2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 张金宏, 崔志勇, 祁庆生, 侯进
- ZHANG Jinhong, CUI Zhiyong, QI Qingsheng, HOU Jin
- 解脂耶氏酵母表达调控工具的开发及天然产物合成的研究进展
- The recent advances in developing gene editing and expression tools and the synthesis of natural products in Yarrowia lipolytica
- 生物工程学报, 2022, 38(2): 478-505
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(2): 478-505
- 10.13345/j.cjb.210327
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文章历史
- Received: May 6, 2021
- Accepted: August 27, 2021
- Published: January 5, 2022
引用本文
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模式微生物(如大肠杆菌和酿酒酵母) 由于其可利用的分子生物学工具多，长期以来被认为是理想的微生物底盘。近年来，随着基因编辑技术、代谢工程和合成生物学等技术的快速发展，人们逐渐实现了对非常规微生物的编辑和代谢改造，越来越多的具有优良特性的非常规微生物成为了天然产物合成的底盘。产油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) 是非常规半子囊酵母，为公认安全微生物(generally regarded as safe, GRAS)，是优良的天然产物合成宿主[1-3]。解脂耶氏酵母对多种有机化合物、高盐浓度和pH值表现出高耐受性，可以利用多种廉价碳源，包括葡萄糖、甘油、脂类、烷烃和乙酸等底物[2]，表现出优异的油脂生产和外源蛋白分泌性能，已被用于琥珀酸、α-酮戊二酸、赤藓糖醇和β-胡萝卜素等化学品的合成。此外，解脂耶氏酵母通常具有高活性的三羧酸(tricarboxylic acid, TCA) 循环和磷酸戊糖途径，为天然产物的合成提供了大量的前体物质，同时具备更好的疏水物质(如脂质和烷烃) 转运能力[3-6]。因此，它是适于异源合成萜类、类固醇、聚酮类和黄酮类等天然产物的底盘微生物[7]。随着遗传操作工具和代谢途径改造策略的不断完善，解脂耶氏酵母将会在生物能源和高价值天然产物生物合成等过程中发挥重要作用。
1 解脂耶氏酵母的分类 1.1 生理特性解脂耶氏酵母是一种Crabtree阴性子囊菌酵母(属于Saccharomycetes类，Saccharomycetales目)，广泛存在于生态系统(土壤、海洋水域、菌根、受石油污染的环境) 和各种食物(特别是肉类和乳制品，包括奶酪) 中[8-9]。
近10年来，解脂耶氏酵母被认为属于正常的人类菌群，易于在成人的口腔和呼吸道中发现，尤其是糖尿病患者。这种酵母有时也被视为一种可能的条件致病病原体，因为它的生物膜形成能力可能是罕见的导管相关念珠菌血症的原因[8]。与大多数半子囊菌酵母不同，解脂耶氏酵母是一种专性需氧菌，氧气浓度是其生长的限制因素。其最佳生长温度在25-30 ℃之间，大多数菌株的温度限制在32-34 ℃的范围内，极少数菌株可以在37 ℃生长。解脂耶氏酵母能够在较广的pH范围内生长(pH 3.5-8.0)，少数菌株可以耐受较低的pH (2.0)甚至非常高的pH (9.7)。这种酵母还能够吸附金属原子，因此被用于含有重金属(如铬、铁、镍、铜、锌和镉) 的废物的生物修复[10]。
解脂耶氏酵母有Mat A和Mat B两种交配型，自然分离菌株多数为单倍体[11-12]。在实验室条件下[13]，两种天然Mat亲和菌株的交配频率很低，但在实验室生长条件下产生的二倍体状态是稳定的[11]。解脂耶氏酵母的野生型分离株可以呈现出各种各样的菌落特征：从光滑且有光泽到强烈皱纹且无光泽。这种多样性印证了解脂耶氏酵母是一种二态酵母，可以作为圆形多极出芽细胞、假菌丝(芽殖细胞仍附着) 或带有隔膜菌丝的菌丝体生长，具体取决于其生长条件[11-12, 14]。
1.2 功能分类解脂耶氏酵母实验室菌株的生理和系谱学早就有了广泛的描述[15]，而用于基因工程的受体菌株在以往的综述中也有总结[16-18]。解脂耶氏酵母物种的参考菌株是E150 (CLIB122)，其基因组已完全测序和注释[19]。最常用的受体菌株包括E129 (CLIB121)，Po1系列菌株(Po1d、f、g和h)[20-21]，这些菌株来源于法国农业科学院(French National Institute for Agricultural Research, INRA) 的工业相关野生型菌株W29 (CLIB89、ATCC20460和CBS7504)。E150、E129和Po1系列均为工程化菌株，由于来自酿酒酵母[17]的SUC2基因的异源表达，能够利用蔗糖作为碳源。这一特性使得其能够利用农用工业废物中的糖蜜作为廉价底物[22-23]。
作为产油酵母，有些解脂耶氏酵母菌株可以自然积累高达细胞干重(dry cell weight, DCW) 30%–50%的脂质，这不仅取决于每个野生型分离株的遗传背景，还取决于所使用的碳源和生长条件。在解脂耶氏酵母细胞中，通过基因工程改造可以使脂质积累达到DCW的90%[9]。与此同时，解脂耶氏酵母具有出色的碳氢化合物(尤其是烷烃) 降解能力，因此在生物修复中可以使用这种酵母[24-26]。
而有些解脂耶氏酵母菌株具有良好的生产有机酸或多元醇的特性。如20世纪70年代，美国辉瑞公司将解脂耶氏酵母应用于工业化柠檬酸生产。H222 (DSM 27185) 则是于20世纪80年代从德国莱比锡的土壤样品中分离出来的菌株，能够生产高水平的柠檬酸[11, 27]，也被改造用于α-酮戊二酸的生产[28-29]以及蔗糖的利用[30]等。此外，有些野生型或传统改良的解脂耶氏酵母菌株具有良好的赤藓糖醇合成能力，如中国保龄宝生物有限公司就利用解脂耶氏酵母进行赤藓糖醇生产。根据菌株特性的不同，可用于不同产品的合成。如多元醇合成菌株可用于功能糖醇的生产；缺乏酵母特异性高糖基化和甘露糖磷酸化的双突变株可被改造用于生产人源化重组蛋白[31-33]；而高油脂合成的菌株可被用于各种脂类化工产品、生物能源及不饱和脂肪酸等的合成[18, 34]。
2 解脂耶氏酵母表达系统的研究进展基因表达和调控工具是对宿主进行理性遗传和代谢改造的基础，在微生物细胞工厂的构建过程中发挥重要作用。由于解脂耶氏酵母拥有独特的生理和代谢特征，如细胞形态二态性、同源重组能力差、倾向于利用非同源末端连接进行DNA双链断裂修复，其代谢特征也非常明显，如能够利用多种底物、油脂合成能力强、乙酰辅酶A的供应充足等。在多种高附加值化合物的生物合成方面相较传统微生物底盘表现出优势，其越来越受到工业微生物领域研究人员的关注。近年来，随着各种合成生物学工具的开发，解脂耶氏酵母表达系统不断完善，人们可以实现以解脂耶氏酵母为宿主的异源基因高效表达、复杂生物合成途径的组装和基因表达水平的精准调控等。
2.1 解脂耶氏酵母中常见的表达载体及相关研究进展解脂耶氏酵母的基因组改造通常需要遗传标记，以便筛选含有特定遗传修饰的细胞。底盘细胞的迭代遗传修饰通常受宿主中可用选择标记的数量限制，因此选择标记的回收至关重要。包含选择性标记和Cre重组酶的Cre-loxP重组系统是传统而又功能强大的基因组编辑工具，可用于有效的基因组整合表达和标记回收。在早期工作中，用于解脂耶氏酵母菌株筛选的标记主要是营养缺陷型基因，包括LEU2、TRP1、URA3等[16, 35]。URA3标记不仅可以使用5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid, 5-FOA) 培养基反筛选，通过将URA3启动子截短至41 bp，可以实现目的基因的高水平表达[36]。最近，赤藓糖激酶编码基因EYK1被开发为一种解脂耶氏酵母筛选标记，它能够提高转化效率和促进转化子的生长[37]。与此同时，许多研究发现解脂耶氏酵母菌株对潮霉素B、诺尔丝菌素和博来霉素/腐草霉素等抗生素敏感[38-39]。Hamilton等鉴定了一个内源的乙酰胺酶编码基因YlAMD1，并证明该基因可以用作解脂耶氏酵母中的可循环遗传标记，在乙酰胺培养基上进行正筛选，然后在氟乙酰胺培养基上进行反筛选[40]。Edwards等研究了在细胞中编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因MET25，并将其开发为遗传标记。MET25的缺失并没有导致解脂耶氏酵母对甲硫氨酸的营养缺陷，不过培养基中补充二价铅诱导硫化铅(PbS) 后，PbS会在MET25缺失菌中聚集，使其呈棕色/黑色，而含有MET25基因的细胞呈白色，因此可用于基于颜色的筛选[41]。随着遗传标记工具库的不断扩充，将会有力推动解脂耶氏酵母遗传操作的便捷性及其代谢工程应用。
