2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 谭鑫, 李超, 郭美锦
- TAN Xin, LI Chao, GUO Meijin
- 用于红霉素生产的500 m3生物反应器的理性设计
- Rational design of a 500 m3 fermenter for erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea
- 生物工程学报, 2022, 38(12): 4692-4704
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(12): 4692-4704
- 10.13345/j.cjb.220292
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文章历史
- Received: April 13, 2022
- Accepted: June 15, 2022
引用本文
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2. 上海健启生物科技有限公司, 上海 201400
2. Shanghai Jianqi Biotechnology Co. Ltd., Shanghai 201400, China
设计满足发酵工艺条件的大规模反应器是发酵过程放大的主要内容之一，包括确定操作条件、操作方式和反应器结构等。放大原则是使放大后的工业规模反应器发酵特性与实验小试规模反应器的发酵特性基本保持一致性，即提供相似的微生物发酵状态环境，特别是发酵水平、底物浓度分布与剪切等相似。目前常用的放大方法有基于化学工程的经验逐步放大法和基于生理特性与流场特性相结合的放大方法等[1]，但是，对于巨型高耗氧的生物反应器设计与放大的复杂性，目前放大方法仍然难以全面满足放大的要求。
时间常数法(time constant method) 是一种以发酵过程机理研究为基准的放大研究方法[1]。过程机理分析的目的主要是确定发酵反应系统是发酵生理限制、传质限制、还是流体的混合限制等，找出整个过程的限制因素。理性的发酵过程放大需要先在实验室规模进行发酵的关键因素研究，然后进行放大反应器的理性设计，最后通过计算流体力学(computational fluid dynamics, CFD) 的方法对理性设计的反应器进行性能评估，以实现对设计的反应器方案验证或调整优化。本文以红色糖多胞菌(Saccharopolyspora erythraea) 发酵红霉素过程放大为研究对象，采用理性化的时间常数法设计500 m3工业规模的生物反应器，并进行试验验证，研究结果可为今后工业规模反应器的设计提供新的方法与实践。
1 材料与方法 1.1 实验菌种菌种：红色糖多胞菌(S. erythraea) E3，由国家生化工程技术研究中心(上海) 保存。
1.2 培养基一级种子培养基(g/L)：玉米淀粉20，糊精20，葡萄糖10，玉米浆6，硫酸铵2，氯化钠5，碳酸钙3，豆油11，消泡剂0.1，氢氧化钠调pH至7.0，121 ℃灭菌30 min。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉50，黄豆饼粉33，玉米浆22，硫酸铵2，氯化钠2，碳酸钙6，豆油6，消泡剂0.2，氢氧化钠调pH至7.0，121 ℃灭菌30 min。
1.3 发酵方法50 L实验规模培养采用一级种子发酵培养方法，向茄子瓶斜面内注入50 mL无菌水，刮下所有孢子，将孢子液接种到30 L一级种子培养基中，转速220 r/min，温度为34 ℃，培养62 h后按照15%的接种量接种到50 L发酵罐中培养168 h，温度34 ℃。发酵过程中在线监控温度、转速、pH值、溶解氧(dissolved oxygen, DO)、氧消耗速率(oxygen uptake rate, OUR) 等参数变化，离线监控还原糖、总糖、氨基氮、化学效价、红霉素A组分等参数，通过控制空气流量和搅拌速率维持溶解氧浓度不低于25%。每隔12 h取样检测菌浓(packed mycelium volume, PMV)、氨基氮、葡萄糖浓度和效价等参数。
葡萄糖流加方式(pH闭环控制)：制备好30%葡萄糖无菌溶液，根据补加工艺选择起始补加时间，维持pH在7.0左右，发酵40 h后由pH值反馈闭环控制补加速率。
豆油流加方式：豆油在红霉素发酵过程中作为碳源和消泡剂，在整个发酵过程中匀速补加，补加总量控制总发酵液体积的1.0%–2.5%。
正丙醇前体流加方式：正丙醇在红霉素发酵过程中作为碳源和前体，在整个发酵过程中匀速补加，补加总量控制在总发酵液体积的1.0%–2.0%。
无菌水及基础料补加方式：根据需要补加，维持合适的发酵液黏度和体积。
