短肽包含生命分子的基本信息，由于其独特的特性和巨大的应用前景，在生物学、医学、化学等领域引起了广泛的关注。短肽具有结构多样和构象灵活的特点，易于调控与受体结合的相互作用，同时显示出靶标结合的高选择性^[1]。超短肽(ultrashort peptide) 被精确地定义为肽链长度不超过7个氨基酸的肽^[2-5]。与更长的肽链相比，超短肽具有非常突出的特性，其合成更为经济且具有更好的可调节性、结构稳定性、组织渗透性、生物相容性及细胞相容性以及更低的免疫原性^[6-7]。化妆品中重要的功能性成分之一就是超短肽。许多超短肽在细胞外基质合成、色素沉着、先天免疫及炎症等发挥作用，具有刺激胶原蛋白生成、促进伤口愈合、抗皱以及抗氧化等效果^[8]。三肽GHK (glycyl-l-histidyl-l-lysine) 具有刺激胶原蛋白产生的特性，四肽GQPR (glycyl-l-glutamyl-l- prolyl-l-arginine) 具有抗炎以减缓胶原蛋白降解的特性^[9-10]。超短肽进行棕榈酰基修饰后更利于皮肤吸收，棕榈酰三肽-1 (Pal-GHK) 和棕榈酰四肽-7 (Pal-GQPR) 的混合物在局部应用于皮肤时具有抗皱的特性，被广泛应用于化妆品中^[11-12]。目前，短肽主要通过固相合成法(solid phase peptide synthesis, SPPS) 制备，SPPS中肽的纯化是通过简单洗涤附着在聚合物上的肽来实现的，这使得合成过程自动化。由于短肽的分子量较小，一般无法直接进行重组表达，超短肽更是如此。

滚环扩增(rolling circle amplification, RCA) 是一种等温酶促反应，它以1个非常小的环状DNA作为模板，用特定的DNA或RNA聚合酶扩增短DNA或RNA引物以形成长链DNA或RNA，其产物是包含数十个到数百个与环状模板互补的串联重复序列的多联体。RCA技术的强大和多功能性使其成为生物医学研究和纳米生物技术的有吸引力的工具^[13-16]。RCA反应时加入非典型核苷酸，这些非典型核苷酸会在反应时随机掺入在产物中且不能被特定的限制性内切酶消化，故消化后的产物可按照DNA片段大小分离获得，此方法可制备特定长度范围的串联重复DNA片段混合物^[17]。为了开发一种筛选超短肽基因串联重复数的方法，同时开发一种制备超短肽GHK和GQPR混合物的方法，本研究以GHK和GQPR的串联重复基因为模板，利用RCA来生成不同长度的串联重复基因片段，随后克隆至以硫氧还蛋白作为融合蛋白的载体骨架pET28a-Trxm，转化获得大肠杆菌工程菌。通过对比蛋白表达水平确定基因串联重复数，同时建立了一种制备超短肽GHK和GQPR混合物的方法。

大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3) 及pET28a购自Merck公司；pET28a-Trx27为本实验室前期构建和保存；具体信息见表 1。

Luria-Bertani (LB) 培养基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化钠10。

Nt. BbvCⅠ，5-Methylcytosine (5mC)，phi29 DNA Polymerase购自New England Biolabs公司。小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Biotek公司。FastDigest DpnⅠ，FastDigest Acc65 Ⅰ，FastDigest Apa Ⅰ，FastDigest NcoⅠ，FastDigest EcoRⅠ，FastDigest SacⅠ，dNTPs，Phusion High-Fidelity DNA Polymerase购自Thermofisher公司。超滤离心管购自Merck公司。

根据pET28a载体上需要破坏“失活”的酶切位点Apa Ⅰ (1 334)，参考QuikChange定点突变方法^[18-19]，设计引物对g1331a_c1334a (表 2) 并以pET28a为模板进行PCR。PCR反应总体积为50 μL，具体为：10 μmol/L正向引物1.5 μL，10 μmol/L反向引物1.5 μL，模板pET28a 10−30 ng，2×Phusion PCR mix 25 μL，补水至50 μL。PCR程序为：98 ℃预变性10 s；98 ℃ 10 s；72 ℃ 4 min 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。所得PCR产物用DpnⅠ于37 ℃消化1 h后用乙醇沉淀法回收目的质粒DNA^[20]。随后将DNA沉淀重溶于5 μL超纯水，热激法转化E. coli Top10感受态细胞，37 ℃过夜培养得到转化子。挑取若干转化子扩增过夜，离心收集菌体用试剂盒提取质粒后，委托生工生物工程(上海) 股份有限公司测序并获得含目的突变的质粒pET28a(g1331a/c1334a)。

