肌酐是哺乳动物肌酸的最终代谢产物^[1-3]。正常情况下，体内肌酐通过肾脏以相对恒定的速率排出体外^[2-4]，从而维持在一个相对稳定的状态。因此血液和尿液肌酐水平是指示肾脏问题、甲状腺功能障碍和肌肉疾病的重要临床指标^[5-7]。测量血清和尿液中肌酐水平的主要方法分为两大类：基于Jaffe反应的化学方法和酶促反应方法^[8]。在Jaffe反应中，肌酐中的甲基或者亚甲基在碱性条件下与苦味酸反应并变成橙红色复合物，通过比色法进行测定^[9-10]。该方法操作简单且成本较低，但是化学检测方法专一性不强，灵敏度较差^[11-12]，因此在临床检测中基本停用^[13]。目前临床常用的肌酐检测体系是由肌酐酶(creatininase, EC3.5.2.10)、肌酸酶(creatinase, EC3.5.3.3) 和肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase, EC1.5.3.1) 这3种关键酶组成的多级酶联检测体系^[12-14]，其中肌酸酶催化肌酸水解生成肌氨酸和尿素(图 1，*标注)。肌酐在3种酶的催化下转化为过氧化氢(H₂O₂)，然后通过辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)将H₂O₂转化为可检测信号来确定肌酐的浓度。基于酶促反应的检测方法具有准确度更高、特异性更强以及不会交叉污染检测样品中的其他物质等优点^[15]。但是，在目前商业化的肌酐检测试剂盒中使用的肌酸酶的最大活性远低于体系中的其他商品酶，是检测体系中的限速酶^[16]。

已有多种种属来源的肌酸酶先后被发现^[17-23]。目前有关对肌酸酶进行改造的研究主要集中在热稳定性的改造^[24-28]，如本研究团队的白雪等在2020年的相关研究工作中，通过利用一种无偏见的系统发育共识方法对粪产碱杆菌[11] (Alcaligenes faecalis) 来源的肌酸酶(Al-CRE，GenBank登录号：BAA88830.1) 进行改造，构建并筛选得到了11个相较于亲本(I304L/ F395V) 表现出更高的热稳定性的单点突变酶，组合后得到的四点突变酶D17V/T199S/L6P/ T251C在57 ℃时半衰期延长约1 700倍，并且活性没有降低^[24]。但目前针对肌酸酶活性的改造研究相对较少，2005年，Shao等通过随机突变筛选对欧文氏菌属(Erwinia sp.) 来源的肌酸酶进行改造时，发现双点突变(I304L/F395V) 可以降低蛋白质的K_m值，五点突变(F59W/N130D/ M203V/I278T/F395L)能够使蛋白质的K_m值由4.3 mmol/L降低为2.0 mmol/L^[29]。但该项研究中并没有对野生型和突变酶的k_cat值进行探讨，无法有效证明其在实际应用中的潜力和价值。在白雪等的研究中发现，粪产碱杆菌来源的肌酸酶具有较高的k_cat值和较低的K_m值，并且引入双点突变(I304L/F395V) 后可以维持k_cat值基本不变，K_m值进一步降低，说明该酶具有较高的商业化应用潜力，是分子改造的良好对象^[24]。

目前已有很多研究利用半理性蛋白质工程策略对酶分子的活性进行改造^[30-33]。半理性蛋白质工程是一种通过计算机识别蛋白质重要区域的方法，可以根据蛋白质结构和序列提供的信息来预先筛选出有希望的进化位点，产生更小的高质量文库，使得后续的筛选实验不再依赖高通量方法，显著提高酶工程的效率^[34-35]。在基于结构的半理性设计策略中，随着蛋白质结构解析技术、同源建模以及分子动力学模拟技术的发展，给研究者们提供了较为精细的蛋白质结构信息，从而帮助研究者们更有效地定位活性位点、结构域界面、铰链区等区域的重要位点。如Reetz团队提出的组合活性中心饱和突变策略^[36] (combinatorial active-site saturation test, CAST)，其主要方法就是针对酶催化口袋区域的关键氨基酸位点进行单轮或者多轮饱和诱变，构建“小而精”的突变文库，提高筛选效率，从而实现对酶的立体选择性、催化活性和底物选择性等特性的改造^[37]。在基于序列的半理性设计策略中，可以通过多重序列比对和系统发育分析等手段探索同源蛋白质序列间的氨基酸保守性和局部氨基酸可变性，从而识别关键氨基酸位点。如3DM数据库中的3DM-MSA工具可以实现蛋白质超家族的全面比对，预测蛋白质特异性、蛋白质活性和热稳定性的突变热点，将突变文库聚焦于特定位置使后续筛选更加高效^[38]。除此之外，针对蛋白质半理性设计的在线平台HotSpot Wizard已广泛应用于酶的改造中^[39]，该平台内置了BLAST、ConSurf、CAVER、FoldX等一系列生物信息学分析模块，通过同源序列分析、进化速率分析和活性口袋分析等计算数据，对目标蛋白质位点的氨基酸频率、残基替换概率和结构中的位置等信息进行注释，对氨基酸的可变性进行打分，识别出位于活性口袋的高可变性位点，并给出突变建议。