1.4 实验设备及分析方法发酵罐：FUS-30 L–50 L高级发酵罐(上海国强生化工程装备有限公司)，具有在线pH、DO、温度、转速、空气流量、罐压、称重、补料及OUR、二氧化碳释放速率(carbon-dioxide evolution rate, CER)、呼吸熵(respiratory entropy, RQ) 等参数在线检测；
采用显色法对红霉素化学效价进行测定[2]，高效液相测定组分(高效液相色谱仪：Agilent1100 Series (安捷伦公司)，色谱柱：Hypersil BDS C18 5 µm (250 mm×4.6 mm)，流动相：0.025 mol/L磷酸氢二钾缓冲溶液︰乙腈= 60︰40，检测流速：1.0 mL/min，检测波长：215 nm，柱温：35 ℃，检测时间：50 min)；
利用流变仪(DV-Ⅱ+ Pro, Brookfield) 对发酵液流变特性进行测定。
1.5 时间常数分析法[1]本文中时间常数分析法是通过对比发酵过程中生理代谢参数的特征时间与反应器内混合、传质等特征时间，在工业放大以后如果某关键生理代谢参数的特征时间明显小于反应器相应的特征时间，则说明反应器不能满足发酵需求，导致放大不能达到目标或失败。红霉素发酵在放大过程中的氧气传递速率(oxygen transfer rate, OTR) 是关键因素之一。因此，在500 m3反应器的设计时，供氧速率是首要考虑因素。在放大过程中，要考虑反应器“供给型”关键时间常数-氧传递时间常数(tmt) 与关键的发酵过程“消耗型”关键时间常数-氧消耗时间常数(toc) 之间的关系：
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(1) |
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(2) |
其中，kLa为体积氧气传质系数(s–1)，co*2为饱和氧浓度(mmol/L)，ro2为氧消耗速率(mmol/L)。根据50 L发酵罐小试研究得到发酵过程的OUR值可计算出上述时间常数。在放大设计时，要使反应器“供给型”时间常数小于发酵“消耗型”时间特征参数才能满足反应器内氧的供应，同时“消耗型”时间特征参数应小于混合时间tmt，才能使反应器内没有明显的氧浓度梯度差异。即要满足以下要求：
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(3) |
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(4) |
发酵液的流变特性是反应器放大设计时要考虑的重要因素，对50 L反应器上对红霉素发酵液的流变特性进行研究。文献报道放线菌多属于非牛顿流体，对于非牛顿流体，由Ostwald-de Waele模型可建立表观黏度与剪切率的关联式[3]：
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(5) |
其中K为稠度系数(N·Sn·m–2)，γ为剪切率(s–1)，n为流动特性指数。
1.7 反应器搅拌系统设计方法 1.7.1 搅拌功率及电机功率的设计采用搅拌式生物反应器，在非通气条件下，搅拌功率用以下公式计算：
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(6) |
其中P为非通气条件下的搅拌功率(kW)；Np为无量纲的功率准数，ρ为发酵液密度(kg/m3)；N为搅拌转速(s–1)；D为搅拌叶直径(m)。公式中Np与流体性质和设备结构相关，Holland和Bragg通过量纲分析，不通气条件下桨叶组合的功率准数可以关联为：
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(7) |
公式中C1、C2、C3为无量纲系数；在通气条件下搅拌功率通常会下降，通常将其与流量准数(FlG) 和弗鲁德数(Fr) 关联[4-5]：
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(8) |
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(9) |
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(10) |
其中PG为通气后的搅拌功率，C1、C2、C3为无量纲系数，QG为通气流量(m3/s)。根据特定桨型组合获取的模型系数[3-4]确定以上参数即可计算出通气后搅拌功率，通过通气后搅拌功率可以计算出电机所需的额定功率(PM)：
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(11) |
其中PM为电机功率(kW)，η为效率因子。
1.7.2 反应器氧气传递速率(OTR) 的设计与计算在实际发酵过程中，微生物对kLa的需求可通过测定其最大OUR进行计算，根据氧传递模型理论，在拟稳态时：
