2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 黄婷婷, 张玉华, 段绪果
- HUANG Tingting, ZHANG Yuhua, DUAN Xuguo
- 普鲁兰酶的异源表达、结构解析及分子改造研究进展
- Advances in heterologous expression, structural elucidation and molecular modification of pullulanase
- 生物工程学报, 2022, 38(12): 4432-4448
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(12): 4432-4448
- 10.13345/j.cjb.220533
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文章历史
- Received: July 8, 2022
- Accepted: September 5, 2022
- Published: September 8, 2022
引用本文
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淀粉是食物中最主要的营养成分之一，也是淀粉深加工工业的原料来源，在国民经济中占有重要的地位。淀粉分子由成百上千的葡萄糖单元通过α-1, 4-葡萄糖苷键和α-1, 6-葡萄糖苷键连接而成。其中，α-1, 6-葡萄糖苷键尽管只占总糖苷键的6%左右，却使淀粉分子形成非常复杂的分支链状结构，阻碍了常用淀粉加工酶(如α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶、葡萄糖基转移酶等) 对底物的转化，导致原料利用率低和反应周期长等问题。因此，淀粉加工过程通常需要复配添加普鲁兰酶对α-1, 6-葡萄糖苷键进行水解。
普鲁兰酶是一种淀粉脱支酶，根据其底物特异性将其分为Ⅰ型普鲁兰酶(EC 3.2.1.41) 与Ⅱ型普鲁兰酶(EC 3.2.1.1/41)。Ⅰ型普鲁兰酶水解α-1, 6-葡萄糖苷键，Ⅱ型普鲁兰酶水解α-1, 4与α-1, 6-葡萄糖苷键。Ⅰ型普鲁兰酶属于糖苷水解酶GH13家族，只能水解淀粉及糊精分子中的α-1, 4-葡萄糖苷键。Ⅱ型普鲁兰酶又称淀粉普鲁兰酶，被两个糖苷水解酶家族涵盖，即GH57家族和GH13家族。Ⅱ型普鲁兰酶既可以水解α-1, 6-葡萄糖苷键，又可以水解线性和分支结构的α-1, 4-葡萄糖苷键。
迄今为止，普鲁兰酶已在多种微生物中发现并鉴定，但大多数已报道野生型普鲁兰酶仍然存在稳定性差、发酵酶活低与应用性能不佳等不足。针对上述问题，近年来普鲁兰酶的研究主要集中于新编码基因的克隆表达、表达系统优化以及酶分子改造等。除新产酶菌株的筛选及编码基因的克隆表达以外，基于生物信息数据库来源的普鲁兰酶编码基因的挖掘逐渐成为主要研究趋势。表达系统的优化主要包括宿主菌株的改造、表达元件的筛选与优化以及发酵条件优化等。普鲁兰酶的分子改造方面，半理性改造仍然是当前研究的主流，但是随着蛋白结构设计方法的快速更迭，酶的人工设计将成为普鲁兰酶性能改善的有力手段。
本文系统地介绍了普鲁兰酶的基因来源、异源表达、表达系统优化以及酶分子改造等方面的研究进展。同时分析了当前研究中存在的问题，并对未来的研究进行了展望，以期为普鲁兰酶的研究及应用提供参考和启示。
1 普鲁兰酶的来源 1.1 产普鲁兰酶的野生菌株筛选国内外关于普鲁兰酶的研究已有60多年的历史。植物与微生物均可产生普鲁兰酶，其中植物来源普鲁兰酶又叫作R酶或者极限糊精酶。由于微生物普鲁兰酶具有独特的优势，是普鲁兰酶研究的重点。1961年，Bender和Wallenfels通过培养产气杆菌(Aerobacter aerogenes) 首次获得了微生物普鲁兰酶[1]。1980年丹麦的Novo Nordisk公司获得一株嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)，该来源的普鲁兰酶是目前应用最广、产量最大的普鲁兰酶，它的最适温度和最适pH分别为60.0 ℃和5.0[2]。