为获取高水解活力的肌酸酶突变株，本研究采用半理性设计策略对产碱杆菌Alcaligenes sp. KS-85来源的肌酸酶Al-CRE进行活性改造。结合同源建模结构分析和HotSpot Wizard辅助设计共挑选出18个突变热点，通过对上述热点进行饱和突变筛选及有序重组得到水解活力提高的突变株，为肌酸酶的进一步机理解析及实际应用提供了基础。

1 材料与方法 1.1 材料和试剂

菌株与质粒：表达质粒pET-28a由本实验室保存，表达宿主大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3) 购自北京索莱宝科技有限公司。

LB培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠10。

酶、试剂与引物：肌酸购自于北京百灵威科技有限公司；2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline, TOOS) 和4-氨基安替比林(4-Aminoantipyrene, 4-AAP) 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；辣根过氧化物酶购自生工生物工程(上海) 股份有限公司BBI品牌；质粒小量提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；PCR clean-up试剂盒购自Axygen公司；PrimerSTAR Max DNA聚合酶购自TaKaRa公司；DpnⅠ限制性内切酶购自Thermo Scientific公司。

1.2 突变热点预测

同源建模结构由本实验室构建，具体方法为：将产碱杆菌来源肌酸酶的氨基酸序列(GenBank登录号：BAA88830.1) 上传至SWISS-MODEL^[40]网站上，搜索与其氨基酸序列匹配的蛋白结构，选择同源性较高的放线菌属(Actinobacillus sp.) 来源的肌酸酶(1KP0)为模板进行SWISS-MODEL同源建模。随后将得到的Al-CRE同源建模的三维结构上传至HotSpot Wizard交互平台中(https://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/)，对突变残基进行预测，同源序列搜索数目限制在200，序列同源性(identity) 限制在30%–90%，Probe radius设置为2.7 Å，Essential residue选择His 233，Calculate Tunnels中Probe radius范围为1.7 Å到3.5 Å，将H₂O分子计算在内，其他条件设置为默认。预测任务完成后，在“FUNCTIONAL HOT SPOTS”模块查看HotSpot Wizard平台的计算结果。除了选取计算得到的“Hotspot”位点作为后续饱和突变实验的突变热点，平台会给出各个位点具体的可变性得分(Mutability score)。为了扩大筛选范围，我们进一步分析了可变性得分在4分以上的氨基酸位点，并结合对该酶同源建模结构的分析，将部分在底物10 Å范围(或位于活性口袋) 内且未参与酶催化和结合的氨基酸位点也合并至突变热点中。

1.3 单点饱和突变库构建

根据HotSpot Wizard平台计算预测的结果以及结构分析的结果，我们最终选择了Glu15、Asp17、Tyr18、Asn54、Cys62、Tyr63、Tyr68、Gln88、His193、Ile197、Asn201、Ile204、Phe213、Val214、Asn234、Pro235、Phe256和Lys351共18个突变热点，设计饱和突变引物，简并密码子为NNK。本研究使用的引物见表 1。

以重组质粒pET-28a-Al-CRE为模板，采用全质粒聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 方法进行定点突变。其中PCR的反应体系(50 μL) 组成为：PrimeSTAR Max Premix溶液(2×) 2.5 μL，质粒模板(50 ng/μL) 1 μL，上下游引物各2 μL，去离子水20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 3.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经纯化、DpnⅠ消化、二次纯化后，电转入E. coli BL21(DE3) 感受态中。将复苏后的电转感受态稀释10倍，涂布于含Kana抗性(100 mg/L) 的LB固体培养基上，每个突变库涂布2块培养板。过夜培养后每个平板挑取5个单克隆送测序，验证突变库的质量。

1.4 肌酸酶的96孔板筛选方法 1.4.1 肌酸酶的96孔板培养方法

挑取平板上的单克隆于96孔深孔板中，每孔500 μL含Kana抗性(100 mg/L) 的LB培养基，于37 ℃过夜振荡培养。挑取单克隆多于N=–32 ln(1-P) 为147个，以达到99%的文库覆盖率。

