中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 黄欣, 李益民, 杜聪, 袁文杰
- HUANG Xin, LI Yimin, DU Cong, YUAN Wenjie
- 来源于泗阳鞘氨醇杆菌的聚磷酸激酶的克隆表达及在ATP再生系统中的应用
- Expression of polyphosphate kinase from Sphingobacterium siyangensis and its application in ATP regeneration system
- 生物工程学报, 2022, 38(12): 4669-4680
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(12): 4669-4680
- 10.13345/j.cjb.220320
-
文章历史
- Received: April 19, 2022
- Accepted: June 6, 2022
2. 大连理工大学 宁波研究院, 浙江 宁波 315000
2. Ningbo Research Institute, Dalian University of Technology, Ningbo 315000, Zhejiang, China
三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP) 是一种带有3个磷酸基团的化合物,水解时释放大量能量,可作为生物体和化学反应能量的直接供体。体内的许多生物反应都需要ATP的参与,包括糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化等过程;在体外级联反应中,利用生物合成酶催化反应时也需要ATP等作为能量供体[1],但是ATP的昂贵价格导致反应成本提高,限制了该类反应的规模化生产[2]。因此构建ATP再生系统在体外能量依赖性级联反应中起着重要作用,可提高反应的经济性[3]。
ATP再生系统利用的酶主要是乙酸激酶、丙酮酸激酶和聚磷酸激酶[4]。乙酸激酶[5]以二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP) 和乙酰磷酸(acetylphosphate, ACP) 为底物合成ATP,虽然反应效率较高,但是底物ACP不稳定,价格贵,限制了其在工业化中的应用;丙酮酸激酶虽然可以在较低ADP浓度情况下有效生成ATP[6],但其磷酸供体为昂贵且不易保存的磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP),并且其催化反应产物为丙酮酸,无法循环使用,大量积累还会抑制丙酮酸激酶的作用[7];聚磷酸激酶以无机聚磷酸盐(inorganic polyphosphate, polyP) 为磷酸供体,将ADP催化合成ATP。由于polyP容易制备、价格低廉,因此广泛用于催化ATP再生[8-9]。
现有的聚磷酸激酶(polyphosphate kinase, PPK) 主要分为两种:PPK1和PPK2。PPK1,一般由600–700个氨基酸组成,在以ATP和polyP作为底物的反应中,偏向于合成polyP,即催化ATP上的磷酸转移到polyP上,优先进行ATP的降解[10];PPK2与PPK1无同源性,约由230个氨基酸组成,催化底物磷酸化,且底物范围广泛,包括单磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)、ADP等[11-12],部分PPK2可以直接利用AMP催化生成ATP[13]。基于PPK的ATP再生系统已用于合成多种化合物[14],如:谷胱甘肽[15]、d-木酮糖-5-磷酸[16]、l-茶氨酸[17]、尿苷三磷酸[18]等,但多数使用的是PPK1酶。
PolyP是一种由数十到数百个正磷酸盐残基通过磷酸酐键连接而成的线性聚合物[14]。大多数PPK仅在长链polyP (超过10个磷酸残基) 存在时才具有活性,然而与长链polyP相比,低成本的短链polyP (少于10个磷酸残基) 具有明显更好的工业竞争力[6],因此,寻找可以利用短链polyP在体外酶催化系统中合成ATP的PPK意义重大。