近年来，学者们从不同的微生物中发现了具有不同生化特征的普鲁兰酶(表 1)。主要产酶菌株有厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.) LM18-11 [5]、B. acidopullulyticus[7]、脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)[9]、长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis) JNB-1[12]等。大多数Ⅰ型普鲁兰酶的最适温度在40.0−70.0 ℃，属于中温酶(表 1)。如从厌氧菌戈特沙尔克厌氧分支杆菌(Anaerobranca gottschalkii)[4]鉴定出的普鲁兰酶的分子量为96.0 kDa，在pH 8.0和70.0 ℃时水解活性最佳，最适条件下半衰期为22.0 h。从臭豆腐盐水中分离鉴定出蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus Nws-bc5)[8]，其产生的普鲁兰酶的分子量为81.4 kDa，最适pH和最适温度分别为6.0和40.0 ℃，并且在碱性条件下显示出更高的稳定性，Ca2+可显著提高其活性。芽孢杆菌(Bacillus flavocaldarius)[10]普鲁兰酶分子量为95.0 kDa，在pH 5.0和80.0 ℃下显示最佳活性，比活性为25.9 U/mg，表现出良好的pH稳定性和热稳定性。此外，具有高催化活性和稳定性的嗜冷型普鲁兰酶因其在生淀粉低温水解中的广泛应用而受到特别关注。Rajaei等[15]从微小杆菌(Exiguobacterium sp.) SH3中鉴定的Ⅰ型普鲁兰酶，其最适温度与最适pH值分别为45.0 ℃和8.5，在pH 4.0−11.0范围内具有极强的耐受性。该酶能够水解支链淀粉、可溶性淀粉、马铃薯淀粉和米粉，且在两种商用洗涤剂Rika (7.5%, V/V) 和Fadisheh (2.5%, W/V) 中保存10 d后，该酶仍能保持54.5%和85.0%的活性。Ⅱ型普鲁兰酶主要来自嗜热微生物，该类型酶的分子量大多在100.0 kDa以上，最适温度为55.0−100.0 ℃。产Ⅱ型普鲁兰酶的微生物有细菌(如嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus) GV6[17]、噬热地芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans) NP33[19]) 和古细菌(如沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)[18]、火球菌(Pyrococcus yayanosii) CH1[20])。表 1中的多数Ⅱ型普鲁兰酶的最适温度在90.0−100.0 ℃之间，例如来源于P. yayanosii CH1[14]的PulPY，最适温度在95.0 ℃，可以在淀粉液化过程中与α-淀粉酶结合使用，以提高淀粉底物的水解效率。
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由于Ⅰ型Ⅱ型普鲁兰酶在水解糖苷键特异性方面的差异，当面对相同的底物，产生的产物可能相同也可能不同。其水解反应首先酸碱催化促使某些基团解离，酶分子通过盐键或共价键稳定酶—底物的过渡态中间物，然后酶分子的异头物活性中心攻击水分子从而断裂过渡态中间物，形成具有保留立体结构的半缩醛产物。如图 1所示，当Ⅰ型Ⅱ型普鲁兰酶同时水解普鲁兰多糖时，由于普鲁兰多糖是一个由α-1, 6-糖苷键连接的麦芽三糖，产生的产物是相同的。当底物为支链淀粉时，Ⅰ型普鲁兰酶通常释放聚合度在2以上的葡萄糖寡糖作为最终产物，而Ⅱ普鲁兰酶则可以观察到葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的生成。