2.2 基因表达载体 2.2.1 游离型载体基因表达可以采用基因组整合表达或质粒表达等策略。选择质粒作为基因表达载体有利于快速构建，但是通常质粒的稳定性较差。酿酒酵母常见的游离质粒包括着丝粒序列(centromere, CEN) 及染色体自主复制序列(autonomously replicating sequence, ARS) 和2 μm复制序列。截至目前，解脂耶氏酵母属菌株中未发现天然游离质粒。通过染色体自主复制序列/着丝粒(ARS/CEN) 能够设计解脂耶氏酵母人工游离型载体，其在单个细胞中的拷贝数约为1–3个(图 1A)[42]。最近研究表明，在着丝粒区上游连接一个启动子能够得到增强型ARS/CEN质粒，相对质粒拷贝数和基因表达水平提高了80%，荧光强度动态范围提高了近2.7倍[43]。Lopez等研究发现，解脂耶氏酵母的ARS显示出独特的结构，该结构包括一个先前未注释的序列(spacer)，该序列将复制起点(origin, ORI) 和着丝粒元件CEN连接起来并且在调节质粒行为中起关键作用。与更普遍使用的最小化ARS相比，维持一个天然的645 bp的spacer可使基因表达产生4.5倍的增加和质粒稳定性的提高。通过测试ARS内部元件的模块性表明，质粒稳定性表现出明显的负载基因依赖性[44]。基于此游离表达体系，Bredeweg等开发了一套分子工具，以扩展解脂耶氏酵母在生物学研究和工业应用中的能力。作者首先构建了一组营养缺陷型菌株，同时敲除Ku70基因以减弱非同源末端连接。随后构建了一个多用途表达载体pYL15 (GenBank：KU378202)，该载体中包含高表达启动子EXP1，10×甘氨酸linker和sfGFP基因，待表达基因可与3′端sfGFP基因融合实现解脂耶氏酵母中目的蛋白质的亚细胞定位分析[37]。与之类似地，Dulermo等也构建了一系列具有不同强度启动子的表达载体库，可快速确定目的蛋白质的最优表达水平[45]。
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| 图 1 解脂耶氏酵母常见的表达载体示意图 Fig. 1 Schematic diagram of common expression vectors of Y. lipolytica. (A) Y. lipolytica artificial episomal vector containing autonomously replicating sequence/centromere (ARS/CEN). (B) Y. lipolytica-specific artificial chromosome ylAC, consisting of two telomere sequences TEL and one centromere, and the origin of replication are composed of the autonomously replicating sequence ARS. Using the digested ylACs plasmid and PCR amplified expression cassette to rapidly achieve in vivo assembly of ylAC modules. (C) Zeta-dependent expression vector that can mediate single-copy or multi-copy genome integration. (D) Y. lipolytica rDNA dependent multi-copy integration vector, including rDNA fragments with unique restriction sites and selection markers. |
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尽管解脂耶氏酵母具有优异的代谢能力，但依然缺乏DNA大片段组装的工具。酵母人工染色体(yeast artificial chromosomes, YACs)最早是在酿酒酵母中开发并应用于大片段DNA的插入、基因组文库构建和功能分析。在最近的一个报道中，研究人员首次在解脂耶氏酵母中设计和构建人工染色体(Y. lipolytica- specific artificial chromosome, ylAC)，以实现快速、高效的基因和染色体组装(图 1B)。通过体内组装可以将多个基因以90%的组装效率产生一条23 kb的线性染色体，并应用于纤维二糖和木糖共利用代谢途径的快速构建和优化。在使用必需基因Hem1作为天然选择压力的情况下，ylAC能够在多个世代中保持高稳定性[46]。最近，针对解脂耶氏酵母缺乏游离型表达载体的缺点，本课题组从解脂耶氏酵母线粒体DNA中挖掘和鉴定了一段516 bp的线粒体复制子mtORI，它能够介导高蛋白表达水平和遗传稳定性的环状质粒自主复制。在Po1fKu70敲除菌株中，mtORI质粒的同质性得到显著改善，最高拷贝数达到5.0个/细胞。该结果表明，线粒体来源DNA序列可用于建立高稳定性自主复制质粒，将会补充现有的解脂耶氏酵母合成生物学工具库[47]。
2.2.2 整合型载体尽管游离型载体具有操作便捷、转化效率高等优点，其遗传稳定性差的问题仍然存在。将目的基因整合到酵母基因组能够实现持续存在和稳定表达。整合型载体通常含有1个或2个与基因组序列同源的DNA区域，分别通过单交换或双交换进行同源重组。当解脂耶氏酵母作为宿主时，同源臂长度必须超过0.5-1 kb才能实现较高的靶向效率[18, 48]。而Zeta序列是一段500 bp的Ylt1-反转录转座子来源的DNA序列，Zeta序列依赖的通用整合型载体可以进行随机异位整合，并被广泛应用于解脂耶氏酵母基因和代谢途径过表达(图 1C)[49]。当结合一个启动子弱化的筛选标记时，Zeta整合载体能够实现基因的多拷贝随机基因组插入[50]。Lv等结合Cre-loxP系统的高重组效率和26S rDNA的高整合率，开发了一种迭代整合方法促进解脂耶氏酵母中多拷贝代谢途径的构建(图 1D)。以植物来源的类黄酮途径为试验平台，实现了在随机位点上的高效、多拷贝基因组整合。Cre重组酶的瞬时表达能够有效去除标记，并允许迭代基因组整合[51]。
2.3 CRISPR介导的基因组编辑系统的设计 2.3.1 同源/非同源依赖基因组编辑通常来说，定点基因组整合和敲除依赖于宿主细胞的同源重组(homologous recombination, HR) 修复。通过构建含有侧翼同源臂的供体DNA，基于HR的策略能够靶向基因组特定区域(图 2)。由于其独特的DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs) 修复路径选择倾向性，与酿酒酵母相比较，解脂耶氏酵母HR能力较弱。这导致在进行外源基因整合时，同源臂长度要求在0.5 kb (最佳长度为0.75-1 kb) 以上才能获得可接受的效率[52]。当非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ) 途径中负责DSBs修复的ku70基因缺失时，将会促进短同源臂条件下的同源重组，但是伴随有转化效率的降低[48]。最近有研究人员提出了另一种基于CRISPR干扰(CRISPR interference, CRISPRi)的策略，将9个靶向基因中的8个进行有效抑制以增强HR。通过对Ku70和Ku80基因进行多重靶向，并通过将Mxi1融合到失活的Cas9来增强抑制作用，HR效率高达90%[53]。此外，羟基脲处理能够使包括解脂耶氏酵母在内的各种酵母细胞停滞在S期，基因组靶向效率提高至90%[54]。为提高HR基因编辑的效率，Ji等将酿酒酵母中HR机制的关键成分编码基因RAD52在解脂耶氏酵母中表达，结果表明，同源臂长为1 000 bp时，该策略可实现高达95%的基因靶向效率，是野生型菌株的6.5倍，是传统ku70敲除策略的1.6倍[55]。最近，Gao等尝试通过重组机制工程以增强非常规酵母多形汉逊酵母(Ogataea polymorpha) 基于同源重组的基因编辑的能力。通过在该菌株中表达HR相关蛋白，包括来自酿酒酵母的ScSAE2、ScRAD52、ScRAD51和内源的OpRAD52，以及利用抑制型启动子下调NHEJ修复途径，使CRISPR基因编辑效率从20%-30%增加至60%-70%。上述研究对解脂耶氏酵母也具有很好的借鉴意义[56]。