本文研究了来源于泗阳鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis) 的聚磷酸激酶(PPK2),完成重组质粒的构建、蛋白的表达及酶活的测定,并将其应用于丙谷二肽(l-alanyl- l-glutamine, Ala-Gln) 合成过程中的ATP再生,证明了泗阳鞘氨醇杆菌的PPK2可利用短polyP为底物进行ATP再生,为依赖ATP的催化反应体系的能量再生提供了新酶的来源。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、质粒和引物泗阳鞘氨醇杆菌(S. siyangensis) 1.6855、大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、BL21 (DE3) 由本实验室保藏;表达载体pET-29a(+) 由本实验室保藏;本研究所用PCR引物为PPK-f (5′-TTCCATATGGCAGAGTACGATTTAAATGAACTTCAGA-3′) 和PPK-r (5′-TAAAGCGGCCG CATCGTGTTTTGTGACGAAAGAATCT-3′),由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。
1.1.2 实验试剂质粒提取试剂盒、产物纯化试剂盒购自南京诺威赞生物技术公司;DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶和牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 购自TaKaRa公司;异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl- beta-d-thiogalactopyranoside, IPTG) 和抗生素购自生工生物工程(上海) 股份有限公司;蛋白分子量标准品(Marker) 购自北京索莱宝科技有限公司;高效液相色谱(HPLC) 使用的甲醇等溶剂均为色谱纯级别,购自Sigma公司。
1.2 方法 1.2.1 重组菌株构建以泗阳鞘氨醇杆菌S. siyangensis 1.6855的菌液为模板,使用特异性引物对PPK-f、PPK-r克隆目的基因ppk2 (NCBI reference sequence: WP_145326873.1),并完成PCR产物纯化。利用限制性内切酶(Nde I和Not I) 将目的基因ppk2和载体pET29a双酶切,纯化后利用T4 DNA连接酶于16 ℃连接16 h,转入E. coli DH5α感受态细胞中,于卡那霉素(kanamycin, Kana) 抗性平板上筛选,37 ℃培养过夜,之后挑取单菌落进行菌落PCR验证。阳性的单菌落转接小瓶,提取质粒进行双酶切验证,获得重组质粒pET29a-ppk2,并将其转化入E. coli BL21(DE3),从而获得重组菌株E. coli BL21 pET29a-ppk2。
1.2.2 重组蛋白的表达及表达条件优化挑取重组菌株E. coli BL21 pET29a-ppk2加入含有50 μg/mL Kana的小瓶中过夜活化,之后以1% (V/V) 的接种量接入含有50 μg/mL Kana的摇瓶中进行扩培,当OD600=0.6–0.8时,添加终浓度为0.6 mmol/L的诱导剂IPTG进行蛋白诱导表达。利用低温离心机以4 ℃、7 000 r/min的条件离心10 min收集菌体,并用纯水洗涤菌体一次,之后用磷酸缓冲盐(phosphate-buffered saline, PBS) 缓冲液(pH 7.5) 重悬菌体,添加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF) 后利用超声细胞破碎仪进行破碎,4 ℃、7 000 r/min离心10 min得到细胞破碎上清液。利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 检测蛋白的表达情况。调整蛋白的诱导温度、诱导时间、诱导剂添加量,探索出蛋白的最适表达条件。
1.2.3 酶的纯化在蛋白的最适表达条件下完成重组蛋白的表达,上清液通过HisTrap HP亲和层析Ni柱进行纯化,首先使用漂洗缓冲液(20 mmol/L咪唑,10 mmol/L磷酸二氢钠,10 mmol/L磷酸氢二钠,500 mmol/L氯化钠) 处理柱子,上样后,再次使用漂洗缓冲液除去结合力弱的杂蛋白,最后用洗脱缓冲液(300 mmol/L咪唑,10 mmol/L磷酸二氢钠,10 mmol/L磷酸氢二钠,500 mmol/L氯化钠) 洗脱目旳蛋白,得到的目旳蛋白后通过SDS-PAGE检测其均一性,利用二辛可宁酸(bicinchonininc acid, BCA) 法测定蛋白浓度。