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| 图 1 Ⅰ型普鲁兰酶与Ⅱ型普鲁兰酶对普鲁兰多糖与支链淀粉作用特征示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the effects of type Ⅰ and Ⅱ pullulanases on pullulan polysaccharides and amylopectin. Ⅰ型普鲁兰酶和Ⅱ型普鲁兰酶作用位点分别用红色与蓝色箭头表示 The targets of type Ⅰ and type Ⅱ pullulanases are indicated by red and blue arrows, respectively. |
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如上所述，普鲁兰酶可从筛选的微生物中获得，但该方法周期长且易受环境影响。近年来随着全球微生物模式基因组计划的实施，大量基因组数据被解析并提交基因组数据库，为新型普鲁兰酶的发现提供了新的来源。如Thakur等[24]在CAZy数据库(http://www.cazy.org) 中通过蛋白水平上与同源Ⅰ型普鲁兰酶的相似性，从锡金喜马拉雅山Reshi温泉的宏基因组序列数据中，鉴定出一种新型的Ⅰ型支链淀粉酶(PulM)，该菌在40.0 ℃和pH 6.0−7.0时表现出最佳的活性，在4.0 ℃的低温下仍然保留超过50.0%的酶活性，是一种适冷Ⅰ型普鲁兰酶。
除了CAZy数据库以外，还可以从GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)以及Genomes在线数据库(GOLD) (https://gold.jgi.doe.gov) 等数据库中筛选获得具有不同特性的普鲁兰酶。数据库筛选时，可以根据非冗余序列的数量，设置一定的相似度截止值以缩小搜索范围，提高筛选效率。此外还可以使用蛋白结构预测工具(例如AlfaFold2、RoseTTAFold、Swiss-Model等) 对潜在酶蛋白进行结构模拟以获得酶的三维结构模型。这些结构模型经过能量优化后再与配体分子对接，可以有效地发现具有所需功能特征的新酶，进一步提高筛选的准确度，减少盲目性。
2 普鲁兰酶的重组表达及发酵优化 2.1 普鲁兰酶的重组表达由于野生菌株大多产酶水平偏低，一般不能满足工业生产的要求，酶蛋白的异源重组表达是解决这一问题的有力手段。至今，已有大量普鲁兰酶编码基因被克隆和异源重组表达。如表 2所示，普鲁兰酶常用表达宿主有大肠杆菌[33]、枯草芽孢杆菌[34]和毕赤酵母[29]等。普鲁兰酶的重组表达研究中，可以采取宿主菌株改造、表达元件优化以及发酵条件优化等进一步提高重组普鲁兰酶的产量。
| Source | Host | Vector | Fermentation scale | Production (U/mL) | Reference |
| Bacillu acidpullulyticus | B. subtilis | pCBS | 50 L fermentor | 1 555.0 | [25] |
| Bacillus naganoensis | B. subtilis | pDL | Flask | 102.7 | [26] |
| B. subtilis WS5 | B. subtilis | pHYPULd4 | 3 L fermentor | 5 951.8 | [27] |
| Anoxybacillus sp. WB42 | B. subtilis | pP43 | 5 L fermentor | 269.1 | [28] |
| Bacillus deramificans | Pichia pastoris | pPIC9K | 5 L fermentor | 2 031.0 | [29] |
| B. deramificans | B. subtilis WS9 | pHYPULd4 | 3 L fermentor | 8 037.9 | [30] |
| B. naganoensis JNB-1 | E. coli BL21(DE3) | pET-22b(+)pul | Flask | 580.0 | [31] |
| B. naganoensis ATCC 53909 |
B. subtilis ATCC 6051∆10 |