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| 图 2 解脂耶氏酵母基于同源重组HR和非同源末端连接NHEJ的基因编辑系统设计原理 Fig. 2 The design principle of a gene editing system based on homologous recombination (HR) and non-homologous terminal junction (NHEJ) in Y. lipolytica. |
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尽管人们已经做了很多的努力来利用HR机制将外源DNA整合到靶向基因组位点，但由于HR修复效率较低且同源臂构建过程烦琐，解脂耶氏酵母的途径改造依然费时费力，尤其是对多基因生物合成途径而言。很早之前，人们就发现基于Ylt1逆转录转座子Zeta序列的表达载体可以在不含有该转座系统的菌株(例如W29及其衍生菌株) 中进行随机整合，推测这一现象是由解脂耶氏酵母自身NHEJ修复机制造成的(图 2)。基于Zeta序列已经开发出一系列随机整合型载体并用于代谢途径改造。近期，本课题组研究发现非同源DNA片段能够在NHEJ介导下高效插入至解脂耶氏酵母基因组中，由于整合基因拷贝数和基因组位点不同，整合菌株表现出明显的基因表达水平差异。据此，我们开发了非同源依赖的随机基因组整合策略用于表达文库的构建和筛选。作为验证，构建了脂肪酶基因LIP2和β-胡萝卜素合成途径表达文库，并通过高通量筛选获得了高产工程菌株[57]。该结果证明了非同源依赖的基因组整合对于构建多基因代谢途径和模块化表达文库有很大的潜力，能够促进解脂耶氏酵母代谢工程应用。最近，Bai等通过调节NHEJ修复途径，使用有缺陷的URA3标记和优化迭代转化，在解脂耶氏酵母中建立了一种高效的NHEJ介导的基因组文库技术，使基因整合效率提高了22.74倍[58]。尽管NHEJ依赖的随机基因组整合具有高效、便捷等优点，能够快速产生基因插入文库用于宿主菌株的代谢途径改造，但是该方法具有基因整合位点和拷贝数随机性，不仅需要进行后续基因组定位和拷贝数分析，而且有可能造成宿主基因组必需基因的插入失活。因此，我们进一步借助CRISPR/Cas9系统和NHEJ修复在解脂耶氏酵母开发一种非同源依赖的定点基因组编辑方法(图 2)。通过优化Cas9的切割效率、调控DNA修复保真性和细胞周期同步化，靶向基因组整合效率达到了55%[59]。来自德克萨斯州立大学奥斯汀分校的研究团队使用密码子优化的高活性piggyBac转座酶(hyperactive piggyBac transposase, hyPBase)，证实了解脂耶氏酵母体内转座。当两侧连接piggyBac反向末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR)时，DNA序列(即选择标记或整合盒) 可以从复制型载体调动并插入到解脂耶氏酵母基因组中。该转座系统用于构建解脂耶氏酵母全基因组插入突变文库，结合一系列营养缺陷型或显性筛选标记，也被用于构建整合载体。然而，piggyBac整合不是在基因组中完全随机发生，而是靶向TTAA序列(存在于不到2/3的已注释解脂耶氏酵母编码序列，并且倾向于活跃转录区域)，这限制了全基因组插入诱变的应用[39]。
2.3.2 CRISPR介导的基因组整合CRISPR系统可以诱导基因组特定位点产生DSBs，然后可以在存在同源供体DNA的情况下进行HR修复，也可以实施不依赖供体DNA的NHEJ修复(图 2)。在解脂耶氏酵母等重要工业菌株中构建高效的基因组编辑工具CRISPR/Cas系统，对于降低遗传操作难度、缩短改造周期具有十分重要的意义。最近，基因组编辑工具CRISPR已被改造用于解脂耶氏酵母中非遗传标记依赖的基因整合和缺失。Schwartz等首次在解脂耶氏酵母中开发了CRISPR-Cas9基因组编辑工具[60]，并且发现Ⅲ型RNA聚合酶复制向导RNA的转录时，单基因敲除效率高达92%。当NHEJ被失活后，DNA片段基因组整合效率约为100%。该研究小组进一步开发了一种基于CRISPR-Cas9的基因组整合工具，可将无标记的目标基因迭代整合到解脂耶氏酵母基因组中，同时快速构建了一条半合成番茄红素生物合成途径。最近，T7聚合酶也被用于解脂耶氏酵母的向导RNA (guide RNA, gRNA) 转录，以使CRISPR/Cas9介导的敲除效率达到60%[61]。这些研究初步显示出了CRISPR-Cas9编辑技术的潜力，但是仍然需要进一步优化提高基因组整合效率。Schwartz等开发了一种全基因组突变筛选策略来量化单个sgRNA在基因组规模文库中的切割效率，鉴定出覆盖94%基因的高效sgRNA[62]。Borsenberger等通过提取胞内sgRNA测序发现，sgRNA的表达，尤其是靶序列5′末端的碱基错配，是产生功能性核糖核酸蛋白复合物的限制因素[63]。Holkenbrink等介绍了适用于解脂耶氏酵母的EasyCloneYALI遗传工具箱，该工具箱可在CRISPR/Cas9的帮助下将基因表达载体无标记整合到特定的基因组位点。使用非复制型DNA修复片段(例如DNA寡核苷酸) 转化酵母可实现80%以上的基因组编辑效率[38]。近期，Gao等开发了同源依赖的末端连接(homology mediated end joining, HMEJ) 方法，通过一对sgRNA同时切割基因组2个位点实现基因组敲除和整合，利用短同源臂时靶向效率是HR的2倍。这种双重切割策略对于长度不超过3.5 kb的基因的编码区和非编码区都非常有效。此外，在PEX10位点上证实了基于HR或HMEJ的DNA切割辅助整合的可行性。因此，这种基因切除方法可以与基于HMEJ的基因整合方法相结合，巩固和加快代谢工程的发展[64]。
与Cas9不同，Cpf1主要识别富含T的PAM(TTTN) 位点，并在目标序列的下游切割DNA产生黏性末端，从而可以对同一遗传靶标进行重复编辑来提高靶向编辑效率。与此同时，CRISPR-Cpf1具有简化的crRNA结构，可以作为CRISPR/Cas9编辑系统的有力补充。为了证明CRISPR-Cpf1在解脂耶氏酵母中的实用性，Yang等优化了CRISPR-Cpf1系统并实现了两个反向选择标记精氨酸通透酶(约为93%) 和乳苷5′-磷酸脱羧酶(约为96%) 的高效编辑，三重基因组靶标(CAN1-URA3-MET25) 的编辑效率达到41.7%[65]。与此同时，Ramesh等描述了一个双重功能的CRISPR-Cpf1系统，它能够同时进行基因编辑和基因调控[66]。使用截短的gRNA可抑制Cpf1核酸酶活性并用于基因的激活与抑制，长度为23-25 bp的gRNA可实现高效基因组编辑。
2.4 基因表达和调控工具 2.4.1 组成型启动子微生物细胞工厂的创建通常需要一系列精准表征的天然或者人工合成启动子元件。Wong等建立了一套基于荧光素酶报告基因的高灵敏系统，以表征一组(共12个) 天然启动子[67]。他们发现TEF1启动子表现出最强的表达水平，而来自TCA循环、糖酵解、戊糖磷酸途径和脂质氧化途径的其他11个启动子表现出的相对转录活性范围为TEF1启动子活性的0.7%至29.7%。近年来，大量研究通过人工设计和重构上游激活序列(upstream activation sequence, UAS) 和核心启动子来生成拥有强大表达活性的杂合启动子，其对于任何宿主的异源基因表达和代谢途径改造都是必不可少的。在解脂耶氏酵母早期研究中，人们就通过对XPR2p序列剖析发现其上游激活序列(UAS) 不受培养条件的限制，从而设计了杂合启动子hp4d[20]。hp4d启动子的表达具有很明显的时序性，有助于异源蛋白的高效表达和分泌，已成为应用最广泛的启动子之一。Blazeck等发现解脂耶氏酵母中的UAS可以发挥增强子的作用，UAS区域的多拷贝串联可以普遍用于增加启动子的表达水平[68]。该团队随后鉴定了解脂耶氏酵母天然TEF启动子中的假定UAS元件，并通过组合不同的UAS元件从头开发了一系列具有不同表达强度的解脂耶氏酵母的杂合启动子文库，其最高表达水平比强组成型TEF启动子高出近7倍。与此同时，Shabbir等对解脂耶氏酵母的启动子结构进行了系统研究，结果表明，启动子的强度可以通过TATA盒序列，核心启动子和上游激活序列的改造进行微调。该工作不仅开发了一组新的杂合启动子，同时为解脂耶氏酵母的代谢工程应用提供了有效的启动子改造策略[69]。