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(12) |
其中C*为一定温度下发酵液的饱和氧浓度，饱和溶解度氧浓度计算公式为[6]：
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(13) |
根据亨利公式，在不同压力下可表示为：
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(14) |
其中P为实际工况压力，P0为大气压；C为溶解氧浓度，在C保持在临界氧以上时，取最大OUR时的值及对应的溶氧数据，可估算出该发酵过程所需的最大kLa值。
研究资料表明kLa主要与反应器的单位体积输入功率、通气量及微生物发酵液的流体特性相关[4, 7]。常用以下公式计算：
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(15) |
其中PG/V为通气状态下搅拌系统的单位体积发酵液的输入功率(kW/m3)，VS为表观通气速率，μa为发酵液的表观黏度(Pa·s) (对于红霉素发酵液非牛顿型流体需根据流变特性研究结果进行修正计算)，C1、C2、C3、C4为无量纲系数，通气后的搅拌功率可计算得到反应器的体积氧传递系数。
1.7.3 混合时间的计算反应器内混合时间(mixing time) 与反应器的结构和操作工况高度相关，通气条件下反应器内混合时间可用如下关联式表征[8-9]：
对于牛顿型流体：
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(16) |
对于非牛顿型流体：
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(17) |
μa为有效黏度(Pa·s)，μa=Ksγeffn–1，γeff是有效剪切率(s–1)。
通过Metzner and Otto的方法[3]获得：γeff=KSN，根据红霉素发酵液流变特性的研究结果，本文中KS取全周期平均值。
参照本实验室研究获取的不同组合搅拌桨组合条件下的模型参数[3]，通过以上公式可估算出反应器内的混合时间。
1.8 CFD模拟方法及计算条件采用本课题组前期优化的CFD数值模拟方法[10-11]对设计的工业规模反应器进行数值分析。工业规模500 m3反应器的装液量为410 m3，搅拌桨叶转速为100 r/min，每升发酵液的通气速率为1.3 L/min。网格划分采用ANYSYS公司开发的ANSYS ICEM CFD15.0软件，为全四面体网格。为了保证达到网格无关解，同时减少计算量，选取网格最大尺寸为100 mm，桨叶区域和内部较小的结构采用网格加密，总网格数约400万。采用ANSYS CFX 15.0建模和求解，气体入口采用进气口速度入口边界，发酵罐顶部气体出口采用去泡边界条件，其他均采用无滑移壁面边界条件。求解过程是在96核的服务器(Sugon Co., Ltd.) 上进行。计算过程的收敛标准为残差小于1×10–3，且桨叶扭矩和总气含率达到稳定。
2 结果与分析 2.1 红霉素发酵过程关键时间常数的确定DO是红霉素高耗氧发酵的关键参数之一，在50 L发酵罐上发酵3批次(001、002、003) 得到红霉素发酵过程OUR为40–46 mmol/(L·h)，与文献一致(图 1)[12]，发酵水平正常。为了进一步确定培养过程的临界溶氧并探究溶氧对红霉素各个组分的影响，设计溶氧控制的单因素试验，将发酵过程的DO最低浓度分别控制为10%、15%、25%三个梯度水平进行考察，发酵效价和组分均值结果见表 1。
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| 图 1 红霉素发酵过程OUR和RQ曲线 Fig. 1 Time course of OUR and RQ during entire erythromycin fermentation process. |
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| Lowest DO (%) | Titer (μg/mL) | Erythromycin A (μg/mL) | Erythromycin B (μg/mL) | Erythromycin C (μg/mL) |
| 25 | 9 605±70 | 7 072±20 | 235±15 | 675±31 |
| 15 | 9 355±73 | 6 819±28 | 234±12 | 385±25 |
| 10 | 7 929±60 | 5 601±23 | 388±18 | 195±15 |
由表 1表明溶氧(DO) 与目标物红霉素A组分(ERY-A) 呈正相关，而与杂质ERY-B组分呈负相关，根据红霉素A生物合成途径[2]说明高溶氧比较利于ERY-C的生成，即有利于ERY-C组分往ERY-A方向转化而有利于ERY-A的合成。从工艺控制角度出发可以通过提高溶氧(DO) 而强化ERY-C向ERY-A转化的代谢通路得到更多的ERY-A，因此溶氧浓度是ERY-A组分高产发酵的关键因素。在红霉素放大工艺过程中，发酵体系最低溶氧浓度需控制在25%或以上。