为了实现RCA策略，需要将pET28a上的多克隆位点(multiple cloning site, MCS) 引入Apa Ⅰ (NotⅠ突变为Apa Ⅰ)，同时插入得到新终止密码子TGA。此突变可通过同一引物对c153g_g155c_c160t实现(表 2)，模板为pET28a(g1331a/c1334a)，具体突变方法同1.3.1，获得含目的突变的质粒pET28a(g1331a/c1334a/ c153g/g155c/c160t)。

因短肽串联表达本身分子量较小，故将其5′端构建引入硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx) 作为融合蛋白，并通过肠激酶酶切位点连接至短肽，其结构式为：硫氧还蛋白-酶切位点-(短肽)n，n为≥1的自然数。pET28a-Trx27为本实验室前期构建的用于表达多肽“27”的重组质粒，其融合蛋白为Trx，拟通过双酶切获得DNA片段。因其5′端为无缝克隆，故通过QuickChange方法将5′端引入酶切位点NcoⅠ，便于后续实验。此步突变模板为pET28a-Trx27，引物对TA_ins3nt_62 (表 2)，具体突变方法同1.3.1，获得目的质粒pET28a-Trx27(62ggt)。

分别将质粒pET28a(g1331a/c1334a/c153g/ g155c/c160t)和pET28a-Trx27(62ggt)进行NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切，37 ℃酶切30 min。酶切结束后将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为100 V，40 min。电泳结束后分别切胶回收，并获得线性化载体和目的DNA片段。将载体和目的DNA片段于16 ℃连接30 min，连接产物热激法转化E. coli Top10，37 ℃培养过夜得到转化子。转化子过夜扩增并提取质粒后，将质粒送出测序并比对，保存正确的克隆。

1个TRSP基本单元的基因片段长度为96 bp，委托生工生物工程(上海) 股份有限公司进行基因合成并构建至pUC57。此基因片段包含5个酶切位点(图 1)，以实现串联重复拷贝数的随机化。具体为：其5′端和3′端各具有1个SacⅠ位点，用于片段自身环化。Acc65 Ⅰ和Apa Ⅰ位点为TRSP基本单元的克隆位点，(TRSP)_n通过这两个位点构建至表达载体上。因Acc65 Ⅰ和Apa Ⅰ均为Dcm甲基化敏感，当片段中引入5mC代替胞嘧啶时切割就会被阻断。Acc65 Ⅰ位点紧邻5′端SacⅠ之后，Apa Ⅰ位点之后紧接着3′端SacⅠ。BbvCⅠ位点紧接Acc65 Ⅰ之后，nt. BbvCⅠ酶切此位点可产生“切口”，从而作为Phi29 DNA聚合酶的“引物”位点。紧接BbvCⅠ位点之后(下划线双实线部分) 为编码短肽GHK和GQPR的串联重复短肽基因序列。

图 1 TRSP的基本单元(n=1) Fig. 1 TRSP unit (n=1). Sac Ⅰ was denoted as "__". Acc65 Ⅰ was denoted as " ┄┄". The tandem repeat sequences encoding peptide GHK and GQPR were denoted as "═". Apa Ⅰ was denoted as "┅ ".