2.4.2 诱导型启动子与生物传感器作为次级调控方式，诱导型启动子为基因表达提供了时序控制维度，这有助于工业发酵中的生长和生产阶段的解偶联。最早被挖掘和使用的解脂耶氏酵母诱导型启动子主要来自油脂代谢相关基因，例如POX2和POT1等，它们受油酸、烷烃等底物的诱导并被葡萄糖和甘油完全抑制[15]。通过分析已公开的解脂耶氏酵母转录组数据，Kamineni等鉴定了4个天然启动子，它们从生长到脂质积累的过渡过程中会发生下调[70]。随后，这些启动子被用于控制2个去饱和酶基因的表达，从而可以在脂质积累阶段改变细胞脂质谱，而无需培养添加剂。Trassaert等分离并表征了编码赤藓糖激酶的EYK1基因的启动子，赤藓糖醇和赤藓糖的存在大大增加了EYK1启动子的诱导水平[71]。通过鉴定上游激活序列UAS1EYK1，并构建包含UAS1XPR2或UAS1EYK1串联重复序列的新杂合启动子，实现了更高表达水平和更精细的剂量依赖性诱导表达。在另外一项研究中，Park等通过在赤藓糖醇分解代谢相关EYD1和EYK1的启动子区域内的系统发育足迹识别了4个保守的顺式调控模块(cis-regulatory modules, CRMs)，并发现4个上游激活序列参与了赤藓糖醇依赖的启动子诱导表达[72]。最终成功开发了强度可变的赤藓糖醇诱导型启动子，其强度范围从0.1 SFU/h到457.5 SFU/h，该杂合启动子可用于解脂耶氏酵母基因表达水平的调节。最近，Xiong等分离得到若干个Cu2+诱导型启动子和抑制型启动子[73]。工程化设计了6个Cu2+诱导型启动子，通过串联上游激活序列提高其动态调控范围。工程化Cu2+诱导型启动子已成功用于新型生物产物蜡酯生产途径的构建。以解脂耶氏酵母为宿主开发新的合成启动子的持续努力，将进一步增强解脂耶氏酵母基因表达控制能力，扩展其应用领域。
生物传感器是指一类能够识别并响应特定的胞内或胞外信号(如某种代谢物的变化)，并将其转化为输出信号的基因回路。生物传感器能够监控细胞生理和代谢变化，被广泛应用于代谢途径动态调节和高产菌株的高通量筛选。截至目前，解脂耶氏酵母中生物传感器的构建和应用案例仍然较少。Lv等在深入研究天然启动子POX2的基础上设计了一种人工脂肪酸诱导型启动子，并与CRISPRi元件结合以抑制油脂生成途径[74]。与此同时，作者首次将异源的柚皮素转录激活因子FdeR及其同源的DNA结合位点FdeO引入解脂耶氏酵母，所构建的人工启动子均可被柚皮素诱导(响应范围为0 mg/L至50 mg/L)。类黄酮敏感的杂合启动子用于控制亮氨酸的合成，赋予工程菌株以柚皮素依赖的选择性细胞生长优势。最终，通过将化学成瘾与负的自动调节性遗传回路相结合来提高工程菌株的代谢稳定性和柚皮素产量。
2.4.3 CRISPR系统依赖的基因表达调控除了在基因组编辑中发挥重要作用之外，基于CRISPR系统的基因调控手段具有在很大的动态范围内进行高选择性转录调节的能力。其中，CRISPRi系统主要涉及2个部分：内切核酸酶活性缺失的特异性核酸酶和gRNA。Zhang等基于核酸酶缺陷dCas9和dCpf1在解脂耶氏酵母中建立了CRISPRi系统，同时借助Golden-brick一步组装技术开发多重gRNA策略[75]。与此同时，Schwartz等筛选了一系列用于解脂耶氏酵母的异源转录激活域，最成功的是合成的激活因子VPR融合到dCas9以创建功能性CRISPR激活(CRISPR activation, CRISPRa)系统。随后，通过CRISPRa系统激活2个天然β-葡萄糖苷酶基因的表达，实现了以纤维二糖作为唯一碳源的细胞生长改善[76]。通过对向导RNA间隔区长度的研究，Ramesh等发现当其截断至16 nt时，可抑制Cpf1核酸酶活性，而不影响与靶基因位点的结合。基于该实验结果，作者将Cpf1与转录调节因子融合实现目的基因的激活和抑制。使用Cpf1-Mxi1融合蛋白可实现mRNA水平降低7倍，而Cpf1-VPR的CRISPR激活使hrGFP表达提高10倍[66]。
3 解脂耶氏酵母天然产物合成研究进展解脂耶氏酵母是天然的产油微生物，近年来随着人们对解脂耶氏酵母代谢特征的理解，以及高效遗传工具的发展，已经有越来越多的工作对其代谢途径进行重编程来生产天然产物[77]。
产油特性使得它在营养限制条件下可以积累大量的中性脂质(> 20% W/W)。通过代谢工程改造，目前最好的工程菌株脂质生产效率可达1.2 g/(h·L)，其脂质含量达到细胞干重的90%[78]。
解脂耶氏酵母天然不产生萜类、黄酮类和聚酮类等天然产物，但是它作为复杂天然产物合成的底盘细胞具有以下几点优势[79-80]：首先，解脂耶氏酵母可以产生充足的胞质乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A以实现油脂的大量积累，而乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A同样可以作为萜类、黄酮类等高价值天然产物的合成前体；其次，解脂耶氏酵母拥有较高的磷酸戊糖途径代谢通量，能够提供大量生物合成所需的NADPH；为了储存过量的疏水性油脂，解脂耶氏酵母胞内含有丰富的脂滴亚细胞结构，可以为类胡萝卜素疏水性产物等物质提供储存场所；最后，解脂耶氏酵母具有优良的鲁棒性，对很多毒性产物(如柠檬烯等) 具有较好的耐受性。
3.1 增强关键前体物质乙酰辅酶A的供应乙酰辅酶A是一种重要的中心代谢物，参与脂肪酸、固醇、氨基酸等的生物合成以及DNA、蛋白质乙酰化调控等多种生理和代谢活动。此外，乙酰辅酶A是萜类、黄酮和聚酮等高价值天然产物生产的前体物质。因此保障乙酰辅酶A的充足供应不仅有助于目的代谢产物的积累，而且能够减少对微生物宿主代谢网络的影响。与原核生物不同，酵母中乙酰辅酶A的产生和运输受亚细胞分区的阻隔，其合成分布于线粒体、过氧化物酶体和细胞质中。由于绝大多数天然产物生物合成途径位于细胞质，胞质乙酰辅酶A的合成通常是天然产物高产的决定因素。
在解脂耶氏酵母中，胞质乙酰辅酶A的合成主要是在ATP-柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL) 催化下，柠檬酸裂解产生并主要进入脂质合成代谢途径。在碳源过量和限氮培养条件下，解脂耶氏酵母细胞中的AMP脱氨酶(AMP deaminase, AMPD) 被激活，并引起细胞内AMP的快速下降。这导致TCA循环中的异柠檬酸脱氢酶失活和柠檬酸的积累。线粒体内的柠檬酸通过线粒体膜中特定的转运蛋白转运至细胞质中，参与乙酰辅酶A的合成。因此，胞质乙酰辅酶A的合成受培养条件的调控，且合成通量较高，有利于乙酰辅酶A衍生物的合成。Markham等通过4种不同的代谢工程策略增加乙酰辅酶A前体形成，结果发现丙酮酸支路途径(丙酮酸脱羧酶PDC、乙醛脱氢酶ALD、乙酰辅酶A合酶ACS) 和β-氧化途径的强化对胞质乙酰辅酶A合成的增加最为显著(图 3)，通过上述途径的超表达促进三乙酸内酯(triacetate lactone, TAL) 的合成，使TAL产量达到了35.9 g/L[81]。同样以最简单的聚酮化合物TAL作为目标代谢物，Liu等证明了解脂耶氏酵母中乙酸利用途径(乙酰辅酶A羧化酶ACC1，苹果酸酶MAE1) 和细菌衍生的胞质丙酮酸脱氢酶PDH可以作为乙酰辅酶A合成的替代途径[82]。最近，磷酸转酮酶(phosphoketolase, PK) 和磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase, PTA) 组成的PK-PTA途径被引入解脂耶氏酵母以增加胞质乙酰辅酶A供应。作为代谢中间体，乙酰辅酶A在细胞质中迅速耗尽，因此，乙酸盐(乙酰辅酶A的衍生物) 被用作指示乙酰辅酶A产生的指标。作为指示标记的乙酸盐积累相比对照明显提高，终产物β-紫罗兰酮的产量提高了2.5倍。值得注意的是，该乙酰辅酶A合成途径具有更高效的碳利用效率，仅需4步即可利用1 mol葡萄糖产生3 mol乙酰辅酶A，而天然途径中1 mol葡萄糖在细胞质最多只能产生2 mol乙酰辅酶A，且需要14个步骤[83]。