在实际发酵中，不同批次有一定波动性，考虑溶氧(DO) 对于红霉素发酵是关键参数，因此设计中将其最大值放大至150 mmol/(L·h)为原则，即OTR需要大于150 mmol/(L·h)。红霉素发酵培养温度32 ℃，压力0.05 MPa，计算该工况条件下c*=0.051 9 mg/L (0.345 4 mmol/L)；最低溶氧水平在25%，代入公式(1) 及(2) 可计算出红霉素发酵对设备氧传递要求的时间常数及氧的消耗时间常数，计算结果见表 2。
| Maximum OUR (mmol/(L·h)) | Critical DO (%) | Volumetric oxygen transfer rate (kLa, s–1) |
Saturated dissolved oxygen concentration (co*2, mmol/L) |
Oxygen consumption time constant (toc, s) | Oxygen transfer time constant (tmt, s) |
| 150 | 25 | 0.16 | 0.345 4 | 8.29 | 6.25 |
从计算结果可知红霉素发酵要求设备体积氧传递系数kLa > 0.16 s–1，即氧传递时间常数tmt < 6.25 s。氧的消耗时间常数为8.29 s。因此在500 m3大型反应器的设计过程中，需要保持氧传递时间常数tmt < 6.25 s，才能保证红霉素发酵过程关键因素氧传递速率(OTR) 的需要。
2.2 红霉素发酵液稠度系数及流动特性指数50 L反应器上对红霉素发酵液的全过程黏度测定结果见表 3。对不同发酵时间点的红霉素发酵液的黏度与切变率进行一元线性回归拟合，结果见表 4。
| Shear rate (s–1) |
30 h (Pa·s) |
38 h (Pa·s) |
80 h (Pa·s) |
88 h (Pa·s) |
103 (Pa·s) |
108 (Pa·s) |
115 (Pa·s) |
139 (Pa·s) |
| 3.40 | 1.163 75 | 1.505 68 | 1.283 73 | 1.481 68 | 1.343 71 | 1.313 72 | 1.965 79 | 0.884 81 |
| 6.80 | 0.689 85 | 0.859 32 | 0.734 84 | 0.796 33 | 0.734 84 | 0.745 34 | 0.569 88 | 0.485 90 |
| 10.20 | 0.533 89 | 0.657 86 | 0.554 88 | 0.579 88 | 0.544 88 | 0.562 88 | 0.438 91 | 0.372 92 |
| 13.60 | 0.464 15 | 0.550 38 | 0.465 65 | 0.470 15 | 0.468 20 | 0.467 15 | 0.367 42 | 0.319 43 |
| 17.00 | 0.402 51 | 0.476 30 | 0.409 11 | 0.398 91 | 0.399 30 | 0.399 51 | 0.322 13 | 0.284 94 |
| Time (h) | K (N·Sn·m–2) | n | Fitting function | R2 | Average of K (N·Sn·m–2) |
Average of n |
| 30 | 2.518 3 | 0.345 1 | ηa=2.518 3×γ–0.654 9 | 0.994 0 | 2.687 0 | 0.302 1 |
| 38 | 3.502 2 | 0.287 9 | ηa=3.502 2×γ–0.712 1 | 0.996 0 | ||
| 80 | 2.984 4 | 0.287 4 | ηa=2.984 4×γ–0.712 6 | 0.995 3 | ||
| 88 | 3.920 0 | 0.185 4 | ηa=3.920 0×γ–0.814 6 | 0.997 6 | ||
| 103 | 3.240 7 | 0.250 4 | ηa=3.240 7×γ–0.749 6 | 0.992 6 | ||
| 108 | 3.160 7 | 0.263 9 | ηa=3.160 7×γ–0.736 1 | 0.997 4 | ||
| 115 | 2.175 2 | 0.317 8 | ηa=2.175 2×γ–0.682 2 | 0.996 9 | ||
| 139 | 1.998 7 | 0.294 9 | ηa=1.998 7×γ–0.705 1 | 0.987 1 |
