2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 韩丽婕, 王伟良, 万民熙, 沈国敏, 俞涛, 李元广
- HAN Lijie, WANG Weiliang, WAN Minxi, SHEN Guomin, YU Tao, LI Yuanguang
- 定向驯化对异养蛋白核小球藻硒的耐受性及富集能力的影响
- Effects of directional adaptation on selenium tolerance and accumulation of heterotrophic Chlorella pyrenoidosa
- 生物工程学报, 2022, 38(12): 4756-4764
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(12): 4756-4764
- 10.13345/j.cjb.210423
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文章历史
- Received: June 4, 2021
- Accepted: September 13, 2021
引用本文
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硒(Se) 是生物体必不可少的微量元素。硒缺乏会导致人产生克山病、大骨节病等疾病；缺硒也会造成动物免疫力降低，导致发育迟缓、繁殖力减退，给畜牧业带来巨大损失。因此补硒是十分必要的。
目前，通常以无机硒或者有机硒进行补硒。与无机硒相比，有机硒不仅生物利用度高，而且毒副作用小[1-3]。因此，只有把无机硒转化为有机硒，才能更好地被生物体吸收和利用，也才具有更高的应用价值。目前应用较多的含有机硒的产品主要有富硒动植物产品、富硒酵母和富硒小球藻3类。
目前，富硒动植物产品存在硒含量很低且生产周期长的问题[4-5]。酵母对硒的富集能力强，但所含硒化合物的组成不确定，2002年欧盟将富硒酵母从允许的食品补充剂列表中排除。同时，硒小球藻中硒的生物利用率为49%，而硒酵母中硒的利用率仅为21%[6-10]。因此，利用小球藻培养获得生物利用度高、安全性好的有机硒产品的相关研究受到广泛关注[11-15]。
由表 1可知，与光自养生长相比，异养培养可获得高密度的蛋白核小球藻，进而可以耐受更高的Na2SeO3浓度[16]。但光自养培养获得的细胞密度较低，较低的细胞密度不利于采收，并且大规模培养易被杂藻和原生动物污染[20]。因此，采用异养方式生产富硒蛋白核小球藻成为重要的发展方向。
蛋白核小球藻具有适应性强的优势，经驯化可在高盐、低温等恶劣环境下生存[21-23]；也可以在重金属浓度较高的工业废水中生存并吸附铁、锌、锰等重金属[24-27]。因此，提高小球藻对Na2SeO3的耐受性，有望使小球藻在含有更高浓度Na2SeO3的培养基中生长，从而富集更多的硒。本研究拟通过定向驯化的方法提高藻细胞对Na2SeO3的耐受性，使藻细胞在培养过程中富集和转化更多的无机硒成为有机硒，从而为小球藻富硒产品的开发提供实验依据。迄今为止，通过定向驯化提高小球藻对硒耐受性的研究还未见报道。
本研究为获得高密度、高有机硒含量的蛋白核小球藻，首先通过定向驯化并对驯化时间、驯化过程中Na2SeO3浓度梯度等条件进行了优化，获得了对Na2SeO3耐受性高、富集能力强的藻种。之后，在实验室研发的“异养细胞-非光诱导培养”技术基础上，在5 L发酵罐中对驯化后的藻种进行异养培养，并进一步优化硒的添加方式。
1 材料与方法 1.1 藻种和培养基所用初始藻种为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa) FACHB 9，由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室海洋生化工程研究室保藏和提供。蛋白核小球藻的异养藻种培养基和发酵培养基采用优化后的Endo培养基[28]。
1.2 仪器设备5 L发酵罐(BIOTECH-5BGG) 购自上海保兴生物设备工程有限公司；台式恒温摇床(BDY-100B) 购自上海量壹科学仪器有限公司。
1.3 方法 1.3.1 接种密度对异养蛋白核小球藻硒耐受性及富集能力的影响实验共设置4个接种密度，分别为0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L。培养装置为500 mL摇瓶，放入200 mL异养培养基，培养基中Na2SeO3浓度共设置4个梯度20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L和80 mg/L，将4个接种密度的藻种分别接入上述培养基中，并置于恒温摇床中培养，转速150 r/min，温度30 ℃，避光异养培养3 d。