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| 图 3 代谢工程策略促进解脂耶氏酵母胞质乙酰辅酶A的合成 Fig. 3 Metabolic engineering strategies promote the synthesis of cytoplasmic acetyl-coenzyme A in Y. lipolytica. PK：磷酸转酮酶；PTA：磷酸转乙酰基酶；PDC：丙酮酸脱羧酶；ALD：乙醛脱氢酶；ACS：乙酰辅酶A合酶；PEX10：过氧化物酶体基质蛋白；POX：酰基辅酶A氧化酶；PDH：丙酮酸脱氢酶；ACL：ATP-柠檬酸裂解酶；AMPD：AMP脱氨酶；TAG：三油酸甘油酯 PK: phosphoketolase; PTA: phosphotransacetylase; PDC: pyruvate decarboxylase; ALD: aldehyde dehydrogenase; ACS: acetyl-CoA synthase; PEX10: peroxisome matrix protein; POX: acyl-CoA oxidase; PDH: pyruvate dehydrogenase; ACL: ATP-citrate lyase; AMPD: AMP deaminase; TAG: triacylglycerol. |
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| 图 4 解脂耶氏酵母中萜类化合物的生物合成途径 Fig. 4 Biosynthetic pathway of terpenoids in Y. lipolytica. ERG10：乙酰辅酶A乙酰基转移酶；ERG13：羟甲基戊二酰辅酶A合酶；HMG1：羟甲基戊二酰辅酶A还原酶；ERG12：甲羟戊酸激酶；ERG8：磷酸甲羟戊酸激酶；ERG19：二磷酸丙戊酸脱羧酶；IDI：异戊烯基焦磷酸异构酶；GPPS：牻牛基焦磷酸合酶；ERG20：法呢烯焦磷酸合酶；SQS1/ERG9：法呢基焦磷酸法尼基转移酶；LS：柠檬烯合酶；FS：法呢烯合酶；CnVS：瓦伦烯合酶；CYP706M1：诺卡酮合酶；ADS：紫穗槐二烯合酶；GGS1/CrtE：香叶基二磷酸合酶；CarRP：并苯合酶/番茄红素环化酶；CarB：八氢番茄红素脱氢酶；CrtI：番茄红素合酶；CrtB：八氢番茄红素合成酶；CCD1：类胡萝卜素裂解双加氧酶1；CrtW：β-胡萝卜素酮醇酶；CrtZ：β-胡萝卜素羟化酶；ERG1：角鲨烯环氧酶；RcLUS：蓖麻羽扇豆醇合成酶；CYP：细胞色素P450；CPR：细胞色素P450还原酶；CYP716A12：齐墩果酸合酶；ATR1：NADPH-细胞色素P450还原酶 ERG10: acetyl-CoA C-acetyltransferase; ERG13: hydroxymethylglutaryl-CoA synthase; HMG1: hydroxymethylglutaryl-CoA reductase; ERG12: mevalonate kinase; ERG8: phosphomevalonate kinase; ERG19: diphosphomevalonate decarboxylase; IDI: isopentenyl-diphosphate isomerase; GPPS: geranylgeranyl diphosphate synthase; ERG20: farnesyl-diphosphate synthase; SQS1/ERG9: farnesyl-diphosphate farnesyltransferase; LS: limonene synthase; FS: farnesene synthase; CnVS: valencene synthase; CYP706M1: nokadone synthase; ADS: amorphadiene synthase; GGS1/CrtE: geranylgeranyl-diphosphate synthase; CarRP: phytoene synthase/lycopene cyclase; CarB: phytoene dehydrogenase; CrtI: lycopene synthase; CrtB: phytoene synthase; CCD1: carotenoid-cleaving dioxygenase 1; CrtW: β-carotene ketolase; CrtZ: β-carotene hydroxylase; ERG1: squalene monooxygenase; RcLUS: lupeol synthase; CYP: cytochrome P450; CPR: cytochrome P450 reductase; CYP716A12: oleanolic acid synthase; ATR1: NADPH-cytochrome P450 reductase. |
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| 图 5 黄酮类及芳香族衍生物的生物合成途径 Fig. 5 Biosynthetic pathway of flavonoids and aromatic derivatives. E4P：赤藓糖-4-磷酸；DAHP：3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸；PHBA：对羟基苯甲酸；HQ：对苯二酚；Tyr：酪氨酸；ACC：乙酰辅酶A羧化酶；ARO：五功能芳香族化合物合成相关蛋白；PHA2：苯甲酸酯脱水酶；PAR4：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；2-PS：2-吡喃酮合酶；DHCR7：7-脱氢胆固醇还原酶；ERG4：C-24固醇还原酶；UbiC：分支酸丙酮酸裂解酶；MNX1：4-羟基苯甲酸酯1-羟化酶；AS：对苯二酚葡糖基转移酶；TYR1：苯甲酸脱氢酶；TAL：酪氨酸解氨酶；4CL：4香豆酸-辅酶A连接酶；CHS：查尔酮合成酶；CHI：查尔酮异构酶；F3'H：类黄酮3′-羟化酶；CPR：细胞色素P450还原酶；F3H：黄烷酮3-羟化酶；STS1：白藜芦醇合酶 E4P: erythrose-4-phosphate; DAHP: 3-deoxy-D-arabino-heptanose-7-phosphate; PHBA: p-hydroxybenzoic acid; HQ: hydroquinone; Tyr: tyrosine; ACC: acetyl-CoA carboxylase; ARO: pentafunctional AROM polypeptide; PHA2: prephenate dehydratase; PAR4: phenylacetaldehyde reductases; 2-PS: 2-pyrone synthase; DHCR7: 7-dehydrocholesterol reductase; ERG4: delta24(24(1))-sterol reductase; UbiC: chorismate pyruvate-lyase; MNX1: 4-hydroxybenzoate 1-hydroxylase; AS: hydroquinone glycosyltransferase; TYR1: benzoate dehydrogenase; TAL: tyrosine ammonia lyase; 4CL: 4-coumaric acid-CoA ligase; CHS: chalcone synthase; CHI: chalcone isomerase; F3'H: flavonoid 3′-hydroxylase; CPR: cytochrome P450 reductase; F3H: flavanone 3-hydroxylase; STS1: resveratrol synthase. |