转接50 μL过夜培养的菌液至含有450 μL自诱导培养基的深孔板中，37 ℃、220 r/min培养3 h，随后调整至20 ℃过夜诱导。

转移200 μL过夜诱导的菌体至标准96孔板中，4 000 r/min离心10 min，倒掉上清；随后每孔加入50 μL的BugBuster细胞裂解液，于微孔板振荡器上500 r/min振荡30 min，加入100 μL磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS) (pH 7.4) 重悬10 min；4 ℃4 000 r/min离心10 min，取上清液用于酶活力检测。

1.4.2 肌酸酶的微孔板酶活力检测方法

190 μL PBS (pH 7.4) 缓冲体系包含TOOS (终浓度为0.5 mmol/L)，4-AAP (终浓度为0.45 mmol/L)，肌酸(终浓度为0.5 mmol/L)，HRP (900 U/L)，肌氨酸氧化酶(8 U/mL)，在该反应体系中加入10 μL粗酶液，放入酶标仪中振荡混匀，37 ℃检测20 min内555 nm波长下吸光度的变化值。

根据吸光度的变化值，选取活力高于对照120%的孔，从中吸取50 μL菌液，接种到450 μL含Kana抗性(100 mg/L) 的LB培养基的深孔板中，37 ℃过夜培养8–12 h，按照上述的方法进行复筛。复筛后将活力提高的菌液接种于试管中，表达纯化蛋白。

1.5 野生型肌酸酶与突变体的表达纯化和酶活力测定 1.5.1 肌酸酶的表达纯化方法

取3 mL新鲜的菌液转接到300 mL (100 mg/L Kana) LB培养基的摇瓶中，37 ℃、220 r/min培养至OD₆₀₀=0.8，加入终浓度为100 mg/L的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d- thiogalactoside, IPTG)，20 ℃诱导14–16 h。发酵结束后，6 000 r/min离心10 min，收集菌体，使用高压均质仪破碎菌体，随后用镍柱纯化蛋白，并通过超滤管和PBS缓冲液除去残留的咪唑。

1.5.2 肌酸酶的酶活力测定

酶活力单位定义：在下述条件下肌酸酶通过酶联反应每分钟释放1 μmoL H₂O₂所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

酶活测定方法：检测体系为含有肌酸0.5 mmol/L；TOOS 0.5 mmol/L；4-AAP 0.45 mmol/L；HRP 900 U/L；肌氨酸氧化酶400 U/L的PBS缓冲液(pH 7.4)，反应体系在37 ℃中孵育。向1 mL的石英比色皿中加入950 μL的反应液，50 μL待测酶液，于37 ℃反应，生成的紫色络合物在波长555 nm有最大吸收值，通过检测混合后30–60 s内体系吸光度的变化，计算酶活。

1.6 酶学性质和动力学的测定 1.6.1 温度对反应的影响

测定纯化后的野生型(Wild type, WT) 及突变酶(1 mg/mL) 在20–55 ℃ (20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃) 下的比活力，活力测定方法同1.5.2所示，分析WT及其突变酶的最适反应温度。

1.6.2 pH对反应的影响

测定纯化后的野生型及突变酶(1 mg/mL)在不同pH值(pH 5.5–10) 下的缓冲液中的比活力，酶活测定方法同1.5.2所示，反应温度统一为30 ℃，分析WT及其突变酶的最适反应pH。其中缓冲液分别为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0、5.5)、PBS缓冲液(pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5、9.0、9.5、10.0)。

1.6.3 金属离子对反应的影响

测定纯化后的WT及突变酶(1 mg/mL) 在添加了不同金属离子(K⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺) 及乙二胺四乙酸四钠盐水合物(ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt hydrate, EDTA) 缓冲液中的比活力，将纯化后的酶用1×PBS缓冲液稀释至1 mg/mL，向待测样品中分别加入1 mmol/L的不同金属离子或1 mmol/L EDTA，孵育10 min，测活方法同1.5.2所示，反应温度统一为30 ℃。同时以不含任何离子的反应体系(control) 作为对照试验，含有不同离子的反应体系分别做3组平行实验。

1.6.4 动力学参数的测定

设置底物肌酸的终浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、80、100 mmol/L的浓度梯度，酶活测定方法同1.5.2所示，在37 ℃ PBS缓冲液(pH 7.4) 中测定酶的反应速率，使用米氏方程(Michaelis-Menten equation) 进行非线性回归分析，计算突变体的K_m及k_cat。