pBEPUL01 | Flask | 625.5 | [32] |
普鲁兰酶的异源表达宿主包括真核宿主和原核宿主。其中，毕赤酵母表达系统是应用最为广泛的真核表达宿主。该系统具有遗传背景清晰、发酵工艺成熟、产物易分离纯化等优点，已被广泛用于外源蛋白的异源表达。据报道，B. naganoensis (ATCC 53909)普鲁兰酶在毕赤酵母SMD1168中表达，最高酶活为507.0 U/mL[35]。王兵波等[29]根据毕赤酵母甲醇氧化酶基因的密码子使用频率优化了B. deramificans普鲁兰酶编码基因的密码子，在最优条件下重组菌胞外酶活可达2 031.0 U/mL。但是，由于毕赤酵母为真核细胞，存在翻译后修饰以及密码子偏好性等特点，而普鲁兰酶一般来自于细菌，在毕赤酵母中的异源表达的产量和成功率相对较低，目前研究相对较少。
在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统是研究最为成熟的表达系统。大肠杆菌具有操作简单、遗传背景清楚、繁殖快、表达量高、成本低等优点。Duan等[36]将B. deramificans普鲁兰酶在大肠杆菌BL21(DE3) 中重组表达，3 L发酵罐中使用两步流加策略和优化的发酵条件(诱导温度25.0 ℃，补加20.0 mmol/L甜菜碱) 将普鲁兰酶胞内产量提高至963.9 U/mL，是对照菌株的8.3倍。但胞外上清酶活却只有17.4 U/mL，大部分重组蛋白积累在周质间隙。Chen等[37]通过比较不同的大肠杆菌表达系统来提高BaPul13A的可溶性表达水平，以pET22b(+)为表达载体，在5 L发酵罐中逐步降低温度，BaPul13A总酶活性最高，达1 156.3 U/mL。Zou等[34]在3 L发酵罐上通过优化诱导模式和甘氨酸补料策略，普鲁兰酶总活力和胞外活力分别为2 523.5和1 567.9 U/mL，分别比优化前提高了1.2和22.6倍。
研究发现，大肠杆菌中重组表达普鲁兰酶仍然存在几个突出问题，如：易产生包涵体、胞外分泌效率差[38]以及影响重组菌株生长。首先，普鲁兰酶易形成包涵体的可能原因有：普鲁兰酶的过快表达，使得酶无法正确折叠；大肠杆菌细胞质中的氧化还原势低；折叠酶和分子伴侣有限等。其次，普鲁兰酶在大肠杆菌中胞外分泌效率偏低的可能原因有：普鲁兰酶蛋白分子量大且为多聚体，在大肠杆菌中表达时首先定位于周质空间，然后需要跨外膜才能分泌到培养基中，该过程效率低，影响其分泌效率。此外，普鲁兰酶的表达对重组菌株产生“毒性”并影响其生长的可能原因，外源蛋白本身在宿主中会造成代谢负担以及形成包涵体，因此工程菌株启动自然应激反应机制发生退化并处于“VBNC”状态(细胞是一种活的但不可培养的状态)。为了恢复活力与功能，菌株通常会适应并重新调整其基因表达和随后的代谢，从而影响自身的生长与普鲁兰酶的生产。因此更高效、更具成本效益的生物过程与设计改造合适的宿主被探索以应对大肠杆菌的退化[39]。Chen等[40]开发了一种高效的策略来筛选稳定产生胞外蛋白的大肠杆菌，所筛选菌株胞外普鲁兰酶活力、细胞生物量高度相似分别为30.0 U/mL和9.0 g DCW/L。安展飞等[41]采用过表达人工设计的micA反义sRNA anti-micA (bprO、omU)阻断micA对ompA的沉默，进而阻断sigma E介导的细胞自溶信号转导途径，提高了大肠杆菌的存活力和普鲁兰酶表达量，为解决大肠杆菌退化提供了新的思路。
此外，大肠杆菌为革兰氏阴性菌，能够产生内毒素，在食品酶的生产中存在安全风险。因此，迫切需要开发能够安全高效、可溶性表达普鲁兰酶的表达系统。
枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，不产生内毒素；不但遗传背景清晰、基因操作技术成熟，而且具有强大的蛋白分泌能力，非常适合食品酶的异源表达。此外，枯草芽孢杆菌还具有无明显密码子偏好性以及产物易纯化等优势，非常适合工业应用。但是，枯草芽孢杆菌能够本底表达多种蛋白酶，当普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中表达时，容易被上述蛋白酶所水解，导致目的蛋白稳定性偏低。针对这些问题，可以敲除宿主自身蛋白酶编码基因，可以减少重组蛋白的降解，增加其分泌表达量。Liu等[32]将枯草芽孢杆菌(B. subtilis ATCC 6051) 宿主进行改造，删除了8种胞外蛋白酶(aprE, nprE, nprB, epr, mpr, bpr, vpr和wprA)，优化后胞外酶活性达到625.5 U/mL。Zhang等[27]用pHYPULd4表达载体，敲除蛋白酶编码基因ΔnprE、ΔaprE、ΔnprB、Δbpr、Δmpr和Δepr，重组菌在3 L发酵罐中胞外酶活性达到2 449.6 U/mL。此外，修饰宿主菌株的细胞壁、改变细胞壁的通透性也是提高酶蛋白表达量的途径之一。在枯草芽孢杆菌中，其细胞壁由肽聚糖、磷壁酸、共价连接的阴离子聚合物和蛋白质等组成。磷壁酸使枯草芽孢杆菌的细胞壁具有高负电荷密度，从而导致金属阳离子与肽的结合，这些金属离子能够促进分泌蛋白在易位后迅速折叠，从而促进了普鲁兰酶的正确折叠和分泌。Zhang等[30]通过敲除表达宿主B. subtilis WS9的dltB基因，增强细胞壁的负电荷。改造后菌株WS9DPUL的胞外普鲁兰酶活性达到206.0 U/mL，比对照提高了1.5倍；敲除前后重组菌株对应的菌体干重DCW (dry cell weight) 值都在3.5 g/L左右，对生长没有明显影响。
2.2 表达元件优化对普鲁兰酶重组表达的影响除了表达宿主之外，研究发现表达元件对外源基因的表达水平同样具有重要影响。其中，启动子、信号肽、增强子等表达元件的优化，是目前普鲁兰酶重组表达的研究热点[42]。
(1) 不同启动子启动转录的能力不同，对蛋白表达水平有重要影响，是表达元件改造的重点[43]。启动子改造研究包括启动子的筛选和串联启动子以增强蛋白的表达。筛选高效的单启动子是提高普鲁兰酶表达的有效方法。Song等[44]用PP43替代PHpaII来启动普鲁兰酶BnPul在WB800中的表达，酶活由3.9 U/mL提高至8.7 U/mL。Wang等[45]以WB600为表达宿主，使用半定量RT-PCR方法，分别考察3个常用启动子(PP43、Papr和Pamy) 对普鲁兰酶pulB转录水平的影响。结果显示，以Papr为启动子时，普鲁兰酶pulB的转录水平高于Pamy和PP43，说明前者能够更有效地驱动pulB的转录。此外，还可以构建串联启动子来进一步提高普鲁兰酶的表达。Meng等[35]先基于转录组和生物信息学数据在枯草芽孢杆菌中挖掘出10个高活性的单启动子，然后构建了双启动子和三启动子重组菌株，其中含有PsodA+fusA (163.0 U/mL) 和PsodA+fusA+amyE (336.0 U/mL) 的菌株活性最高，分别是含有单启动子PamyE菌株酶活力的2.3倍和4.7倍。Liu等[41]以枯草芽孢杆菌ATCC 6051∆10突变体为宿主，构建了11个具有单启动子的质粒和16个双启动子质粒，结果显示含有双启动子PamyL-PspovG质粒的普鲁兰酶表达量最高，胞外酶活达到625.5 U/mL。
(2) 信号肽能够引导胞外蛋白的跨膜运输，对普鲁兰酶的分泌表达也有重要影响。Wang等[46]发现大肠杆菌细胞中有效分泌的蛋白质通常在N端有酸性氨基酸残基，于是在PelB信号肽的N端融合重复的7个Asp标签来改善普鲁兰酶蛋白质的分泌，胞外酶活从18.0 U/mL升高到70.0 U/mL，提高了4.0倍。
与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌缺乏外膜结构，信号肽在保证分泌蛋白的正确定位和转运中同样起到重要作用。Wang等[45]研究了4个信号肽对普鲁兰酶蛋白在枯草芽孢杆菌表达效率的影响，发现分泌效率依次为SPsacB > SPamy > SPaprs > SPaprl。其中，启动子信号肽组合Papr- SPsacB可使普鲁兰酶分泌表达效率最高，酶活为2.8 U/mL，约为原菌株(0.4 U/mL) 的6.7倍。Zhang等[39]采用高通量的方法筛选在枯草芽孢杆菌中比对了173个信号肽对普鲁兰酶分泌表达的影响，发现信号肽ywtF效果最好，比对照菌株酶活性增加12.0%。