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解脂耶氏酵母可以积累大量的储存脂质，并具有生产多不饱和脂肪酸和其他生物燃料脂质的巨大潜力。通过逆向分析哺乳脂肪细胞的表型，Qiao等确定了δ-9硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearyl CoA desaturase, SCD) 是解脂耶氏酵母脂质合成途径限速步骤，同时过表达SCD、乙酰辅酶A羧化酶ACC1和二酰基甘油酯酰基转移酶(diacylglyceryl acyltransferase, DGA1) 得到一株脂质高产菌株，该菌株脂质产量约为55 g/L且碳转化率达到理论转化率的84.7%[84]。此外，Liu等采用一种进化代谢工程方法，将脂质合成与漂浮细胞富集联系在一起，通过迭代过程进化将出发菌株的产量提高55%，脂质产量和含量分别为39.1 g/L和87%[85]。这些研究结果证明，工程化解脂耶氏酵母能够高效生产脂质，同时展现了其在其他油脂衍生化学品生物合成中的巨大潜力。为了最大限度地捕获由底物分解代谢产生的电子，从而提高底物到产物的产量，Qiao等采用将糖酵解NADH转化为脂质生物合成前体NADPH或乙酰辅酶A的策略设计了13株解脂耶氏酵母菌株，最佳工程菌株的脂肪酸甲酯生产力达到了1.2 g/(L·h)[86]。
多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs) 由于其独特的结构而具有重要的生理功能，对人体健康具有重要意义。典型的PUFAs包括ω-6化合物γ-亚麻酸(gamma linolenic acid, GLA) 和花生四烯酸(arachidonic acid, ARA)，以及ω-3化合物二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA) 和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)。但它们的传统来源包括动物和植物，已经无法满足需求，因此通过代谢改造一些产油微生物来合成PUFAs[87]。目前利用解脂耶氏酵母菌株生产EPA已经实现商业化。Xue等在解脂耶氏酵母中过表达一系列去饱和酶和延伸酶，使得工程菌株产生了占干细胞重量15%的EPA。同时发现过氧化物酶体生物发生相关基因PEX10的失活对于获得高EPA产量至关重要，并可能有助于增加其他具有商业价值的脂类产品的产量[34]。共轭亚油酸(conjugated linoleic acid, CLA) 对于人体健康益处良多，比如预防癌症、抗动脉粥样硬化和抗肥胖症作用以及免疫系统的调节等。Zhang等在解脂耶氏酵母中使用hp16d强启动子和多拷贝整合质粒共表达了来自高山被孢霉(Mortierella alpina) 的Δ12去饱和酶和亚油酸异构酶，经基因改造的解脂耶氏酵母产生的反式-10，顺式-12-CLA的含量约占总脂肪酸的10%和DCW的0.4%。此外，在生长培养基中也检测到了高达0.9 g/L的反式-10，顺式-12-CLA。当用大豆油培养重组酵母时，反式-10，顺式-12-CLA的累积量达到总脂肪酸的44%，即30%的DCW[88]。随着分子生物学和基因工程工具的迅速发展，解脂耶氏酵母代谢工程为脂质的过量生产提供了有效的平台。但是，解脂耶氏酵母中脂质产生的调控可能比已知的更为复杂，与脂质生产相关的大量酶具有多种功能和复杂的调节机制。在不久的将来，要在代谢工程化的解脂耶氏酵母中实现脂质的工业化生产也是一个巨大的挑战。
3.3 萜类化合物合成萜类化合物及其衍生物可以被用于生物燃料、香料、防腐剂和药品等的工业生产，并因其极大的商业价值而受到广泛关注。与解脂耶氏酵母相比，酿酒酵母具有清楚的遗传背景和完善的遗传操作工具，因此早期研究中研究人员倾向使用其作为萜类化合物的合成宿主。其中，青蒿素前体的酵母生物合成与商品化推广是一个经典案例，Westfall等优化了酿酒酵母中的甲羟戊酸途径，实现了高水平的紫穗槐二烯和青蒿酸的合成[89]。近年来，解脂耶氏酵母逐步被进行代谢改造用于单萜、倍半萜类、三萜类和四萜类等化合物的生产。有趣的是，由于内源甲羟戊酸途径为萜类合成提供更多的香叶基焦磷酸(geranyl diphosphate, GPP)、法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP) 和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate, GGPP) 等前体，此外，胞内丰富的脂滴为疏水性产物提供储存场所，解脂耶氏酵母展现出优异的萜类化合物生物合成能力[90]。随着代谢工程和合成生物学策略的不断发展，解脂耶氏酵母将会成为一种用于萜类化合物高效生产的微生物细胞工厂。
α-法呢烯(α-farnesene) 是最简单的无环倍半萜烯之一，是一种在植物防御中具有重要功能的化合物，在蚜虫和白蚁中起到危险警报以及定位信号的作用。α-法呢烯正在被开发作为生物燃料的前体以及潜在的生物喷射燃料候选物。Yang等将含有tHMG1、IDI、ERG20和密码子优化的α-法呢烯合酶(α-farnesene synthase, OptFS) 基因的组合过表达载体整合到解脂耶氏酵母Po1h的基因组中，该重组菌株在摇瓶和发酵罐培养基中分别产生约57 mg/L和260 mg/L的α-法呢烯[91]。最近，本课题组运用非同源依赖随机基因组整合技术，构建了甲羟戊酸途径表达文库并筛选获得一株甲羟戊酸高产解脂耶氏酵母菌株。在此基础上，通过迭代整合甲羟戊酸途径的所有基因及α-法呢烯合成酶基因，分批补料发酵中工程菌株可产生25.5 g/L的α-法呢烯[92]。这是已报道的解脂耶氏酵母生产萜类化合物的最高产量。(+)-诺卡酮((+)-nocaketone)是一种备受欢迎的倍半萜类化合物，天然存在于葡萄柚(Citrus paradisi) 和柚子(Citrus grandis) 等植物中。由于其特殊的气味特性和较低的气味阈值，(+)-诺卡酮被广泛用于香料，化妆品和食品行业。最近，Guo等通过共表达(+)-瓦伦烯合酶((+)-valencene synthase, CnVS)，(+)-诺卡酮合成酶((+)-nocaketone synthase, opCYP706M1)和NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase, opAtCPR1) 异源生物合成(+)-诺卡酮。通过蛋白融合和增强甲羟戊酸代谢途径通量，最终工程菌株实现的(+)-诺卡酮产量为978.2 µg/L。这项研究为P450酶在解脂耶氏酵母中的高效表达以及构建天然产物代谢途径提供了范例[93]。紫穗槐二烯(amorphadiene) 是青蒿素的直接倍半萜烯烃前体，它是通过紫穗槐二烯合酶(amorphadiene synthase, ADS) 的作用从FPP前体衍生而来的。Marsafari等发现解脂耶氏酵母中羟甲基戊二酰辅酶A (hydroxymethylglutaryl- CoA, HMG-CoA)和乙酰辅酶A的供应是紫穗槐二烯生产的2个限制瓶颈。通过组合抑制脂肪酸合酶和激活脂肪酸降解途径，紫穗槐二烯产量提高到了171.5 mg/L。该研究结果表明，平衡碳通量和控制前体竞争途径是改善解脂耶氏酵母中萜类化合物合成的关键因素[94]。
柠檬烯(limonene) 是众所周知的环状单萜，是香精和香料行业中最重要和广泛使用的萜类之一。从植物中提取柠檬烯及其衍生物的商业化生产受到市场供应不稳定的困扰，而这些化合物的化学合成又受到高能耗和污染物排放的阻碍。微生物的异源生物合成为柠檬烯及其衍生物的可持续供应提供了一种有前景的替代方法。另一方面，柠檬烯具有较强细胞毒性，这对提高柠檬烯产量提出了严峻的挑战。代谢工程策略，如过表达前体途径酶，已被用于提高柠檬烯产量[95]。解脂耶氏酵母中编码胞质甲羟戊酸(mevalonate, MVA) 途径，能够提供类异戊二烯前体异戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)用于萜类生物合成。Cao等在解脂耶氏酵母中异源优化表达了编码neryl二磷酸合酶1 (neryl diphosphate synthase 1, NDPS1) 和柠檬烯合酶(limonene synthase, LS) 的2个基因，同时过表达MVA途径中关键酶基因，在优化丙酮酸和十二烷浓度下，最终工程菌株柠檬烯产量为23.56 mg/L[96]。Arnesen等以解脂耶氏酵母为平台菌株生产过量的单萜类、倍半萜类、二萜类、三萜类和四萜类。通过表达紫苏(Perilla frutescens) 来源的柠檬烯合成酶，单萜类平台菌株柠檬烯产量为35.9 mg/L，比相同条件下未表达甲戊酸途径的菌株提高了100倍[97]。Cheng等引入了藿香(Agastache rugosa) 来源的柠檬烯合成基因，该基因导致了柠檬烯产量的增加，并进行了进一步的优化研究。以甘油为碳源，并选择柠檬酸作为辅助碳源，在优化培养基上进行补料分批发酵，获得工程菌株柠檬烯产量为165.3 mg/L，是迄今柠檬烯产量最高的解脂耶氏酵母菌株[98]。