2 结果与分析 2.1 肌酸酶突变热点的选取

在HotSpot Wizard平台中，将肌酸酶野生型序列与200条同源序列进行多序列比对，根据氨基酸频率和突变的影响来计算各个位点的可变性得分，其中高可变性位点的得分在6–9分，中可变性位点的得分在4–5分(表 2)。高可变性位点的氨基酸频率相对较低，并且有可能容忍多种类型的突变，体现非保守性，因此以此作为突变热点很大概率可以得到高催化活性的阳性突变体。

此外，由于位于活性位点附近的残基是对于酶的催化活性、对映选择性和底物特异性等功能具有重要影响的关键残基，所以通过限制必需氨基酸为His233和探针半径为2.7 Å来预测参与构建肌酸酶活性口袋的氨基酸位点。结合可变性得分和位置信息这两种评价指标，最终获得了11个高可变性且位于活性口袋的“热点”残基(hotspot)。同时为了扩大筛选范围，对可变性得分在4分以上的氨基酸位点进一步分析，结合实验室早期以同源建模、分子对接、丙氨酸扫描等技术对该酶活性中心关键氨基酸的分析结果^[41]，将在底物10 Å范围内(或位于活性口袋) 且未参与酶催化和结合的氨基酸位点也合并至突变热点中。受限于突变文库的大小，我们最终只选择了符合上述条件的Cys62、Tyr63、Tyr68、Gln88、Asn234、Pro235、Lys351共7个氨基酸位点。

最终选择了Glu15、Asp17、Tyr18、Asn54、Cys62、Tyr63、Tyr68、Gln88、His193、Ile197、Asn201、Ile204、Phe213、Val214、Asn234、Pro235、Phe256、Lys351共18个突变热点。其相关参数及在蛋白质结构中的具体位置信息如表 2和图 2中所示。

2.2 单点饱和突变的筛选及组合结果

利用96孔深孔板的筛选体系对18个Hotspot位点的饱和突变库进行筛选，对每孔的酶活数据进行统计及阳性突变体复筛，部分纯化蛋白的SDS-PAGE结果见图 3，蛋白分子量在46 kDa左右，与预测蛋白分子量大小基本一致，目标条带单一，蛋白纯度达到90%以上，可以用于后续测定实验。阳性突变集中在Asp17、Asp18、Tyr63、Gln88、His193、Phe213和Lys351，其余位点均未得到阳性突变。经酶的纯化表征，得到10个水解活力提高的突变体D17P、D17T、D18T、Y63S、Q88A、H193S、F213Q、K351R、K351T、K351V活性分别为野生型的1.41倍、1.1倍、1.19倍、1.35倍、1.20倍、1.13倍、1.18倍、1.32倍、1.37倍、1.64倍(图 4)；其中Lys351位点含有3种阳性突变体，Asp17含有2种阳性突变，并且活力提升最高两个突变体分别为K351V和D17P，说明Lys351和Asp17这2个位点可能对酶水解活性有极为重要的作用。

根据文献报道，I304L及F395V的组合突变可以降低肌酸酶的K_m值，提高其催化活力^[29]，我们将筛选得到的阳性单点突变与上述的双点进行组合突变，从结构分析来看，突变位点之间距离较远，在空间结构上不存在协同效应，因此直接将阳性突变与该位点进行了组合(表 3)。

最终得到五点突变酶为I304L/F395V/ K351V/Y63S/Q88A，其比活力为15.11 U/mg，比野生型肌酸酶Al-CRE (7.00 U/mg) 提高2.18倍，比已知的双点突变I304L/F395V (9.92 U/mg) 提高1.55倍。

2.3 野生型及重要突变体的酶学性质表征

我们对于野生型酶及重要突变体I304L/ F395V、四点突变酶I304L/F395V/K351V/Y63S和五点突变酶I304L/F395V/K351V/Y63S/Q88A的酶学性质进行了系统表征(图 5)。如图 5A所示，WT与突变酶的最适反应pH均为8.0，pH值在5.5–8.0范围内时，WT与突变酶比活力随着反应pH的增高而上升；当缓冲液pH值在8.0–10.0范围内，比活力随着反应pH的增高而下降。当pH值在7.5–8.0范围内时，WT与突变酶比活力波动不大，均维持在80%以上。在此范围之外，酶活力受pH影响较大。