(3) 增强子是顺式作用元件的一种，可以提高蛋白的表达水平。Deng等[47]将含有增强子degQ的重组质粒pMA0911-PsacB-pul转化到枯草芽孢杆菌中表达，发现增强子degQ对普鲁兰酶的表达具有正向调控作用，酶活从4.5 U/mL提高到7.2 U/mL。此外，将degQ基因插入到离启动子PsacB更近的位置，可以进一步将酶活力提高至12.0 U/mL。
(4) mRNA的二级结构会影响自身稳定性以及与核糖体的结合效率，对重组酶的表达也有重要影响。众所周知，5′非翻译区(UTR) 序列和3′UTR序列是mRNA稳定性的决定因素。在大肠杆菌中5′UTR的SD序列可以增加mRNA的稳定性，并且提高核糖体亚基与mRNA之间的亲和力，最终增加酶的表达水平。Li等[48]在pulA编码基因的5′UTR端增加SD序列，在3′UTR处增加茎环结构后，通过半定量RT-PCR测定发现表达宿主BL21(DE3) 中普鲁兰酶的mRNA转录水平增加了3.4倍，胞外酶活与胞内酶活分别提高了107.0倍和584.1倍。
2.3 发酵条件优化对普鲁兰酶重组表达的影响发酵条件和培养基配方在重组菌株的培养中至关重要，为了改善普鲁兰酶的表达水平，研究人员在该方面进行了大量的研究。
在大肠杆菌发酵过程中，补充添加剂(如甘氨酸和Triton X-100) 可以提高表达宿主普鲁兰酶的分泌效率[49]。Nie等[40]发现培养基中添加0.6%的甘氨酸时，大肠杆菌BL21(DE3)/pET-22b(+)-pul的胞外普鲁兰酶活性达到502.0 U/mL。Duan等[50]在摇瓶和3 L发酵罐条件下考察了表面活性剂对大肠杆菌BL21(DE3)/pET-24-ompA/pulA普鲁兰酶分泌的影响，在3 L发酵罐中发酵40.0 h时添加0.5% Triton X-100时，胞外普鲁兰酶活力和分泌率分别为812.4 U/mL和86.0%。
发酵条件优化对芽孢杆菌发酵产酶水平同样具有重要影响[51]。Zhang等[36]通过在3 L发酵罐中考察了发酵条件对WB800-PHpaII-pul普鲁兰酶分泌的影响，发现优化后的重组枯草杆菌的OD600和酶活分别为84.5和102.8 U/mL，分别比优化前提高了141.0%和144.0%。Zou等[52]通过摇瓶培养基和培养条件优化后，B. deramificans来源的普鲁兰酶通过桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis) 在摇瓶中表达，活力从开始在2SY培养基中的24.3 U/mL提高到542.9 U/mL，3 L发酵罐中的活性为1 005.8 U/mL。此外，Zou等[53]发现当培养基中添加MgCl2或MgSO4培养B. choshinensis产生普鲁兰酶时，酶活分别为543.0 U/mL和534.0 U/mL，比对照提高了5.4倍和5.3倍。
3 普鲁兰酶的结构解析及分子改造 3.1 普鲁兰酶的结构解析普鲁兰酶结构的解析是探究其催化机制进而对其进行分子改造的基础。从2006年肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia) 普鲁兰酶(KPP) 的三维晶体结构被首次报道以来，已经有48个普鲁兰酶的晶体结构被解析。其中Ⅰ型普鲁兰酶有34个，Ⅱ型普鲁兰酶有14个。对比发现，不同来源的Ⅰ型普鲁兰酶蛋白结构具有高度相似性，但是不同来源的Ⅱ型普鲁兰酶蛋白结构之间有较大的差别。如图 2所示，分别是Ⅰ型普鲁兰酶(图 2A, 2B, 2C) 与Ⅱ型普鲁兰酶(图 2D, 2E) 的蛋白三维结构。
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| 图 2 几种典型的GH13 Ⅰ型普鲁兰酶(A、B、C) 和GH13 Ⅱ型普鲁兰酶(D、E) 结构域组成的比较 Fig. 2 Comparison of domain composition of several typical GH13 type Ⅰ pullulanases (A, B, C) and GH13 type Ⅱ pullulanases (D, E) |
