海藻糖是由两个葡萄糖分子以α, α-1-1糖苷键构成的非还原性糖，性质稳定。海藻糖酶(trehalase) 可将其水解为葡萄糖，在食品医药、发酵工业等领域应用广泛^[1-3]。酵母具有利用糖质原料合成海藻糖的能力，在高浓度糖质底物发酵体系中酵母甚至能够合成4%以上的海藻糖，成为发酵液中残糖的主要部分，导致原料利用率下降。为此，杜邦公司在2016年推出Synerxia发酵技术，其核心创新是在酶制剂中加入了海藻糖酶，宣称可降低糖耗并增产乙醇2%。诺维信公司也在2017年推出了含海藻糖酶的全新淀粉酶产品，其目标是降低二糖残留值70%，此举进一步推动了海藻糖酶的应用。目前，在超高浓度(very high gravity, VHG) 乙醇发酵技术中，糖质/淀粉质原料的添加量高达27%，产物乙醇的最终浓度达到15%–18%^[4]，高浓度乙醇和低pH环境对海藻糖酶的酶学性能提出了更高的要求。近年来国内外学者已寻找到一些酸性海藻糖酶基因^[5-7]，但仍需在新酶基因筛选、酶工程改造以及应用的稳定性和耐受性等方面加强研究。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种和质粒

克隆菌株大肠杆菌(Escherichia coli) JM109、表达质粒pET-3b、pET-28a、pMA5和表达宿主E. coli BL21(DE3)、E. coli Rosetta (DE3)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WB600均为实验室保藏。

1.1.2 培养基

Luria-Bertani (LB) 培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10 (固体平板加入琼脂粉20)。

Terrific broth (TB) 培养基(g/L)：蛋白胨12，酵母提取物24，甘油5，K₂HPO₄·3H₂O 12.54，KH₂PO₄ 2.31。

筛选培养基(g/L)：海藻糖15，胰蛋白胨5，KCl 1，KH₂PO₄ 1，MgSO₄∙7H₂O 0.5，CaCO₃ 1，pH 7.0；固体培养基在其中加入琼脂20 g/L。

1.1.3 主要仪器和试剂

一步重组克隆试剂盒ClonExpress® Ultra One Step Cloning Kit购自Vazyme公司，氨苄青霉素(ampicillin, Amp) 购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。高效液相色谱1220 Infinity II购自Angilent公司，液相色谱柱Dikma CarboPac Ca²⁺ (300 mm×8.8 mm, 6 μm) 购自Dikmatech公司。酵母提取物分别购自安琪酵母股份有限公司、国药集团化学试剂有限公司、杭州百思生物技术有限公司、上海麦克林生化科技有限公司、赛默飞世尔科技(中国) 有限公司、乐斯福(明光) 有限公司。

1.2 野生菌筛选

在江苏省无锡市长广溪湿地公园选取采样点，提前10 d内采用海藻糖驯化2次。将采集的土壤样品悬液培养，取上清进行筛选。挑选平板菌株分别接种于液体筛选培养基培养36 h，通过测定海藻糖酶活筛选产酶菌株。提取野生菌基因组，以通用引物27F和1492r (表 1) 扩增16S rDNA并测序，与GenBank中已有的序列比对，进行菌种鉴定。

1.3 海藻糖酶基因克隆和序列分析

从NCBI中获取菌株的基因组信息，经分析后设计引物F1和R1，从野生菌A4扩增出编码海藻糖酶的基因PCTre。回收扩增产物，同时线性化pET-3b、pET-28a、pMA5质粒，并用一步重组克隆试剂盒将PCR扩增产物和线性化质粒连接，转化到E. coli JM109中，涂布于带有Amp抗性的LB平板，37 ℃培养过夜，分别获得海藻糖酶表达载体pET3b-PCTre、pET28a-PCTre、pMA5-PCTre，取单菌落进行菌落PCR鉴定并进行DNA测序验证。

PCTre特性分析、序列及结构分析使用的数据库或软件主要包括：ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)、PredictProtein (https://open.predictprotein.org)、ClustalW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)。

1.4 海藻糖酶的异源表达与纯化

将海藻糖酶表达载体pET3b-PCTre和pET28a-PCTre分别转入E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)中，表达载体pMA5-PCTre转入B. subtilis WB600中，挑取单菌落于10 mL LB培养基中培养，以2%的接种量接种到30 mL LB培养基中，37 ℃培养36 h进行组成型表达，其中pET-28a载体需采取20 ℃ IPTG诱导2–4 h。结束后，离心收集菌体，超声破碎，取上清进行酶活测定和SDS-PAGE分析。将上清液过0.22 μm的滤膜，镍柱纯化海藻糖酶蛋白。

