又能分泌改性成分，在微生物诱导矿化的过程中，不仅会提升胶结体的硬度，并且还能赋予其很高的韧性，全面提升生物水泥的性能。
4.3 增强生物水泥的使用环境适应性由于具有MICP功能的各菌株特性各不相同，对应用环境的适应性也存在较大差异，目前利用MICP的各种应用研究基本都是在实验室模拟环境中进行的[52]，在实地应用中还缺少特别理想的自然菌株。因此，一些科学家一直致力于从自然界中筛选活性更高、适应能力更强的微生物菌种，来拓展生物水泥的应用领域。与此同时，也有一些生物学家利用合成生物学等前沿生物技术，将MICP相关的高效脲酶和碳酸酐酶基因，以及诱导调控体系的相关元件构建到环境广适底盘微生物中，构建具有广泛应用环境适应性的高效能MICP工程菌，使得生物水泥可以广泛投入到实际应用中[53]。NCBI已经公布了巴氏芽孢八叠球菌的全基因组信息，可以检索到其脲酶、碳酸酐酶基因以及调控相关功能的基因序列，为基因工程菌的构建提供了有利条件。
此外，生物水泥是有生命的，当使用了生物水泥的建筑物出现裂缝或破损时，其内部以芽孢形式存在的休眠微生物将在适宜条件下能够复苏，重新启动MICP程序，可以把裂缝重新填补，实现建筑物的自行修复[42]。如果再赋予生物水泥高韧性、耐腐蚀等常规矿物质水泥所不具备的性能，MICP将会成为一项真正新颖技术，将开启MICP研究的一个新高潮。
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