表 4结果验证了红霉素全程发酵液属于非牛顿流体，其表观黏度与剪切率呈典型指数函数关系，可以由公式ηa=K×γn−1来描述，K均值为2.687 N·Sn·m–2；其流动特性指数n < 1，在0.1–0.5之间，均值为0.302 1，这也与文献报道的红霉素发酵液流动特性指数范围0.2–0.6基本一致[2]。
2.3 500 m3反应器设计方案 2.3.1 反应器基本尺寸工程参数的选择由于500 m3反应器体积超大，反应过程需求通气量也较高，反应器采用较大的高径比(H/D) 有利于增加静压强提高罐内溶氧水平和氧滞留时间。因此，设计反应器时取H/D= 2.25︰1，即内径6.4 m，直筒高度14.4 m。大型反应器一般采用蛇管降温，也起到挡板作用，实现湍流。
2.3.2 桨叶类型及数量的设计在设计过程中主要考虑反应器的供氧和混合效果。为满足反应器高供氧需求，本方案设计中考虑上层采用四宽叶旋桨式搅拌器，即轴流型桨，螺旋圆锥曲面叶片；底层桨叶采用8叶抛物线型叶轮，具有较强的径向排量及分散能力。采用上下不对称结构设计，上面的叶片略长于下部的叶片，该设计使得上升的气体被上面的长叶片盖住，避免气体过早地从叶轮区域直接上升而逃逸，而使更多的气体通过叶轮区域在径向被分散，而对于搅拌层数，考虑到大型反应器内混合的效果，宜采用3层或4层搅拌桨组合。
对于桨叶直径(d)，一般与罐体直径(D) 之间关系为：d/D=1/3。考虑到最大装液量为60%–80%，即反应器内装液量为319.2– 425.6 m3，取装液量最大值计算，得到装液直筒高为12.2 m，取装液量最小值计算，装液直筒高度为8.81 m，顶层搅拌距离液面的距离(S1)，S1/D最小值通常不低于1.0，而底层搅拌位置一般为桨叶直径(d) 的0.2–0.5倍左右，由此可以确定各桨叶之间的间距。
同时根据小试试验表明红霉素发酵单位体积功率不大于2 kW/m3，按该体积功率计算，同时结合考虑大型减速机选型的限制，最高转速设置为100 r/min。
2.3.3 蛇管换热系统的设计在大型通用反应器的罐内温度换热系统，一般均采用内蛇管+外盘管的方式，主要是内蛇管的温度交换起作用，外盘管起辅助作用(本文不作展开)。根据50 L小罐实验可得到发酵过程OUR及热量数据，计算发酵热约为22 000 kJ/(m3·h)。根据该数据，计算出500 m3反应器换热系统的参数。根据以上数据可计算和设计搅拌系统组合方案及反应器的结构参数，同时结合不同厂家可选的桨叶形式，设计如下方案：3组搅拌桨叶，底层用8叶抛物线径向流搅拌桨，中层及上层用四叶旋桨式，搅拌桨叶间距为1.81 d；500 m3反应器结构参数如表 5所示。
| Items | Designed scheme |
| Basic size (mm) | |
| Internal diameter | 6 400 |
| Height of head | 1 600 |
| Bottom shape | Ellipse |
| Broth volume (m3) | 319.2−425.6 |
| Shaft radius | φ325×25 |
| Number of impellers | 3 |
| Upper impeller | |
| Type | MSX (four blades) |
| Diameter | φ2 200 |
| Middle impeller | |
| Type | MSX (four blades) |
| Diameter | φ2 200 |
| Bottom impeller | |
| Type | BDT (eight blades) |
| Diameter | φ2 200 |
| Air sparger | |
| Type | Distribution ring |
| Size | φ456×1 500 |
| Impeller clearance | 1.81D |
| Distance between the bottom impeller and the tank bottom mm |
550 |
| Heat-exchange area (m2) | 598.70 |
| Numbers of each group coil | 16 |
| Diameter of coil | φ76 |
| Numbers of coil group | 20 |
| Stirred speed (r/min) | 100 |
| Aeration rate (air flow rate/ broth volume，min–1) |
1:1−1.3 |
最终设计的反应器结构见图 2。
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| 图 2 根据时间常数分析理性设计的反应器基本结构 Fig. 2 Designed bioreactor based on time constant analysis. |