1.5 酶学性质研究 1.5.1 酶活测定

采用3, 5-二硝基水杨酸(3, 5-dinitrosalicylic acid, DNS) 比色法测定。参照文献[8]，待测酶液适当稀释后，取150 μL进行测定，37 ℃反应15 min，加入DNS试剂显色，沸水浴终止反应，冷却后使用酶标仪在540 nm处测量吸光值。

海藻糖酶酶活(1 U) 定义为上述实验条件下，1 mL的酶液每分钟产生1 μmol还原糖所需的酶量，测定均重复3次。

1.5.2 海藻糖酶底物特异性研究

分别以10%的蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖作为底物，测定海藻糖酶对双糖的催化活性。

1.5.3 最适pH和pH稳定性测定

用不同pH的磷酸缓冲液代替去离子水稀释酶液，测定酶的最适pH；将酶液置于不同pH的缓冲液中，30 ℃处理1 h，测定酶活，以不同pH条件下最初的酶活为参照，绘制pH稳定性曲线。

1.5.4 最适温度和温度稳定性研究

改变酶活测定方法中的反应温度，选取25–70 ℃范围内的10个点分别测定酶活，以最高酶活作为对照绘制酶的温度影响曲线；选取不同的温度先孵育1 h，再进行酶活测定，考察不同温度条件下稳定性。上述反应体系pH为5.5，其余条件均同1.5.1方法。

1.5.5 金属离子对酶活的影响

配制Ca²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、K⁺、Na⁺、Fe²⁺、Sn²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Co²⁺和Li⁺等金属离子溶液，分别配制最终浓度为1、5、10 mmol/L反应体系，检测不同金属离子对酶活的影响。

1.5.6 有机溶剂和表面活性剂对酶活的影响

分别配制甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈、丙酮溶液和吐温40 (Tween-40)、吐温80 (Tween-80)、曲拉通100 (Tritonx-100)、曲拉通114 (Tritonx-114)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)、甘油、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT) 和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 溶液，配制最终浓度为1%、5%、10%的反应体系，考察上述试剂对酶活性的影响。

1.6 乙醇发酵模拟体系的应用评价

以含有15%–20%乙醇、15%葡萄糖、10%淀粉、5%–10%海藻糖的pH 4.0溶液体系模拟VHG乙醇发酵体系^[9]，添加不同浓度的海藻糖酶PCTre，维持体系温度30 ℃，考察体系中海藻糖的水解程度，评估PCTre在乙醇工业发酵中的应用潜力。

1.7 水解酵母提取物中的海藻糖研究

取不同公司的酵母提取物配制成5%溶液，加入PCTre，在37 ℃、pH 5.5条件下水解60 min，测定海藻糖含量。确定酶解提取物最适宜的温度、pH、酵母提取物浓度、加酶量和水解时间。

1.8 发酵罐产酶

活化重组菌E. coli BL21(DE3)/pET3b- PCTre，挑取单菌落接种到一级种子培养基中培养12 h，以2%的接种量接种到二级种子培养基中并培养10–12 h，再以10%的接种量接种5 L发酵罐(采用TB培养基，装液量为3 L)。初始培养温度37 ℃、pH 7.2，搅拌转速300–600 r/min，采取通气与搅拌联动控制，溶氧水平不低于30%。每隔4 h取样检测菌浓度(OD₆₀₀) 和海藻糖酶酶活。发酵8 h后，流加甘油进行补料发酵。发酵过程中流加氨水和磷酸，控制pH为7.2。

2 结果与分析 2.1 产海藻糖酶的野生菌筛选

从土壤中分离出一株产海藻糖酶的野生菌(编号为A4)，其菌落呈乳白色小圆形，边缘整齐，无芽孢，触酶检测阴性，甲基红试验和伏普试验阳性，可水解葡萄糖、蔗糖和淀粉，不利用乳糖，能利用柠檬酸盐。革兰氏染色阴性(图 1A)。该菌株的16S rDNA序列长度为1 408 bp，经BLAST比对与Pectobacterium属(GenBank登录号：JF430157.1、HM013841.1等) 的序列同源性大于99%。结合形态特征和生理生化特性，将其鉴定为杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)。