反应温度对WT与突变酶影响如图 5B所示。除了突变酶I304L/F395V的最适温度为37 ℃外，WT和其余两个突变酶的最适反应温度为30 ℃。

金属离子对WT与突变酶影响如图 5C所示，在不同的金属离子的影响下肌酸酶活力受到不同程度的影响，但同种金属离子对WT与突变酶的影响基本一致。与不加金属离子的反应体系进行对比，Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Fe³⁺不同程度上抑制了肌酸酶的活性，其中Cu²⁺的存在会导致酶活性完全被抑制，这与之前的研究结果相符^[42]。在金属离子与待测蛋白的孵育中，未见有蛋白质沉淀现象，排除金属离子导致蛋白质变性从而表现为活性抑制的可能性。而在EDTA、K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺存在的反应体系中，WT与突变酶活性并无明显变化。

2.4 野生型及重要突变体的动力学表征

将纯化后的WT，两点突变酶I304L/F395V和五点突变酶I304L/F395V/K351V/Y63S/Q88A进行酶反应动力学参数分析(表 4)，与WT相比，双点突变酶I304L/F395V的K_m值由野生型的2.12 mmol/L降低1.75 mmol/L，k_cat并无明显变化，说明这两个远端氨基酸的突变主要起到的作用是使酶与底物的亲和力提高，从而提高酶活性；而五点突变体相比双点突变的K_m由1.76 mmol/L提高为2.75 mmol/L，酶对底物亲和力略有降低，k_cat由388.96 min^–1增大为712.99 min^–1，酶对底物的转化效率大幅度提高。

2.5 突变体的结构分析

五点突变体I304L/F395V/K351V/Y63S/Q88A中，3个突变位点Ile304、Phe395和Lys351均位于肌酸酶表面(图 6)，距离活性中心距离较远。研究表明，许多导致高活性的突变都分散在远离活性位点的地方^[43]。这是因为远离酶活性位点的残基可以通过远程相互作用(long-range indirect interactions) 直接或间接影响酶的底物结合或其他构象状态，从而影响催化功能^[44]。如在辛伐他汀合酶(simvastatin synthase) LovD的改造中，先后9轮进化中共引入了29个突变，其中大多数突变位点都远离活性位点，但最终突变体LovD9的K_m值由0.56 mmol/L降低为0.28 mmol/L，比活力提升1 000倍。同时作者通过晶体结构和分子动力学模拟分析，证明了远程突变可以通过影响构象变化来调节活性位点的催化活性^[43]。因此，I304L/F395V/K351V这3个突变位点可能是通过上述方式来提高肌酸酶的催化活性。其余2个突变位点Tyr63、Gln88均位于同源二聚体界面的交界处(图 7)，这2个位点的突变均引入了更短的侧链，其中Tyr 63位于底物进出的隧道，Y63S进一步拓宽了隧道，有利于底物的进入和产物的释放。Gln88位于同源二聚体界面的α3螺旋(图 2)，突变可能使该螺旋的柔性变大，有利于二聚体中单体的构象变化，使位于二聚体界面的活性中心柔性更强。但同源建模结构的精准度可能不足，以更准确的晶体结构以及基于晶体结构的分子动力学模拟来对肌酸酶构象动力学做进一步分析，可以更有效地分析突变影响肌酸酶活性的具体机制。

3 讨论

本研究通过SWISS-MODEL软件模拟了产碱杆菌(Alcaligenes sp.) KS-85来源肌酸酶Al-CRE的三维结构，通过HotSpot Wizard平台计算分析和蛋白质三维结构分析，共挑选出了18个突变热点。通过对上述热点进行饱和突变筛选及有序重组得到多个水解活力提高的突变株，其中五点突变酶I304L/F395V/K351V/Y63S/ Q88A提升最为明显，与WT相比，其相应的比活力提升2.18倍，催化效率k_cat/K_m提高了1.44倍。k_cat由382.99 min^–1增大为712.99 min^–1，更高活性的肌酸酶可以缩短肌酐检测体系测定的时间，提高临床检测肌酐水平的效率，具有较高的应用潜力。结果证明，以半理性设计策略来改造酶活性是有效的，可以减少整体实验的复杂程度、数量和时间。即使缺少目标酶分子的晶体结构，也可以通过计算手段进行辅助^[39]，比如同源建模方法^[40]和人工智能预测方法^[45-46]。为了对酶分子进行更加深入地研究，精准的三维结构是必需的。后续还需要对野生型及重要突变体的晶体结构进行解析，对肌酸酶分子水解活性的机理进行更加深入地解析，同时对突变所带来的影响进行更加具体地分析，从而将半理性设计策略更有效地应用到对肌酸酶或者其他重要酶的功能改造之中。