1.2.4 酶活测定方法聚磷酸激酶催化反应如下:ADP+(Pi)n→ ATP+(Pi)n−1,由此,可通过检测ATP生成率测定酶活。ATP浓度使用高效液相色谱(HPLC) 测定,HPLC检测条件经优化后为:色谱柱为C18 (5 μm,4.6 mm×250 mm),紫外检测器,检测波长为254 nm,柱温25 ℃,进样量为20 μL,流动相为50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液,等梯度洗脱,流速为1 mL/min。利用以上检测条件进行ATP、ADP标准曲线的制作,发现两者具有较好的线性,因此使用外标法检测ATP、ADP的含量。反应体系为10 mmol/L的ADP,15 mmol/L的六偏磷酸钠,30 mmol/L的Mg2+的PBS溶液,添加0.5 mg/mL PPK,调整pH为8.0后,于37 ℃的水浴锅中反应3 h,99 ℃金属浴加热5 min终止反应,HPLC检测ATP的浓度,计算ATP产率。ATP产率=ATP实际产量/ATP理论产量×100%。聚磷酸激酶酶活性定义为:每分钟生成1 μmol ATP为1 U。
1.2.5 聚磷酸激酶与ATP依赖酶联用l-氨基酸连接酶YwfE是一种ATP依赖酶,它在ATP存在情况下催化两个l-氨基酸合成多种功能性二肽[19],例如YwfE可以丙氨酸(Ala) 和谷氨酰胺(Gln) 为底物合成丙谷二肽(Ala-Gln),如图 1所示,而Ala-Gln常被用作术后病人的必需营养注射液[20-22]。
为证明该PPK2酶的适用性,在体外利用l-氨基酸连接酶(YwfE) 与聚磷酸激酶(PPK2) 作为模式反应体系,以Ala和Gln为底物,利用ADP和polyP,催化生成Ala-Gln。通过高效液相色谱法测定产生的Ala-Gln的浓度,从而测定YwfE与PPK2协同作用的效果。反应体系为:30 mmol/L的Ala,60 mmol/L的Gln,10 mmol/L的ADP,15 mmol/L的六偏磷酸钠,45 mmol/L的Mg2+,于27 ℃的水浴中反应,99 ℃金属浴加热5 min终止反应,恢复至室温后离心,取上清液,采用高效液相色谱法测定Ala-Gln的浓度,并计算产率。Ala-Gln产率=Ala-Gln实际产量/Ala-Gln理论产量×100%。
2 结果与分析 2.1 重组质粒pET29a-ppk2的构建以S. siyangensis 1.6855为模板,使用引物对PPK-f、PPK-r克隆聚磷酸激酶编码基因ppk2,经琼脂糖凝胶电泳分析,获得约800 bp的目的基因条带(实际大小为810 bp),大小与预期相符(图 2A)。目的基因ppk2与载体pET29a经限制性内切酶Nde I和Not I双酶切后连接,构建重组表达质粒pET29a-ppk2并转化克隆宿主。重组质粒双酶切验证产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约810 bp的目的基因片段和约5 400 bp的载体片段,如图 2B所示,证明重组质粒已成功构建。
2.2 PPK2蛋白的表达及表达条件优化重组菌经过小瓶活化、摇瓶培养、诱导表达后,收集表达PPK2重组菌的全细胞、上清液和破碎沉淀进行SDS-PAGE,发现大小约为30 kDa的目的蛋白PPK2 (实际大小约为29.7 kDa) 成功表达,并且主要存在于上清液中,说明蛋白以可溶状态存在,结果如图 3所示。
为优化PPK2蛋白的表达条件,改变PPK2诱导时的温度(16 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃)、时间(4、8、12、16、20 h)、诱导剂浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L),确定蛋白最适的诱导条件,结果如图 4所示。诱导温度对于蛋白表达的影响不大,低温诱导表达量略高,诱导时间大于12 h后蛋白表达量几乎一致,没有诱导剂时蛋白不表达,当诱导剂浓度为0.6 mmol/L以上时蛋白表达效果最好,因此目的蛋白PPK2的最适表达条件为16 ℃诱导12 h,诱导剂浓度为0.6 mmol/L。
2.3 PPK2蛋白纯化PPK2的C端带有His标签,而且表达的蛋白以可溶状态存在于上清液中,因此采用非变性条件下金属螯合层析(Ni2+) 方法进行该蛋白的分离纯化,结果如图 5所示,PPK2蛋白纯化后经过BCA法测定,浓度为1.2 mg/mL。