1.3.2 藻种驯化时间对异养蛋白核小球藻硒耐受性及富集能力的影响500 mL摇瓶中放入200 mL异养培养基，接种密度为0.5 g/L，在含10 mg/L Na2SeO3的培养基中分别驯化3 d、6 d和9 d。驯化结束后将上述藻种分别接入含22.5 mg/L、25.0 mg/L、27.5 mg/L、30.0 mg/L、35.0 mg/L和40.0 mg/L的Na2SeO3培养基。驯化流程见图 1。
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| 图 1 不同驯化时间驯化异养蛋白核小球藻的驯化流程 Fig. 1 Adaptation of heterotrophic Chlorella pyrenoidosa for different time. |
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按照上述驯化路径，本实验将考察驯化时间分别为3 d、6 d和9 d的藻种对硒的耐受性及富集能力的差异，以找出最适的藻种驯化时间。
1.3.3 不同Na2SeO3浓度梯度对驯化的异养蛋白核小球藻硒耐受性及富集能力的影响首先在10 mg/L Na2SeO3的培养基中驯化6 d，以细胞密度达到正常培养的6 g/L为该Na2SeO3浓度下驯化完成标志。之后，培养基中Na2SeO3浓度以10 mg/L为单位递增，在驯化至Na2SeO3的浓度30 mg/L时出现严重抑制细胞生长的现象。因此分别设计Na2SeO3浓度以2.5 mg/L、5 mg/L为单位递增。上一级Na2SeO3浓度驯化完成后，再进行下一级Na2SeO3浓度驯化，一直驯化至Na2SeO3浓度40 mg/L。为保证在相同的驯化时间下进行驯化效果的对比，3条驯化路径的驯化时间都为48 d，最终获得3株驯化藻株(EG1、EG2、EG3)。驯化结束后，将EG1、EG2、EG3按接种密度0.5 g/L分别接入含35 mg/L、40 mg/L、45 mg/L、50 mg/L、55 mg/L、60 mg/L的Na2SeO3培养基中，培养3 d。以上驯化过程及驯化藻种硒耐受性考察均在恒温摇床中培养，转速为150 r/min，温度为30 ℃。Na2SeO3浓度梯度驯化流程见图 2。
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| 图 2 不同Na2SeO3浓度梯度驯化过程 Fig. 2 Adaptation of Chlorella pyrenoidosa with sodium selenite of different concentration gradients. |
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在5 L发酵罐培养中，初始含40 mg/L Na2SeO3培养基中接入1.3.3中驯化藻种，初始含20 mg/L、30 mg/L Na2SeO3培养基中接入未驯化的藻种，接种密度0.5 g/L。在对数生长期开始(40 h) 和对数生长期中期(60 h) 时分别补加2次Na2SeO3，与初始Na2SeO3浓度一致。培养温度30 ℃，初始转速150 r/min，在进入稳定期后停止正常培养基的补料。待碳源耗完，诱导24 h。
1.3.5 5 L发酵罐中异养培养驯化藻种时硒补加方式的优化在5 L发酵罐培养中，按接种密度0.5 g/L接入1.3.3中的驯化藻种。采用两种加硒方式，一种是在对数生长期时，分5次补加Na2SeO3，每次补加80 mg/L；另一种在对数生长期时，分10次补加Na2SeO3，每次40 mg/L。待碳源耗完，诱导24 h。
1.4 分析方法无机硒含量的测定采用盐酸萃取法[2]，采用ICP-MS方法测定总硒含量[29]，采用总硒与无机硒的差值测定有机硒含量[29]，采用干重法测定细胞密度[20]，采用凯氏定氮法测定藻细胞中蛋白质含量[30]，采用甲醇提取法测定藻体叶绿素含量[31]，采用尿素氮试剂盒(南京建成生物工程研究所) 测定尿素，采用葡萄糖试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司) 测定葡萄糖，有机硒合成速率根据单位体积藻液中有机硒含量与培养时间比值计算。用Origin软件统计实验数据，用SPSS软件分析数据的显著性差异。
2 结果与分析 2.1 接种密度对异养蛋白核小球藻硒耐受性及富集能力的影响由表 2可知，提高接种密度可以提高细胞对Na2SeO3的耐受能力和富集能力。当接种密度为2.0 g/L时，小球藻可以耐受60 mg/L Na2SeO3。由表 2可知，在40 mg/L Na2SeO3时，接种密度2.0 g/L的实验组培养结束时有机硒的合成速率较接种密度1.5 g/L提高了133.5%。与Sun等[29]报道的摇瓶水平富硒光自养小球藻最高细胞密度1.8 g/L及最高有机硒含量316 mg/kg比较，优化后的细胞密度和有机硒含量分别提高了1.9倍和3.9倍。表 2中接种密度1.0 g/L的藻细胞在40 mg/L和60 mg/L Na2SeO3浓度下的数据未列出，是因为在以上浓度下，藻细胞因无法耐受而死亡，导致细胞密度过低，无法检测硒含量。