齐墩果酸(oleanolic acid) 是一种三萜类化合物，以其抗氧化活性而闻名。Li等通过过表达甲羟戊酸途径中关键基因，同时将细胞色素P450酶CYP716A12与NADPH-P450还原酶ATR1进行蛋白融合，使解脂耶氏酵母的齐墩果酸产量增加至540.7 mg/L[99]。这项研究显示了以解脂耶氏酵母为平台生产高价值三萜类化合物的可行性。桦木酸(betuinic acid) 是另外一种植物来源的五环戊烷型三萜，具有抗病毒、抗肿瘤和抗其他代谢物综合征等多种药理活性。Jin等应用一种多模块代谢工程策略系统改造解脂耶氏酵母，以生产桦木酸及其相关三萜化合物。作者首先筛选和过表达了25种外源细胞色素P450单加氧酶和NADPH-细胞色素P450还原酶组合，然后过表达内源的甲羟戊酸、乙酰辅酶A生成和氧化还原辅因子供应模块，摇瓶培养中桦木酸和总的三萜产量分别达到51.8 mg/L和204.9 mg/L[100]。原人参二醇(protopanaxadiol) 是一种天然的C30类异戊二烯，表现出抗癌、抗肿瘤、抗病毒和抗生素等特性，具有重要的医学应用和商业价值。Wu等通过引入一条异源的木糖利用途径，并且过表达异源原人参二醇生物合成途径，构建可以利用木糖作为唯一碳源生产原人参二醇的解脂耶氏酵母工程菌株。随后，作者利用包括调控辅因子平衡、增强前体物供应和增强木糖代谢速率等代谢工程策略进一步促进了原人参二醇合成。在分批补料发酵中，木糖作为底物的原人参二醇产量达到了300 mg/L[101]。羽扇豆酚(lupeol) 是一种五环三萜烯，是从2, 3-氧化角鲨烯转化为一系列卢潘烷型三萜类化合物的重要中间代谢产物，由于其抗HIV、抗癌和抗炎活性，受到了越来越多的关注。最近，Zhang等报道了通过过表达Δ9-脂肪酸去饱和酶OLE1以及干扰磷脂酸磷酸酶PAH1和二酰基甘油激酶DGK1来控制解脂耶氏酵母脂质成分，两种表型都加速了有毒产物向细胞外的运输，并最终刺激了三萜类化合物羽扇豆酚的合成能力，摇瓶中总产量为411.72 mg/L，比初始菌株提高了33.2倍[102]。
类胡萝卜素是一类重要且多样化的脂肪族C40分子，具有抗氧化作用，在营养和健康中具有多种应用。番茄红素(lycopene) 是一种结构相对简单的类胡萝卜素，是合成大多数其他类胡萝卜素化合物的起点。在最近的一项工作中，Schwartz等验证了一系列宿主和途径改造策略以提高解脂耶氏酵母的番茄红素生产。其中，甲羟戊酸途径的过表达和营养缺陷型的回补被证明是最有效的措施，在1 L生物反应器中工程菌株产生21.1 mg/g DCW的番茄红素[103]。Zhang等发现番茄红素合成途径基因的拷贝数和AMPD的过表达能够显著影响番茄红素产量，其含量达到(46-60) mg/g DCW[104]。与此同时，Luo等通过异源表达CHK和IPK基因引入两步异戊烯醇利用途径，增加解脂耶氏酵母中IPP及其异构体DMAPP的产生[105]。异戊烯醇利用途径产生的IPP和DMAPP含量比天然甲羟戊酸途径提高15.7倍，从而更好地用于番茄红素的合成。将这些代谢工程策略与进一步发酵优化相结合，最终获得了4.2 g/L的番茄红素。β-胡萝卜素(β-carotene) 是一种橙色颜料，可以作为着色剂、抗氧化剂和维生素前体。Gao等将来自毛霉菌(Mucor circinelloides)的双功能酶八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶(phytoene synthase/lycopene cyclase, CarRP) 和八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase, CarB) 引入解脂耶氏酵母，实现了β-胡萝卜素的合成。随后，从乙酰辅酶A到β-胡萝卜素的11个基因被过表达，同时首次探究了途径基因拷贝数对代谢终产物积累的影响。在补料分批发酵中，所得改造菌株可消耗233 g/L葡萄糖产生4 g/L的β-胡萝卜素[35]。随后，Larroude等首次证实脂质生产菌株相比于野生型菌株更适宜于β-胡萝卜素生产，同时利用Golden Gate DNA组装方法对代谢途径中基因的表达启动子进行筛选。作者同样使用了多拷贝整合策略提高GGS1、HMG1、CarB和CarRP的表达，β-胡萝卜素产量达到了6.5 g/L和90 mg/g DCW，这是迄今为止微生物合成β-胡萝卜素的最高纪录[106]。虾青素(astaxanthin) 是一种红色的类胡萝卜素，主要用作食品和饲料添加剂。Kildegaard等最先改造解脂耶氏酵母代谢途径以产生虾青素。首先，他们将红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous) 的双功能八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶和八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase, CrtI) 引入解脂耶氏酵母基因组。优化了HMG1和GGS1/crtE的活性，并且下调竞争性途径的角鲨烯合成酶SQS1。最后，引入了来自副球菌属(Paracoccus sp.) 的β-胡萝卜素酮酶(β-carotene ketolase, CrtW) 和来自Pantoea ananatis N81106的羟化酶(hydroxylase, CrtZ)，将β-胡萝卜素转化为虾青素，通过优化CrtZ和CrtW拷贝数在微量滴定板培养中虾青素的产量达到54.6 mg/L[107]。为了进一步促进虾青素的微生物合成，Tramontin等优化GPPS合酶的表达来提高β-胡萝卜素前体的生产，并以此为平台菌株引入不同物种来源和拷贝数的CrtZ和CrtW，最终虾青素产量达到285 mg/L。尽管目前虾青素发酵指标尚不能达到工业化生产需求，这些研究结果表明解脂耶氏酵母在构建虾青素生物合成细胞工厂方面具有极大潜力[108]。
紫罗兰酮是一类植物来源的萜类香气化合物，对香料和调味品行业很有价值。Czajka等通过向一个高产β-胡萝卜素平台菌株引入木犀(Osmanthus fragrans) 来源的类胡萝卜素裂解双加氧酶1 (cleavage dioxygenase 1, CCD1) 首次实现了解脂耶氏酵母中β-紫罗兰酮(β-ionone)
的合成，2 L发酵罐中β-紫罗兰酮产量达到380 mg/L[109]。在另外一项研究中，Lu等采用模块化途径工程的方法构建和优化了β-紫罗兰酮代谢途径，以便构建解脂耶氏酵母高效细胞工厂。通过优化胞质乙酰辅酶A的供应，增加甲羟戊酸途径通量和β-紫罗兰酮合成的3个模块，在3 L发酵罐中实现了β-紫罗兰酮的最高产量0.98 g/L[83]。利用亲水相互作用色谱-串联质谱技术，可定量化工程化解脂耶氏酵母α-紫罗兰酮生产菌株的生理反应和新陈代谢的瞬时变化。动态标记结果表明，在高细胞密度发酵下TCA循环活性受到抑制，从而导致生长阶段甲羟戊酸的溢流并在紫罗兰酮生产阶段被吸收[110]。
萜类化合物生产的代谢工程研究表明，解脂耶氏酵母是一个潜在的合成植物萜类化合物的平台菌株。可以进一步通过更多的基因工具，如CRISPR/Cas9基因编辑技术和蛋白质工程，使解脂耶氏酵母的遗传操作更加高效和快速。