2.4 PPK2催化生成ATP的反应条件优化PPK2的反应体系包括0.5 mg/mL PPK2,10 mmol/L的ADP,15 mmol/L的六偏磷酸钠,30 mmol/L的Mg2+的PBS缓冲液,调整pH为8.0后,于37 ℃的水浴中反应3 h,99 ℃金属浴加热5 min终止反应,恢复至室温后离心,上清液进行高效液相色谱法分析,测定ATP的浓度。为优化反应条件,分别改变上述反应体系中的温度(22 ℃、27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃)、pH (6、7、8、9、10)、Mg2+浓度(0、10、20、30、40 mmol/L) 和反应底物浓度(设置ADP与六偏磷酸钠浓度分别为:5和10、5和20、10和15、10和20、15和30 mmol/L),其他条件不变,进行反应。磷酸供体三聚磷酸钠和六偏磷酸钠对ATP产率的影响也进行了考察,结果如图 6所示。温度为22–42 ℃时,ATP产量均较高,最适温度为37 ℃ (图 6A);当pH在7–10时ATP产量较高,且无显著性差异,其中最适pH为7 (图 6B);没有Mg2+时不发生反应,随着Mg2+浓度增加,ATP产量也在增加,镁离子浓度为30 mmol/L比20 mmol/L时的ATP产量有显著提升,镁离子浓度为30、40 mmol/L左右时ATP产量最高(图 6C)。为节约底物,后续反应选择镁离子浓度为30 mmol/L;如图 6D所示,该PPK2可以短链polyP为底物高效生成ATP,反应0.5 h,ATP的产率就达到了理论值的60%以上,以六偏磷酸钠为底物时ATP的产率约为三聚磷酸钠为底物时的3.5倍,因此后续选择六偏磷酸钠作为磷酸供体;由图 6E–F可见,当ADP与polyP的浓度分别为5和20 mmol/L时,ATP产量最高,且具有显著性优势。
2.5 PPK2催化ATP生成的产率以0.5 mg/mL PPK2为酶源,以PBS作为缓冲液,ADP与六偏磷酸钠浓度分别为5 mmol/L和20 mmol/L时,在最适温度为37 ℃、pH为7的条件下反应,结果如图 7所示,ATP在反应0.5 h内产量快速升高,在3 h左右产量达到峰值,为3.55 mmol/L,达到理论值的71.0%。
对PPK2的酶活性进行了测定,以0.5 mg/mL PPK2为酶源,以PBS作为缓冲液,反应体系为8 mL,ADP与六偏磷酸钠浓度分别为10 mmol/L和15 mmol/L,在温度为37 ℃、pH为7的条件下反应10 min时,ATP产量可以达到4.98 mmol/L,此时PPK2的酶比活达到了124.5 U/mg。
2.6 PPK2与YwfE联用生产二肽近年来,多酶级联的体外合成应用广泛[23],成功用于生产各种药物及化学品。为证明来源于S. siyangensis PPK2的适用性,在体外利用l-氨基酸连接酶(YwfE) 与聚磷酸激酶(PPK2) 协同作用,生产Ala-Gln。
以YwfE和PPK2纯酶为酶源,反应体系为:30 mmol/L的Ala,60 mmol/L的Gln,10 mmol/L的ADP,15 mmol/L的六偏磷酸钠,45 mmol/L的Mg2+,保持两种酶浓度一致,调整pH为8.0,于27 ℃的水浴中反应,99 ℃金属浴加热5 min终止反应。为优化反应条件,分别调整YwfE和PPK2的酶浓度(1︰1、1︰2、1︰5、1︰10)、两酶联用的时间(PPK2先反应0、1、2、3、4 h后再与YwfE联用)、两酶联用时PPK2的两种底物浓度(5和10、5和20、10和15、10和20、15和30 mmol/L)、反应温度(27、32、37 ℃) 和反应体系pH (6、7、8、9、10),其他条件不变,进行反应,结果如图 8所示。如图 8A所示,当YwfE和PPK2的浓度比为1︰5时,Ala-Gln产量显著高于酶浓度比为1︰2时,由图 8B,可见PPK2先反应3–4 h后再与YwfE联用合成Ala-Gln时,产物产量略有提高,但整体看来无显著性差异,PPK2的酶量多或者先开始反应都可以促进ATP的循环再生和积累,从而推动YwfE催化生成Ala-Gln;如图 8C可见,在YwfE与PPK2两酶联用时,PPK2的底物ADP和六偏磷酸钠的最适浓度分别为10和15 mmol/L,此时Ala-Gln的产量最高,且显著高于底物浓度为5和20 mmol/L、10和20 mmol/L时的Ala-Gln产量;如图 8D可见,两酶联用在27–37 ℃均具有较好活性,温度为27 ℃时,Ala-Gln产量最高,显著高于32 ℃时的产量;如图 8E可见,两酶联用在pH为7–8时具有较好活性,其中pH为8时Ala-Gln产量最高。