| Inoculation density (g/L) | Na2SeO3 concentration (mg/L) | Dry cell weight (g/L) |
Organic selenium content (mg/kg) | Synthesis rate of organic selenium (mg/(L·d)) |
| 1.0 | 20.0 | 6.6 | 446.4 | 1.0 |
| 1.5 | 20.0 | 6.8 | 472.2 | 1.0 |
| 40.0 | 3.3 | 1 383.4 | 1.5 | |
| 60.0 | 1.1 | 3 301.2 | 1.1 | |
| 2.0 | 20.0 | 6.9 | 485.4 | 1.0 |
| 40.0 | 5.2 | 1 559.3 | 2.7 | |
| 60.0 | 2.6 | 3 933.0 | 3.4 |
综上所述，提高小球藻对Na2SeO3的耐受性，可以使小球藻在含有更高浓度的Na2SeO3培养基中富集更多的硒。但提高接种密度并不能从根本上解决藻细胞对硒耐受性提高的问题，因此本研究进一步开展了小球藻对硒耐受性的定向驯化实验。
2.2 藻种驯化时间对异养蛋白核小球藻硒耐受性及富集能力的影响驯化6 d的小球藻，对提高藻细胞Na2SeO3的耐受性和富硒能力是最优的。由表 3可知，驯化6 d的小球藻对Na2SeO3的耐受性最强，可在含30 mg/L Na2SeO3的培养基中正常生长。
| Adapting time (d) | Na2SeO3 concentration (mg/L) | Dry cell weight (g/L) |
Organic selenium content (mg/kg) | Synthesis rate of organic selenium (mg/(L·d)) |
| 3 | 27.5 | 3.1 | 460.2 | 0.5 |
| 30.0 | 0.7 | 398.2 | 0.1 | |
| 6 | 27.5 | 5.7 | 518.5 | 1.0 |
| 30.0 | 4.4 | 786.9 | 1.2 | |
| 35.0 | 3.6 | 1 637.2 | 2.0 | |
| 9 | 27.5 | 5.6 | 436.0 | 0.8 |
| 30.0 | 3.1 | 560.8 | 0.6 | |
| 35.0 | 2.4 | 1 191.6 | 1.0 |
由表 3可知，Na2SeO3浓度为30 mg/L时，驯化时间为6 d的实验组有机硒合成速率为1.15 mg/(L·d)，分别是3 d、9 d实验组有机硒合成速率的12.8倍和2.0倍。表 3中驯化3 d的小球藻在35 mg/L Na2SeO3浓度下的数据未列出，是因为在该浓度下藻细胞因无法耐受而死亡，导致细胞密度过低，无法检测硒含量。
驯化周期对小球藻Na2SeO3耐受性和富集能力有明显影响，究其原因可能是：驯化时间短，耐受性无法保持；驯化时间长，随细胞传代次数的增加，小球藻细胞活性下降，进而影响对Na2SeO3的耐受性。因此，本实验中驯化周期为6 d时对藻细胞Na2SeO3的耐受性保持和提高富硒能力是最优的。
2.3 不同Na2SeO3浓度梯度对驯化的异养蛋白核小球藻硒耐受性及富集能力的影响从图 2的驯化过程可知，驯化梯度EG1 > EG2 > EG3。由表 4可见，驯化梯度越小，藻细胞对Na2SeO3的耐受性越好。驯化藻株EG3对Na2SeO3的耐受性最强，可在50 mg/L Na2SeO3浓度下正常生长。由表 4可知，驯化梯度越小，驯化后的藻细胞对Na2SeO3的富集量越高。在50 mg/L Na2SeO3时，驯化藻株EG3有机硒合成速率是驯化藻株EG2有机硒合成速率的2.8倍。表 4中EG1在50 mg/L Na2SeO3浓度下的数据未列出，是因为在该浓度下，EG1的藻细胞因无法耐受而死亡，导致细胞密度过低，无法检测硒含量。
| Adapted species | Na2SeO3 concentration (mg/L) | Dry cell weight (g/L) |
Organic selenium content (mg/kg) | Synthesis rate of organic selenium (mg/(L·d)) |
| EG1 | 40.0 45.0 |
3.8 0.7 |
3 260.2 2 898.2 |
4.1 0.7 |
| EG2 | 40.0 | 5.2 | 3 153.4 | 6.4 |
| 45.0 | 5.1 | 3 621.8 | 6.2 | |
| 50.0 | 2.6 | 5 291.6 | 4.6 | |
| EG3 | 40.0 | 6.4 | 3 798.0 | 8.1 |
| 45.0 | 6.7 | 4 375.6 | 9.8 | |
| 50.0 | 5.2 | 7 507.2 | 13.0 |