2.2 海藻糖酶基因的克隆与序列分析

从A4基因组中扩增获得PCTre编码序列，其序列全长为1 659 bp，共编码552个氨基酸，含一段长度为27个氨基酸的信号肽(1–27)。ExPASy预测其分子量为63 kDa，等电点pI为5.58。PCTre与来自潘氏泛酸菌(Pantoea cypripedii) 的海藻糖酶TreF (GenBank登录号：MBP2194980.1) 的最大相似性只有86.5%，存在70个差异位点。

2.3 海藻糖酶PCTre的异源表达与纯化

不同的表达体系对PCTre的表达水平有较大的差异(表 2)，其中E. coli BL21(DE3)/ pET28a-PCTre无特征蛋白，E. coli BL21/ pET3b-PCTre酶活最高，达到289 U/mL。SDS-PAGE结果表明PCTre的蛋白大小为63 kDa左右，与理论值一致。尽管pET-3b载体中表达的蛋白条带较浅(图 2A)，但酶活很高，高于pMA5和pET-28a载体表达水平(图 2B、2C)。推测由于pET-28a是诱导型表达载体，其表达速度过快影响了蛋白的正确折叠，导致非活性表达。

通过镍柱亲和层析纯化获得了条带单一的目的蛋白(图 2D)，蛋白比酶活为1 251 U/mg。目前报道的重组海藻糖酶，基本低于1 000 U/mg^{[3, 7, 9]}，杓兰果胶杆菌海藻糖酶显示出良好的开发潜力。

2.4 海藻糖酶酶学性质分析 2.4.1 酶的催化特性研究

动力学研究显示，杓兰果胶杆菌海藻糖酶PCTre的K_m=0.12 mmol/L，V_max=1.51 mmol/min (图 3)。与其他海藻糖酶的动力学参数相比(表 3)，PCTre具有良好的底物亲和力。

底物专一性实验表明，PCTre具有高度底物特异性，只作用于海藻糖，可作为工具酶用于海藻糖的酶法检测，这也是国际上海藻糖酶的另一个研究热点^[10]。

2.4.2 最适pH和pH稳定性研究

海藻糖酶PCTre的最适pH为5.5，但在pH 4.0–6.0范围内相对酶活力有80%以上(图 4A)，属于酸性海藻糖酶类型。将PCTre于pH 4.0、4.5、5.0酸性缓冲液中处理8 h (图 4B)，剩余酶活超过80%，说明PCTre具有较高的pH稳定性。已报道的海藻糖酶大部分最适pH在中性或中性偏碱，如来自昆虫的甜菜夜蛾海藻糖酶最适pH为9.15^[12]；来源于微小杆菌属(Exiguobacterium sp.) 的海藻糖酶最适pH为8.0^[13]。已发现的酸性海藻糖酶主要来自古菌或真菌，如嗜酸古菌(Thermoplasma volcanium)^[14]、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)^[5]和真菌光滑念珠菌(Candida glabrata)^[7]等能够产生一些酸性海藻糖酶，但比酶活或重组表达后酶活均较低。

2.4.3 最适温度和温度稳定性研究

PCTre在35 ℃条件下酶活最高(图 5A)，在25–50 ℃下相对酶活超过60%；在不同温度下保温1 h，将其分别置于30 ℃、35 ℃、40 ℃条件下，PCTre在8 h内仍保留80%以上的活力，16 h内保留50%以上的活力(图 5C)。

2.4.4 金属离子对海藻糖酶活性的影响

不同浓度的Mn²⁺离子对酶活均有较为明显的促进作用，5 mmol/L和10 mmol/L浓度的Mn²⁺处理下相对酶活超过240% (图 6)，与董良波研究的海藻糖酶MthT性质类似^[3]；此外，Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺的对酶活具有较强的抑制作用。

2.4.5 有机溶剂和表面活性剂对海藻糖酶活性的影响

PCTre对有机溶剂具有良好的耐受性，即使在10%的丙酮体系中，其相对酶活也接近60%；在10%的乙醇体系中，其相对酶活接近90% (图 7A)。表面活性剂等试剂品种对酶的活性影响差异较大，且对浓度比较敏感，如曲拉通X-114、吐温-40对酶活均有显著提升，0.5%吐温-40能使海藻糖酶相对酶活达到178.7%。SDS、DTT、EDTA等试剂在本实验浓度下对酶活均存在一定的抑制作用(图 8)。