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由公式(6) 可以看出，要计算某一特定搅拌桨叶组合方式下的功率准数，必须先确定无量纲常数C1、C2、C3，由于没有完全一致的模型数据，因此本项目结合上述关联式及参考文献资料[2]以类似设计方案的HBT+2WHd桨叶组合方式下的结构系数计算其功率准数，在HBT+ 2WHd桨叶组合方式下C1=0.196 0、C2=0.247 0、C3=–0.097 9，根据该数值计算设计方案下的功率准数(Np) 为3.36。
通气条件下搅拌功率根据公式(7)、(8)、(9)、(10) 计算，同样取类似设计方案的HBT+ 2WHd桨叶组合方式下的结构系数，C1=0.519 0、C2=–0.132 0、C3=–0.076 2。
通气条件下kLa值根据公式(15) 计算，同样取类似设计方案的HBT+2WHd桨叶组合方式下的结构系数，C1×104=4.532、C2=0.500、C3=0.450、C4=–0.780。
利用上节的经验关联式可计算设计方案的功率、混合时间和传质系数，计算结果见表 6。
| Item | Designed scheme |
| VS (m/s) | 0.207 |
| Np | 3.360 |
| P (kW) without aeration | 801 |
| PG (kW) with aeration | 777 |
| PG/V (kW/m³) | 1.830 |
| 𝑡95 (s) (calculated with data obtained from HBT+2WHd model) |
11 |
| kLa (s–1) | 0.219 |
| tmt (s) | 4.600 |
可以看出，设计方案满足红霉素发酵的需求，kLa大于0.16 s–1，氧传递时间为4.6 s < 6.25 s，物料混合时间为11 s。
2.4 500 m3反应器设计方案的CFD模拟验证利用计算流体力学方法(CFD) 对上述设计的500 m3发酵罐的流场混合和传质特性进行了模拟，获取了对设计的搅拌结构下的流场特性进行了验证，结果见图 3、图 4及表 7。
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| 图 3 速度矢量图(A) 及云图(B) Fig. 3 Contour plot of vector (A) and flow velocity (B). |
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| 图 4 能量散耗率图(A) 及气含率分布图(B) Fig. 4 Contour plot of energy dissipation rates (A) and gas hold-up (B). |
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| Item | Designed scheme | |
| Gas hold up | 0.242 | |
| Energy dissipation rate TED (m2/s3) | 2.720 | |
| P/V (kW/m3) | Calculated by TED | 2.720 |
| Calculated by torque | 2.260 | |
| Bubble size (mm) | 32.000 | |
| a (m2/m3) | 55.130 | |
| kL (m/h) | 12.518 | |
| kLa (s−1) | 0.191 7 | |
| TED is the turbulent energy dissipation rate, which is used to evaluate the shear force. | ||
从速度矢量图和速度云图来看，该反应器在底部均形成了较好的径向流场，而在上部形成较明显的轴向流场，流型稳定，底层几乎无气泛。
2.4.2 能量散耗率和气含率分析从能量耗散率分布来看(图 4A)，该反应器的能量耗散率较大的区域集中在空气入口和桨叶附近，而在桨叶排出区形成的能量耗散率最高，与理论一致。从气含率分布来看(图 4B)，该反应器搅拌气体分散效果较好，气体从分布器进入底层搅拌后被迅速分散，反应器内整体气体分散比较均匀。
2.4.3 工程参数分析模拟得到的工程参数结果表明：对于气液传质能力，设计方案下反应器搅拌组合能提供最大传质系数kLa=0.191 7 s–1，氧传递时间常数为5.22 s，与前面采用关联经验式计算结果接近，均小于6.25 s，能提供发酵过程的最大耗氧需求，在每升发酵液的通气速率为1.3 L/min和最高转速为100 r/min时，流型稳定，气体分散良好，且模拟得到的通气条件下的搅拌功率及体积氧传递系数与采用经验关联公式计算得到的结果相近，传质性能满足设计要求。
2.4.4 500 m3反应器上工艺验证结果在50 L小试反应器、5 000 L中试反应器和本设计的500 m3反应器上进行红霉素发酵培养，检测发酵过程中DO、OUR参数及最终有效组分ERY-A，结果见图 5及表 8。