驯化后的藻细胞对Na2SeO3的耐受性及富集能力均明显提高。由图 3可知，驯化后的藻株在两次添加40 mg/L Na2SeO3时的生长密度与未驯化的藻株在两次添加20 mg/L Na2SeO3下的生长密度相差不大。但是，未驯化的藻株在两次添加30 mg/L Na2SeO3下出现藻液颜色发黄、细胞大量死亡现象。
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| 图 3 5 L发酵罐中驯化后藻种与未驯化藻种的生长曲线 Fig. 3 Growth curves of adapted Chlorella pyrenoidosa and non-adapted C. pyrenoidosa in 5 L fermenter. |
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由图 4可知，培养至96 h，驯化后的藻株细胞有机硒合成速率达0.36 mg/(L·h)，比未驯化藻株细胞中的有机硒合成速率提高89.5%。
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| 图 4 5 L发酵罐中驯化后藻种与未驯化藻种培养过程中总硒和有机硒的变化曲线 Fig. 4 Variation of total selenium and organic selenium of adapted Chlorella pyrenoidosa and non- adapted C. pyrenoidosa during culture in 5 L fermentor. |
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本实验在对数生长期比较了2种不同补硒方式对藻细胞生长及富硒情况的影响，一种是分5次补加Na2SeO3，每次补加80 mg/L；另一种为分10次补加Na2SeO3，每次40 mg/L。
由图 5可知，分批补料添加40 mg/L Na2SeO3与分批补料添加80 mg/L Na2SeO3，均可提高藻细胞有机硒含量，但分批补料添加40 mg/LNa2SeO3效果更显著。10次添加40 mg/L Na2SeO3后，在96 h时，干重和有机硒合成速率与分批补料添加80 mg/L Na2SeO3相比，分别增加了3.1%和37.4%。
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| 图 5 分批补料添加不同浓度Na2SeO3时蛋白核小球藻细胞中总硒和有机硒的变化曲线 Fig. 5 Variation of total selenium and organic selenium in Chlorella pyrenoidosa at different concentration of Na2SeO3 in fed batch. |
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由图 6分批添加Na2SeO3过程可知，培养结束时，分批补料添加40 mg/L Na2SeO3与分批补料添加80 mg/L Na2SeO3相比，硒的利用率增加了6.6%。因此，分批补料添加40 mg/L Na2SeO3的方式更好。10次添加40 mg/L Na2SeO3后，比Douch[11]报道的富硒蛋白核小球藻最高细胞密度(75 g/L) 提高了41.9%，比Mylenko等[16]报道的富硒蛋白核小球藻最高有机硒含量(560 mg/kg) 提高了119.1%。
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| 图 6 分批补料加入不同浓度Na2SeO3时培养基中Na2SeO3浓度的变化曲线 Fig. 6 Variation of Na2SeO3 concentration in medium with different concentration of Na2SeO3 in fed batch. |
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本文首次将定向驯化应用到异养蛋白核小球藻富硒过程中，获得了对硒的耐受性较高和富集能力较强的藻细胞。同时，实验结果也表明驯化时间、驯化梯度和硒的添加方式对异养
蛋白核小球藻硒的耐受性及富集能力有较大影响。在本团队研发的“异养细胞-非光诱导培养”技术基础上，优化了驯化藻株培养过程中Na2SeO3的添加方式，最终小球藻细胞密度达106.4 g/L，有机硒合成速率达1.36 mg/(L·h)。本研究结果与已有异养蛋白核小球藻富硒文献报道的最高细胞密度75 g/L[11]相比提高了41.9%；比报道的最高有机硒含量(560 mg/kg)[16]提高了119.1%。
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