图选项

质粒pUC57-TRSP经SacⅠ酶切后，胶回收TRSP片段，然后用DNA连接试剂盒中的试剂Ⅰ进行连接环化，之后65 ℃水浴10 min热灭活酶，然后使用nt.BbvCⅠ将环状DNA切割产生“切口”，之后80 ℃水浴20 min热灭活酶。

随后进行RCA反应，50 μL反应体系具体如下：带有“切口”的环状TRSP片段10 μL，1 mmol/L dATP，1 mmol/L dGTP，1 mmol/L dTTP，0.5 mmol/L dCTP，0.5 mmol/L 5mC，0.25 U/μL phi29 DNA聚合酶，0.1 μg/μL牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)。30 ℃孵育19 h，孵育结束后65 ℃水浴10 min热灭活酶。

RCA反应产物经Acc65 Ⅰ和Apa Ⅰ消化后，因5mC的掺入而产生不同长度的TRSP片段(TRSP)_n，进行1%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒纯化获得长度约500 bp到1 500 bp的TRSP片段混合物。载体pET28a-Trxm经Acc65 Ⅰ和Apa Ⅰ消化后，胶回收线性化载体。将回收获得的不同长度的(TRSP)_n片段与线性化载体pET28a-Trxm用Solution Ⅰ于16 ℃连接30 min，随后热激法转化感受态细胞E. coli BL21(DE3)，获得含不同长度插入片段的单克隆E. coli BL21(DE3)/pET28a-Trxm-(TRSP)_n。

随机挑取若干E. coli单克隆并分别接种于含硫酸卡那霉素的2 mL LB培养基，37 ℃、700 r/min扩增过夜。培养液12 000 r/min离心3 min收集菌体，然后用质粒提取试剂盒提取质粒后，取少量质粒用NcoⅠ、Apa Ⅰ于37 ℃酶切20 min，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳验证。将验证正确的质粒送出测序。

将序列正确的单克隆接种于2 mL含硫酸卡那霉素的LB培养基，37 ℃、700 r/min振荡培养过夜。将培养过夜的新鲜种子以1% (V/V)接种量接种于2 mL的LB培养基，37 ℃、700 r/min振荡培养至OD₆₀₀约为0.6，再加入IPTG至0.4 mmol/L，于37 ℃、700 r/min诱导6 h。诱导结束后将培养液离心(12 000 r/min) 3 min收集菌体，用去离子水洗涤一遍，再加入一定体积的5×上样缓冲液混匀，100 ℃煮沸5 min制备样品。所得样品进行SDS-PAGE分析。

将工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-Trxm- (TRSP)₁接种于500 mL LB培养基并诱导表达，具体方法同1.7。培养结束后离心收集菌体，并将其重悬于50 mL的提取缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，pH 8.0) 并进行超声破碎，超声条件为：功率200 W，工作3 s，间隔7 s，重复60次。超声后悬液离心(14 000 r/min) 10 min收集上清。超声上清液用分子量30 kDa的超滤离心管进行超滤浓缩后，超滤内液中加入20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0) 离心洗涤3遍，得到15 mL含重组融合蛋白Trxm-(TRSP)₁的上清液。在此上清液中加入16 U肠激酶，于37 ℃水浴4 h进行酶切反应，酶切结束后反应液用分子量5 kDa的超滤离心管进行超滤，并用相同的Tris-HCl缓冲液洗涤后，超滤内液加入32 U的胰蛋白酶，于25 ℃条件下酶切3 h后将反应液离心，取上清进行HPLC分析。

为了实现不同拷贝数的短肽GHK和GQPR基因串联重复策略，需要在目的基因(TRSP)_n片段两端引入对于Dcm甲基化敏感的酶切位点Acc65 Ⅰ和Apa Ⅰ，通过这两个位点构建至表达载体，当基因片段中引入5mC代替胞嘧啶时切割就会被阻断。本研究以pET28a为出发质粒，通过定点突变将Apa Ⅰ (1 334) 破坏掉，随后在多克隆位点(multiple cloning site, MCS)引入Apa Ⅰ，获得了突变后的pET28a(g1331a/ c1334a/c153g/g155c/c160t)。不同拷贝数的短肽GHK和GQPR基因在E. coli中串联表达时仍然存在分子量较小而不稳定的问题，故本研究采取与硫氧还蛋白融合表达的方式进行表达。以pET28a-Trx27为出发质粒，先在Trx27的5′引入NcoⅠ位点，获得pET28a-Trx27(62ggt)。pET28a(g1331a/c1334a/c153g/g155c/c160t)和pET28a-Trx27(62ggt) 分别用NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切，胶回收获得线性化载体和Trxm片段，随后连接并转化感受态细胞，获得序列正确的载体骨架pET28a-Trxm。构建过程示意图见图 2。

图 2 载体骨架pET28a-Trxm构建示意图 Fig. 2 Illustration of pET28a-Trxm construction.