郭婷婷也探究了有机溶剂对座壳孢菌海藻糖酶的影响，发现甲醇、戊醇、丙酮、二氧六环均能激活该酶^[15]，但海藻糖酶在高浓度乙醇体系下的耐受性研究尚未见报道。考虑到海藻糖酶的产业应用导向，本文进一步在10%、15%、20%乙醇体系对PCTre活性进行评价(图 7B)。研究显示，12 h后PCTre仍可保留70%以上的酶活，24 h后剩余酶活也超过了60%。

PCTre显示出十分良好的乙醇耐受性。通常，亲水性溶剂容易破坏酶分子表面的水化层导致酶活性降低^[16-17]，而PCTre的耐受性可能与其蛋白表面上较多的极性氨基酸有关。初步结构分析表明，PCTre中的表面极性氨基酸远多于其他海藻糖酶(图 9)，互相形成了大量氢键有利于紧密结合水分子，维持表面水化层，这是保持良好稳定性的一个重要理论基础^[18]。

2.5 在乙醇发酵VHG模拟体系中的应用

VHG乙醇发酵时，发酵液中葡萄糖浓度通常超过20%，发酵后期乙醇浓度超过12%，甚至达到18%。在高渗和高浓度乙醇的环境压力下，且发酵液pH值在4.5以下，耐受性不良的海藻糖酶发挥的作用有限^[19]。本实验在含有5%海藻糖和15%乙醇的模拟乙醇发酵VHG体系条件下，当添加500 U/L PCTre时，可在12 h内完全水解海藻糖；当乙醇浓度提高到20%时，使用1 000 U/L的加酶量也可以在16 h内完全水解海藻糖(图 10)。实际生产环境中，酵母合成的海藻糖是逐步的，乙醇的浓度也是逐渐增加的，因此杓兰果胶杆菌海藻糖酶有望在工业乙醇发酵中发挥潜力。

2.6 酶法水解酵母提取物含有的海藻糖

酵母能够合成大量海藻糖，通常酵母提取物中含有5%–12%的海藻糖成分^[20]。尽管海藻糖是一种可供利用的良好碳源，在某种程度上还具有细胞保护功能。但在一些对培养基中碳源种类和含量有严格限制的情况下，需要尽可能剔除这些海藻糖成分或将其转化为葡萄糖，避免对产物代谢的干扰^[21]。国际上有多家公司已采用水解法生产低含量或无海藻糖成分的酵母粉产品。本研究尝试使用PCTre酶液处理不同来源的酵母提取物，结果见表 4。在pH 5.5、36 ℃、样品浓度5%条件下，加酶量仅需要20 U/g，20 min就可以快速水解其中的海藻糖。

2.7 罐上产酶特性

采用分批发酵，在8 g/L甘油为碳源的发酵培养基中，重组菌E. coli BL21(DE3)/pET3b- PCTre生长良好，20 h后OD₆₀₀达到17.3，随后进入稳定期；酶活在28 h达到2 150 U/mL，36 h后逐渐下降(图 11A)。当采用补料发酵方式时，发酵32 h时得到最高OD₆₀₀值为74.2；发酵28 h时得到最高酶活为4 130 U/mL，是分批发酵得到的最高酶活的1.92倍(图 11B)。目前重组海藻糖酶的高酶活表达主要见于真核表达体系，如来源于嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、瘤孢梭孢壳(Myceliophthora sepedonium)的海藻糖酶基因MthT和TreM在黑曲霉中得到表达^[3]，但其发酵周期较长。目前大部分研究仍处于实验水平。

3 结论

本文筛选获得一株产海藻糖酶的野生菌，通过形态学和分子生物学鉴定其为杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)，克隆了该菌株的海藻糖酶编码基因PCTre并在大肠杆菌体系实现了异源表达，酶活为289.40 U/mL，蛋白分子量为63 kDa。5 L罐上发酵，28 h时酶活可达到4 130 U/mL。酶学性质研究表明，PCTre能够在酸性条件下发挥良好的水解作用，反应最适pH为5.5，最适温度为35 ℃。PCTre具有良好的热稳定性，并能够耐受有机溶剂，在乙醇体系下酶活能维持较长时间。在模拟乙醇发酵环境中，PCTre可在12 h内完全水解5%的海藻糖，预期在乙醇发酵工业中有较好的潜力。