3.4 黄酮类和聚酮类等化合物合成黄酮类化合物是苯丙类植物次生代谢物的一个多元化家族，广泛存在于水果、蔬菜、草药和植物中。药物研究和动物试验已经证明了它们具有预防衰老相关疾病活性的植物化学物质，包括治疗神经和心血管疾病、帕金森病和阿尔茨海默病等。Lv等测试了解脂耶氏酵母生产高价值类黄酮和羟基化类黄酮的潜力。他们通过模块化的构建和表征，来确定解脂耶氏酵母中黄酮类生物合成的限速步骤，在此基础上，优化查尔酮合酶模块和羟化酶模块，使工程菌株利用葡萄糖产生252.4 mg/L柚皮素(naringenin)、134.2 mg/L雌黄醇(eriodictyol)和110.5 mg/L黄衫素(taxifolin)[111]。此外，Wei等在解脂耶氏酵母中同时表达木糖利用和柚皮素生物合成途径，以葡萄糖和木糖为底物产生柚皮素[112]。利用木糖诱导型生物传感器控制柚皮素合成途径的构建实现了木糖作为底物和合成诱导剂的双重功能，将木糖的利用与柚皮素的生物合成结合在一起并提高了产量。在摇瓶培养水平，木糖诱导的柚皮苷产量可以达到715.3 mg/L。Palmer等通过表达过氧化物酶体基质蛋白PEX10调控β-氧化，显著提高了柚皮素合成，产量达到898 mg/L，为解脂耶氏酵母合成柚皮素的最高产量[113]。
在产油解脂耶氏酵母中柚皮素和脂质合成竞争相同的前体。近期，Lv等提出了通过将化学成瘾与负反馈调控相结合来提高代谢稳定性和产量的策略[74]。脂肪酸诱导型启动子结合CRISPRi对脂肪酸生成途径进行负反馈调控，使丙二酰辅酶A的代谢流重新分配以促进黄酮合成，并使柚皮素产量增加74.8%。此外，通过柚皮素调控的生物传感器来控制亮氨酸的合成，赋予细胞黄酮成瘾表型，从而使柚皮素产生菌株具有了生长优势。经过工程改造的酵母在324代中仍具有90.9%的柚皮素产量。没有黄酮类成瘾的细胞在经过300代以上的传代后恢复了生长适应性，但失去了94.5%的柚皮素产量。
聚酮化合物(polyketides, PKs) 是微生物在重要的制药应用中产生的次级代谢产物，包括抗肿瘤药(如格尔德霉素、马贝霉素)，免疫抑制剂(他克莫司、西罗莫司)，并具有降低胆固醇(洛伐他汀、普伐他汀) 能力，还具有抗生素(四环素、红霉素) 和杀虫剂(多杀菌素)的特性。但是，这些生物活性代谢物的产量在天然宿主中通常较低，这主要是因为它们的生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BGC)大多是沉默的，或者其起始底物有限。为了提高PKs的产量，已经开发了多种策略，包括对天然宿主进行代谢工程或在不同宿主中异源表达其BGC[115]。通常，通过使用丙二酰辅酶A延伸单元，乙酰辅酶A或丙酰基辅酶A的迭代缩合进行聚酮化合物的生物合成。TAL不仅是一种重要的平台化合物，它也是最简单的聚酮化合物，常被用于评估底盘细胞的聚酮化合物潜能。Yu等在解脂耶氏酵母过表达非洲菌(Gerbera hybrida) 来源的2-吡喃酮合酶基因生产TAL。在氮限制的生长条件诱导脂质生物合成的同时增加了TAL产量。通过使用转座子来整合多拷贝的2-吡喃酮合酶基因，提高TAL生产水平。在氮受限的培养基中，TAL产量为2.6 g/L[115]。在另外一项并行研究中，Liu等利用乙酸吸收途径供应更多胞质乙酰辅酶A，并过表达内源性乙酰辅酶A羧化酶ACC1、苹果酸酶MAE1和细菌源胞质丙酮酸脱氢酶PDH，使得在摇瓶中以工业乙酸为底物时TAL的产量可达4.76 g/L[82]。之前一系列研究已经证明，产油酵母解脂耶氏酵母是生产简单的聚酮化合物TAL的最佳宿主。
除了黄酮类化合物，其他的芳香族化合物在医疗保健、食品工业、营养保健品补充剂和医药中间体等领域也被广泛应用，拥有数10亿美元的全球市场。Gu等解除了莽草酸途径中的限速步骤，实现了解脂耶氏酵母为宿主的5种芳香族化合物的从头合成[116]。作者发现消除氨基酸形成和改造DAHP合成酶解除反馈抑制是缓解前体竞争和莽草酸途径的反馈调节的关键步骤。异源磷酸转酮酶的过表达和丙酮酸激酶的缺失，进一步将4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇丙酮酸引导进入莽草酸途径。利用该底盘细胞，合成了2 426 mg/L的2-苯基乙醇，593 mg/L的对香豆酸，12 mg/L的白藜芦醇，366 mg/L的紫色杆菌素和55 mg/L的脱氧紫色杆菌素。这项工作为解脂耶氏酵母中莽草酸途径衍生物的生产提供了可能性。随后，同一课题组发现Ehrlich途径的选择性和2-酮戊二酸的量是2-苯基乙醇(2-phenylethanol, 2-PE) 高效生产的限制因素[117]。作者通过逐步重构的方式确定了Ehrlich途径的最佳催化模块，构建胞质α-酮戊二酸途径，改造二羧酸转运蛋白以提高α-酮戊二酸的利用。结合阻断前体竞争途径并减轻脂肪酸合成等策略，使2-苯基乙醇的产量达到2 669.5 mg/L。与之类似地，Shang等增强解脂耶氏酵母莽草酸途径用于糖苷类化合物熊果苷(arbutin) 的生物合成。发现DAHP合酶的高水平表达对熊果苷合成至关重要，经优化熊果苷产量达到8.6 g/L[118]。Sáez-Sáez等解除莽草酸代谢相关基因的反馈抑制，同时在基因组整合5个拷贝的异源白藜芦醇(resveratrol) 合成途径，使白藜芦醇产量达到12.4 g/L，是迄今为止报道的微生物从头合成白藜芦醇最高产量[119]。上述研究表明，解脂耶氏酵母是合成聚酮、黄酮及其他芳香族化合物的优良底盘，如在解脂耶氏酵母中合成TAL、白藜芦醇等产物的产量，远高于利用其他微生物合成的产量，说明充足的前体供应对于产物合成的重要性。
3.5 其他种类的天然产物甾醇由于其重要的生物活性而受到越来越多的关注。产油酵母解脂耶氏酵母具有较大的脂滴，可为积累的类固醇化合物提供储存。在最近的研究中，Qian等研究了脂质含量与菜油甾醇积累之间的关系，发现菜油甾醇(campesterol)主要存在于解脂耶氏酵母脂滴中[120]。通过过表达2个拷贝的7-脱氢胆固醇还原酶(7-dehydrocholesterol reductase, dhcr7)，进一步促进了菜油甾醇积累。使用5 L生物反应器获得的最大菜油甾醇产量为837 mg/L。
中链和长链甲基酮是脂肪酸衍生的化合物，可用作生物燃料混合剂，调味剂和香料。最近，Hanko等利用解脂耶氏酵母固有的高通量脂肪酸β-氧化途径，生产长链和非常长链的甲基酮(methyl ketones)[121]。通过缺失Pot1基因以截断过氧化物酶体中β-氧化反应，导致C13-C23范围内的饱和、单不饱和和二不饱和甲基酮的生物合成。最后，通过额外过表达异源细菌甲基酮生物合成途径的和靶向过氧化物酶体，在最佳条件下进行生物反应器培养可产生314.8 mg/L的总甲基酮产量。
4 讨论与酿酒酵母、大肠杆菌和其他模型宿主相比，解脂耶氏酵母具有卓越的代谢能力，可以生产大量的燃料、油脂化学物质和天然产品。同样地，工业上的一些有利特性，包括对化学物质的耐受，高蛋白的生产和分泌能力，使解脂耶氏酵母成为一个有吸引力的真菌宿主。近年来，合成生物学工具的开发和代谢工程快速发展，极大地促进了解脂耶氏酵母合成各种天然产物的发展。新的遗传标记、表达载体、基因编辑工具、代谢调控元件被开发出来，用于天然产物合成底盘的构建。而通过正交的生物合成途径的开发、乙酰辅酶A等供应策略的应用、蛋白质工程、脂质工程等的应用，也极大地提高了解脂耶氏酵母各种重要产物合成的能力。尽管如此，利用解脂耶氏酵母生产天然产物依然面临诸多挑战，需要进一步提高转化效率、构建新的遗传工具、全面实施和利用CRISPR/Cas9，以及开发更多代谢网络模型。此外，异源蛋白的表达活性低，固有代谢途径调控困难，内源途径和异源途径难以适配等问题也限制了产量的提高。
针对这些问题，未来可以利用细胞器工程、辅因子工程、多酶复合体的组装等策略，进一步提高解脂耶氏酵母天然产物合成的能力。研究表明，代谢途径的亚细胞定位可以为复杂的生物合成途径提供合适的环境和足够的前体或酶，比如过氧化物酶体的区域化生产[122]。过氧化物酶体是脂肪酸发生β-氧化的主要部位，能够提供更多乙酰辅酶A，被其他途径利用，是一种很有前途的生产天然产物的亚细胞工厂。
此外，一直以来细胞工厂构建主要集中在前体供应、酶工程、通量平衡等方面。然而，辅因子往往被忽视。特别是许多天然产物生物合成的催化酶都需要特定的辅因子，而异源宿主酵母的辅因子供应不足。虽然已有一些辅因子工程的策略被提出，但人们对细胞辅因子平衡的调控机制仍知之甚少。另一方面，不同生物之间辅因子的生物合成和调控变化对细胞工厂的辅因子工程提出了巨大的挑战。因此，阐明辅因子在解脂耶氏酵母中的生物合成、分布和运输是辅助因子调控的关键。
除了常规代谢工程策略外，还可以运用其他策略，包括：构建多酶复合物、开发有毒化合物外排的有效转运系统、调控脂质含量和细胞形态等，也有助于提高天然产物的生产。综上所述，随着更多的工程技术手段和遗传工具的开发，解脂耶氏酵母作为平台菌株进行天然产物生物合成的巨大潜力将进一步被挖掘出来。
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