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Ⅰ型普鲁兰酶蛋白结构一般包含A结构域、C端结构域和N端结构(N端结构通常由多个结构域组成)。A结构域为催化结构域，具有GH13家族共有的(β/α)8结构。C端结构域是α淀粉酶家族共有的希腊钥匙型反平行β桶，包含内外两层(5β/3β)β折叠，C端结构域通过内层5β折叠与催化结构域A的疏水基序相互作用，进而稳定A结构域的活性构象。不同来源的Ⅰ型普鲁兰酶其N端结构均由多个结构域共同组成，且存在一定差异。如图 1所示，来源于B. acidopullulyticus的Ⅰ型普鲁兰酶的N端结构由CBM48、X25和X45共同组成(图 2 A)[54]。Anoxybacillus sp. LM18-11 Ⅰ型普鲁兰酶晶体结构中发现其N端结构中含有CBM68和CBM48 (图 2 B)[55]。其中，CBM68结构域能专一性结合麦芽三糖或麦芽四糖；CBM48的主要功能为稳定A结构域的结构。肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae) ATCC 9621 Ⅰ型普鲁兰酶(图 2 C) 的催化结构域与其他Ⅰ型普鲁兰酶结构非常类似，其N端结构由CBM41、CBM48以及N2结构域组成[56]，与其他来源的酶略有不同。
Ⅱ型普鲁兰酶分布在GH13家族和GH57家族，其中已经解析的14个Ⅱ型普鲁兰酶均属于GH13家族。如图 2D所示，嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus) Ⅱ型普鲁兰酶包含N、A、B、C结构域[57]。其中，结构域A为(β/α)8桶结构，但是与理想的(β/α)8桶结构相比，第5条α螺旋和第6条β链是不完整的。该酶的结构域B很小，只包含一个一圈半的α-螺旋，据推测其C端结构域可能与该酶的分泌或稳定性有关。图 2E为来源于布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii) 的Ⅱ型普鲁兰酶Amy12[58]，该酶由N端结构域CBM48、A结构域和C端黏蛋白结合蛋白(MucBP) 模块组成。其中，A结构域为GH13家族典型的(β/α)8桶结构。C端的MucBP结构域虽然与CBM具有相似性，但其功能仍不清楚。GH57家族的Ⅱ型普鲁兰酶的精确三维结构目前尚未解析。但根据NCBI保守域搜索分析，来源于P. yayanosii CH1的Pully主要包含4个结构域。分别是结构域COG1449、N端催化结构域、C端结构域和一个常见于周质蛋白中的COG3889。
Ⅰ型普鲁兰酶与Ⅱ型普鲁兰酶的活性中心及关键催化残基与其所属GH家族密切相关，且具有如下规律。GH13家族Ⅰ型普鲁兰酶和GH13家族Ⅱ型普鲁兰酶的催化结构域均为(β/α)8桶状结构，活性中心位于催化结构域中，且其周围的残基通常是保守的。经过长期进化，形成了4段保守序列区域(CSR I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ) (图 3)，这4段保守序列共同构成活性中心。此外，Ⅰ型普鲁兰酶还有一段独特的保守序列motif1：“YNWGY”。其中，3个催化残基β-4-asp (催化亲核试剂)、β-5-glu (质子供体)和β-7-asp (过渡态稳定剂) 共同构成了GH13家族I型和Ⅱ型普鲁兰酶活性中心的催化三联体。该催化三联体Asp-Glu-Asp分别位于3个保守基序CSRⅡ、CSRⅢ和CSRⅣ上，催化底物分子中α-1, 6-葡萄糖苷键的水解。GH13家族的Ⅱ型普鲁兰酶还具有另外一个活性中心，用于催化底物分子中α-1, 4葡萄糖苷键的水解。与GH13家族酶不同，GH57家族的Ⅱ型普鲁兰酶具有一个双功能的催化活性中心，可以同时催化底物分子中的α-1, 6-葡萄糖苷键与α-1, 4葡萄糖苷键。其催化结构域为(β/α)7桶状结构，以β-4-glu为催化亲核试剂，β-7-asp为质子供体。