图选项

图 3阐释了串联重复片段的构建流程。具体为：(1) pUC57-TRSP经SacⅠ酶切得到线性的TRSP片段；(2) 线性TRSP片段再经Solution Ⅰ连接得到环状TRSP分子；(3) 环状TRSP经nt.BbvCⅠ切割产生“切口”；(4) 带“切口”的TRSP作为模板，使用5mC代替1/2的dCTP进行滚环扩增，扩增时5mC随机掺入至序列；(5) 滚环扩增反应产物经Acc65 Ⅰ和Apa Ⅰ双酶切产生不同长度的(TRSP)_n片段混合物；(6) (TRSP)_n片段混合物与线性pET28a-Trxm连接得到重组表达载体pET28a-Trxm-(TRSP)_n。经热激转化获得含不同长度插入片段的单克隆E. coli BL21(DE3)/pET28a-Trxm-(TRSP)_n。

图 3 pET28a-Tram-(TRSP)n的构建流程 Fig. 3 Procedures of constructing pET28a-Tram-(TRSP)n. The tandem repeat sequences encoding peptide GHK and GQPR were denoted as the yellow box. Cloning regions were denoted as the grey box. Locations where dCTP and 5mC were involved weredenoted as red and green triangle, respectively. Linear RCA product was denoted as the blue arrow.

图选项

RCA产物经Acc65 Ⅰ和Apa Ⅰ消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示无清晰条带出现且整个泳道呈弥散状态(图 4)，可能是由于RCA反应时5mC掺入序列的随机性而导致条带分子量的随机性。切胶回收分子量约500 bp到1 500 bp的DNA片段并克隆至表达载体，相应的蛋白质分子量约为18 kDa到55 kDa。

图 4 RCA产物经Acc65 Ⅰ和Apa Ⅰ双酶切后电泳图 Fig. 4 Double digestion of RCA product by Acc65 Ⅰ and Apa Ⅰ.

图选项

将随机挑取的若干E. coli单克隆扩增并提取质粒后，质粒经NcoⅠ、Apa Ⅰ双酶切结果如图 5所示。所有泳道均出现目的条带Trxm- (TRSP)_n，证明其成功构建至表达载体。此片段分子量大部分位于750 bp以下，其中泳道21所对应的Trxm-(TRSP)_n片段分子量约为3 500 bp。此外，经双酶切后，部分质粒出现了2个除线性化质粒外的小分子量条带，这是由于TRSP基本单元本身包含1个ApaⅠ酶切位点GGGCCC，当滚环扩增过程产生n个(n > 1)串联重复时，此序列就相应地包含n个ApaⅠ位点。测序结果显示6#、7#编码区长度为873 bp，12#长度为1 053 bp，这也与双酶切结果相符。但是，也有部分单克隆在融合蛋白Trxm的基因序列正确的情况下，在滚环扩增反应时出现错误，导致串联重复短肽(TRSP)_n部分的序列与预期有较大差异。在TRSP基本单元(n=1) 中(图 1)，已经包含GHKGQPR基因序列的3个串联重复，故在滚环扩增过程时，每增加1个TRSP的拷贝数，相当于增加了3个GHKGQPR的串联重复。而串联重复基因序列在细胞中复制和维持时本身就具有不稳定性^[4]，这可能也是滚环扩增时出错的原因之一。

图 5 质粒pET28a-Trxm-(TRSP)n双酶切验证 Fig. 5 Double digestion of pET28a-Trxm-(TRSP)n. Lane 1–22: single clones; lane 24: marker DL5000; TRSP units generated by Apa Ⅰ digestion were denoted as the arrow, which suggests n > 1 of the tandem repeat number.