综合以上结果,考察了优化条件下的双酶联用时Ala-Gln的产量。以0.3 mg/mL YwfE和0.9 mg/mL PPK2为酶源,反应体系为:30 mmol/L的Ala,60 mmol/L的Gln,10 mmol/L的ADP,15 mmol/L的六偏磷酸钠,45 mmol/L的Mg2+,首先将PPK2加入反应体系,在37 ℃、pH为7的条件下反应3 h,之后将YwfE加入反应体系中,并且在温度为27 ℃、pH为8的条件下反应,取样进行分析,结果如图 9所示,PPK2和YwfE在7 h左右生成Ala-Gln的产量最高,为19.23 mmol/L,产率达到理论值的64.1%,与直接添加ATP相比,反应速率和Ala-Gln产量均有提高,且显著高于来源于E. coli MG1655的PPK1和Rhodobacter sphaeroides的PPK2,后两种PPK与YwfE联用时,温度为37 ℃、pH为9.0条件下产量最高,转化率分别为45.0%、51.3% (转化率=反应消耗的Gln量/反应加入的Gln量×100%)[24]。
3 讨论工业生产中,很多高附加值化学品的生产过程都会用到ATP依赖性的生物合成酶,而ATP价格昂贵,直接在反应中添加会大幅度提高反应成本,不符合经济效益,因此利用ATP再生系统循环产生ATP成为降低反应成本的一种有效方法。虽然文献曾报道丙酮酸激酶、乙酸激酶可用于ATP再生[4],但综合考虑底物是否廉价易得、反应是否方便且无副产物等因素,PPK酶是更为合适的选择[25]。而目前使用的PPK酶多为PPK1,以聚合度 > 10的聚磷酸盐为底物,并且生成ATP的活性还不足。
本研究克隆并成功表达了来源于泗阳鞘氨醇杆菌的聚磷酸激酶(PPK2),通过与已报道PPK的酶活对比发现(表 1),发现本文中来源于S. siyangensis 1.6855的PPK2可以短链polyP为底物合成ATP,且在22–42 ℃、pH为7–10时保持较好活性,在最适条件下,PPK的酶活达到了124.5 U/mg,ATP的产率达到了71.0%,是目前文献报道中蛋白质量最小、ATP产率最高的聚磷酸激酶。并且该酶催化范围具有普适性,可以适应较宽的反应温度和pH范围,可与最适条件不同的ATP依赖酶偶联完成ATP的再生循环。在利用PPK2构成ATP再生系统与l-氨基酸连接酶(YwfE) 联用时,可以催化Ala-Gln的生成,且Ala-Gln产率与直接添加ATP相当,高于其他来源的同类酶的生产效率20%左右。本研究为功能性二肽的生产及其他种类的高附加值的活性物质的生产提供了很好的ATP循环系统的酶源。
PPK type | Strain source | Protein size (kDa) | PolyP degree of polymerization |
Maintain good enzyme activity |
ADP conversion | Enzyme specific activity (U/mg) | References | |
Temperature | pH | |||||||
PPK1 | Thermus thermophilus | – | 65.0 | 60.0–80.0 | 5.0–6.0 | – | 1.2×10–4 | [26] |
PPK2 | Meiothermus ruber NBRC 106122 |
31.6 | 65.0 | 60.0–72.0 | 7.0 | – | 2.7 | [27] |
PPK1 | E. coli MG1655 | 77.0 | 6.0 | 42.0–48.0 | 7.5–8.5 | 15.4% | 0.5 | [24] |
PPK2 | Rhodobacter sphaeroides | 38.2 | 6.0 | 42.0–48.0 | 7.5–8.5 | 20.1% | 0.7 | [24] |
3.0 | – | – | – | No | ||||
PPK2 | Hydrogenophilaceae bacterium | 44.0 | 6.0 | 25.0–35.0 | 6.0–7.0 | – | 189.0±13.0 | [1] |
PPK2 | Nocardioides dokdonensis | 41.0 | 6.0 | 25.0–35.0 | 6.0–7.0 | – | 124.0±20.0 | [1] |
PPK2 | Sphingobacterium siyangensis (1.6855) | 29.7 | 6.0 | 22.0–42.0 | 7.0–10.0 | 71.0%±2.6% | 124.5±6.2 | This study |
3.0 | 22.0–42.0 | 7.0–10.0 | 20.0% | – | ||||
–: no such data in relevant literature. |
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