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| 图 5 不同规模反应器中红霉素发酵过程OUR和RQ曲线 Fig. 5 Time course of OUR and RQ during entire fermentation process in different scale bioreactors. |
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| Scale (L) | Titer (μg/mL) | Erythromycin A (μg/mL) | Erythromycin B (μg/mL) | Erythromycin C (μg/mL) |
| 50 | 9 538 | 7 251 | 294 | 530 |
| 5 000 | 9 435 | 7 189 | 285 | 512 |
| 500 000 | 9 505 | 7 222 | 313 | 469 |
图 5表明在500 m3反应器上红霉素OUR最高达到46.8 mmol/(L·h)，全程发酵转速在100 r/min以下，溶氧控制在25%以上。这说明反应器供氧能满足微生物发酵代谢需求，反应器达到设计目标；同时与50 L及5 000 L发酵罐上红霉素代谢曲线OUR及过程溶解氧DO对比，500 m3反应器上红霉素发酵OUR整体趋势与50 L及5 000 L反应器上基本相同。表明在500 m3反应器上，红霉素菌体细胞能较好地生长代谢。
表 8表明，500 m3反应器上红霉素发酵最终有效组分及化学效价与50 L小试规模及5 000 L中试规模发酵结果相当，进一步验证所设计的500 m3反应器满足红霉素高效发酵要求。
3 讨论红霉素属于典型的高耗氧型次级代谢发酵产物，本文对其发酵影响的关键参数进行研究，然后采用时间常数法进行500 m3巨型反应器设计，结果表明设计的反应器发酵达到了放大的效果。
在小试规模50 L发酵研究表明红霉素发酵可分为初级代谢阶段(0–约40 h) 及次级代谢阶段(40 h–发酵结束)，因此红霉素发酵前期0–40 h为其最大耗氧阶段(图 1)，此阶段氧的供应是影响红霉素发酵效率的关键因素[12] (表 1)。本文通过获取的发酵过程生理参数OUR表明其前期最大OUR为40–60 mmol/(L·h)，与前人研究结论一致[12]，同时此阶段最低溶解氧浓度(DO) 需控制在25%以上，据此计算其“氧消耗”时间常数，然后通过理性设计500 m3的反应器并进行CFD模拟验证并进行实际发酵生产验证，结果表明设计的500 m3反应器满足红霉素发酵要求。另外，在好氧微生物发酵的初级阶段，影响初级代谢的因素除了氧的供应外，底物的供应也可能存在限制进而影响微生物的生理代谢，因此红霉素的反应器设计也可以在满足氧传递需求的基础上结合底物传递需求进一步优化。
传统的反应器经典放大方法如“因次分析法”或“经验法则法”无法从微生物的生理代谢出发分析其对反应器的要求，只是简单单一参数的放大延伸，如依据“经验法则法”设计的红霉素375 m3反应器[13]经模拟测定其kLa为0.114 s–1，氧传递时间常数tmt大于6.25 s，设备的供氧并不能满足发酵条件正常波动情况下最低25%溶解氧的供应，也即无法满足放大后红霉素高效发酵对氧的需求，本文设计的反应器在规模大幅提高的情况下，氧传递的时间常数却更小从而满足红霉素发酵的需求；另一方面，与目前红霉素发酵先进方法比较[14]，本文设计的500 m3反应器罐内的气含率分布更为均匀及充分，在整个罐内不存在明显的不均匀区，而前人设计[14]的反应器存在罐内气体分布不均匀的问题，表现为整个罐内的气含率分布在底层桨以上均较为充分，而罐底则相对匮乏，有迟滞区存在，有可能对细胞生理代谢产生影响。因此，本时间常数法是一种有效的巨型发酵罐放大方法，可为巨型发酵罐设计提供借鉴作用。
4 结论本文通过研究红霉素细胞代谢生理特征参数的特性，发现发酵前期氧供应能力是影响红霉素产素的关键因素，因此将反应器的氧传递能力作为反应器放大设计的关键考虑因素。(1) 根据时间常数分析法和工程设计理论计算了红霉素发酵过程氧传递时间常数，并据此进行了500 m3大型反应器几何尺寸、搅拌系统和换热系统进行理性设计。(2) 通过CFD方法获取反应器内的各项工程参数并进行分析验证比较，确认设计方案满足红霉素发酵放大要求，通过分别在50 L小试规模、5 000 L中试规模和500 m3反应器上红霉素发酵验证了所设计的反应器满足红霉素发酵要求。由此可见，基于时间常数分析法分析生物反应关键限速因素，结合反应器理性设计及计算流体力学(CFD) 验证方法可实现生物发酵的理性放大设计，该方法可以广泛应用于各种生物发酵类型的反应器放大设计中。
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