图选项

将单克隆的测序结果进行分析，结果显示，通过滚环扩增反应时随机掺入5mC成功实现了短肽基因序列的串联重复，获得了不同串联重复数的重组融合蛋白编码基因，n=1、2、3、4、6、7、8、9。随着串联重复数n的增加，Trxm-(TRSP)_n基因序列长度从423 bp逐渐增加至1 143 bp，相应的氨基酸个数从141增加至381，理论蛋白分子量从15.94 kDa增加至41.27 kDa (表 3)。每增加1个拷贝数(n=1)，基因序列就增加90 bp，相应的氨基酸个数增加30个。

将含不同串联重复数的单克隆E. coli BL21(DE3)/pET28a-Trxm-(TRSP)_n分别培养并诱导表达，诱导结束菌体总蛋白经SDS-PAGE分析结果如下图所示。当(TRSP)_n串联重复数n=1、n=2时，分别在分子量16 kDa和19 kDa处有高表达条带，与预期相符合(图 6A，红色箭头)。Trxm-(TRSP)₁表达水平约为E. coli总蛋白的40%−60%，Trxm-(TRSP)₂表达水平约为总蛋白30%−40%。当(TRSP)_n串联重复数n=3、n=4时，在预测分子量22 kDa和25 kDa处有目的条带表达，除此之外，n=3时在19 kDa到22 kDa之间另有两条非预期分子量的过表达条带(图 6A和图6B，黑色箭头)，n=4时在19 kDa到22 kDa之间另有1条过表达条带(图 6B，黑色箭头)；当n=6、n=7时，在预测分子量32 kDa和35 kDa处并无目的蛋白表达，当n=8、n=9时，分别在预期分子量38 kDa和41 kDa处有较低水平的蛋白过表达，推测可能为目的蛋白表达(图 6C，红色箭头)。n=6、n=7、n=8、n=9时均有杂蛋白条带出现(图 6C，黑色箭头)。

图 6 E. coli菌体总蛋白SDS-PAGE分析 Fig. 6 SDS-PAGE analysis of total protein from E. coli cells. (A) Lane 1–4: Trxm-(TRSP), n=1; lane 5–8: Trxm-(TRSP)2, n=2; lane 9: Trxm-(TRSP)3, n=3; lane M: marker 26619. (B) Lane 1: Trxm-(TRSP)3, n=3; lane 2–6: Trxm-(TRSP)4, n=4; lane M: marker 26619. (C) Lane 1–2: Trxm-(TRSP)6, n=6; lane 3: Trxm-(TRSP)7, n=7; lane 4–5: Trxm-(TRSP)8, n=8; lane 6: Trxm-(TRSP)9, n=9; lane 7: E. coli BL21(DE3)/pET28a (negative control); lane M1: marker 26619; lane M2: marker 26616. Target bands were indicated as the red arrows. Unexpected overexpression bands were indicated as the black arrows.

图选项

在表达Trxm-(TRSP)_n时，当串联重复数n > 2时，均会产生非预期蛋白的过表达，且均有1条相同分子量的蛋白条带出现。这可能是在表达串联重复数较高的基因序列时，大肠杆菌的一种自我应对机制，也可能是由于融合蛋白Trxm-(TRSP)_n的胞内降解。从上述结果可看出，当n=1和n=2时，目的蛋白Trxm-(TRSP)₁和Trxm-(TRSP)₂表达水平较高，而随着基因串联重复数的增加，Trxm-(TRSP)_n的表达水平逐渐降低。n=6和n=7时未见目的蛋白表达，同时在n=8和n=9时分别在预期分子量处有较低水平的蛋白过表达。考虑到融合蛋白表达水平以及其他杂质蛋白的影响，故选取n=1进行后续实验。

将诱导表达后的工程菌(n=1) 菌体经过超声破碎、超滤浓缩、顶洗等步骤获得含重组融合蛋白Trxm-(TRSP)₁的上清液。将此上清液经肠激酶酶切4 h后进行SDS-PAGE分析。图 7中泳道2可看出，酶反应0 h时，反应液中主要条带为融合蛋白Trxm-(TRSP)₁ (16 kDa)。泳道1为酶切4 h的反应液，可看出在酶切4 h后，反应液中已无融合蛋白Trxm-(TRSP)₁条带，而相应地出现了一个分子量为12 kDa的新条带，与Trxm理论分子量一致，从而推测Trxm- (TRSP)₁被完全切割为硫氧还蛋白Trxm和短肽片段(TRSP)₁。此外，并未观察到(TRSP)₁的相应条带(理论分子量为3 kDa)，这可能是因为小于5 kDa的蛋白条带在SDS-PAGE时极易弥散。肠激酶酶切结束后，反应液再经超滤浓缩等步骤获得含(TRSP)₁的清液。随后将此清液进行胰蛋白酶切割反应，同时对反应液进行HPLC分析。通过与市售GHK及GQPR对照品的HPLC图谱相对比，显示经酶切后的反应液中出现了新峰，且与对照品的保留时间一致(图 8)。此结果表明，反应液中初步生成了目的短肽GHK和GQPR。

图 7 重组Trxm-(TRSP)1经肠激酶酶切SDS-PAGE结果 Fig. 7 Recombinant Trxm-(TRSP)1 cleavage by enterokinase. Lane M: marker 26628; lane 1: reaction mixture after 4 hours of cleavage; lane 2: reaction mixture at the beginning. Target bands were indicated as the arrows.

图选项

图 8 (TRSP) 1酶切反应HPLC分析 Fig. 8 HPLC analysis of (TRSP)1 enzymatic cleavage. Reaction mixture at 0 h (A) and 3 h (B).

图选项

随着社会发展，人们对于健康的要求越来越高，包括拥有健康且年轻的皮肤。近年来化妆品市场的快速增长清楚地印证了这点，含活性成分的化妆品愈发具有开发前景，而应用最为广泛的活性成分之一就是超短肽^[21]。超短肽GHK和GQPR均为信号肽，GHK能够增强胶原蛋白的产生且具有较强的促伤口愈合和组织修复作用，GQPR具有抗炎以减缓胶原蛋白降解的作用。法国Sederma公司开发出Pal-GHK和Pal-GQPR的混合物作为抗衰老明星成分Matrixyl ™ 3000，可刺激胶原蛋白产生的同时不会引起皮肤刺激性^[22-23]。本研究通过RCA法实现了GHK和GQPR基因串联重复数的确定。我们通过在RCA过程中随机掺入非典型核苷酸，从而获得不同长度的串联重复基因，并与硫氧还蛋白融合表达，通过对比蛋白表达水平确定基因的串联重复数，从而获得高表达水平的工程菌。当重复数n=1和n=2时，(TRSP)₁和(TRSP)₂的表达水平分别达到菌体总蛋白的50%和30%。随着基因串联重复数的增加，重组融合蛋白的表达水平逐渐降低，且会产生杂质蛋白的过表达。有报道通过RCA法构建并生产特定分子量范围的蛋白，用以研究蛋白序列-结构-功能间的关系^[17]，而目前尚未见其他报道用此方法来进行超短肽基因串联重复数的筛选。总之，应用本方法可实现超短肽串联表达时基因重复数的筛选。

短肽通常是用固相合成法来制备，但此方法的缺点是制备过程中大量使用有机化学试剂而带来一定的环境负担。因序列较短，故一般无法直接用重组策略来生产短肽^{[1, 21]}。本研究实现了重组法制备超短肽GHK和GQPR。工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-Trxm-(TRSP)₁经培养获得菌体，菌体经超声破碎获得重组融合蛋白Trxm-(TRSP)₁粗提液，再经超滤浓缩等步骤获得含重组融合蛋白的上清液。此上清液先后经肠激酶和胰蛋白酶酶切后，获得超短肽GHK和GQPR混合物。此混合物可作为活性成分直接添加于化妆品中，也可经过后续的纯化步骤分别得到GHK和GQPR。我们进一步探讨了工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-Trxm-(TRSP)₁ 30 L发酵罐的放大实验，通过发酵、提取、酶切及分离纯化等步骤，最后分别获得3.6 g纯化的GHK和4.9 g纯化的GQPR。目前尚未发现有其他研究用重组策略制备GHK和GQPR混合物。本研究成功建立了重组策略制备超短肽的方法，与固相合成法相比大大减少了化学试剂使用，更为环境友好，且初步具备工业化特征。然而，本研究仅是初步探讨了超短肽的串联表达及分离纯化方法，后续可通过研究E. coli高密度发酵、破胞提取方式、膜过滤及离子交换色谱等深入探讨大规模制备GHK和GQPR的方法。此外，也可尝试将此方法应用于其他生物技术领域的超短肽，探索其重组制备策略。