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| 图 3 GH13家族的Ⅰ型普鲁兰酶和GH13家族的Ⅱ型普鲁兰酶保守基序 Fig. 3 The conserved motifs of GH13 type Ⅰ pullulanases and GH13 type Ⅱ pullulanases. 3个保守催化残基用*号标记 Three conserved catalytic residues are marked with *. 2WAN: Bacillus acidopullulyticus; 3WDJ: Anoxybacillus sp. LM18-11; 2E8Y: Bacillus subtilis str. 168; 6J33: Klebsiella pneumoniae ATCC9621; 5YN2: Klebsiella pneumoniae; 2YOC: Klebsiella oxytoca; 6JHF: Paenibacillus barengoltzii; 2Z1K: Thermus thermophilus HB8; 5OT1: Thermococcus kodakarensis. |
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普鲁兰酶作为一种工业酶，主要与其他淀粉水解酶复配用于淀粉底物的糖化过程，该过程对普鲁兰酶的性能(耐热能力、耐酸能力和催化活力) 以及加酶量(酶制剂所占成本) 均有较高要求。然而，野生普鲁兰酶往往存在稳定性不足和活力不高的问题，分子改造是解决上述问题的主要有效手段之一。
3.2.1 普鲁兰酶的定点突变改造(1) 定点突变提高普鲁兰酶的耐热能力
近年来，定点突变提高普鲁兰酶热稳定性改造方面的研究方面取得了较多进展。已报道研究主要是在普鲁兰酶同源序列比对、结构分析的基础上，通过定点突变引入新的作用力比如疏水作用力、引入二硫键以及强离子键、脯氨酸策略等，从而提高蛋白分子结构的刚性，进而获得稳定性提升的突变体。
Bi等[59]使用分子动力学模拟，选择Bt-Pul结构中不稳定氨基酸残基进行虚拟饱和突变，结合FoldX分析以及I-Mutant 3.0和dDFIRE计算，筛选得到17个潜在的稳定突变体。再通过实验验证，最终构建得到最优突变体G692M。该突变体Tm值提高了3.8 ℃，半衰期为265.0 min，是野生酶的2.1倍。分析发现，该突变体热稳定性提高的原因，可能是高度疏水残基M的引入，促进了蛋白局部结构的稳定。Chang等[60]通过同源建模结合蛋白序列比对，对B. naganoensis普鲁兰酶进行定点突变，得到了3个稳定性提高的单突变，PulB-D328H、PulB-N387D和PulB-A414P。其中，PulB-D328H和PulB-N387D为引入强离子键的突变体，突变体PulB-A414P引入了1个脯氨酸。将3个单突变进行组合突变，得到了组合突变体PulB- 328/387/414，组合突变体的Tm值提高了5.0 ℃，半衰期是野生酶的12.9倍。Pang等[61]对Anoxybacillus sp. WB42普鲁兰酶PULA同源建模，使用GetArea工具计算PULA表面赖氨酸和甘氨酸，应用二硫键设计平台预测二硫键，构建突变文库。通过筛选获得稳定远高于野生型PulA的突变体PulAC。与野生酶PulA结构比较发现PulAC的Cys245与Cys326、Cys651与Cys707形成了新的二硫键，并且在Arg419与Asp416之间形成了新的氢键。
(2) 定点突变提高普鲁兰酶的耐酸能力
由于糖化条件具有高温、弱酸的特点，要求普鲁兰酶不仅具有较好的耐热能力，还应具有较好的耐酸能力。已报道研究主要在同源比对、表面电荷优化以及设计改造分子间相互作用力的原理基础上，通过定点突变来改变活性中心的pKa值、表面电荷与蛋白质内部的作用力比如氢键等来提高普鲁兰酶的耐酸能力。
牟国翠等[62]将栖异地克雷伯氏菌(Klebsiella variicola) SHN-1普鲁兰酶与K. pneumoniae、B. acidopullulyticus和B. naganoensis普鲁兰酶氨基酸序列进行同源比对，基于活性中心关键氨基酸的组成分析。确定了8个突变位点定点突变为酸性氨基酸。最终突变体H852D的最适pH由5.0降低为4.7，且在pH 4.5的条件下稳定性得到提高。分析发现，H852位点突变为Asp后，不但改变了活性中心的pKa值，而且与周围的氨基酸多形成了2个新的氢键，促进结构的稳定。Wang等[63]构建了B. naganoensis ATCC 53909普鲁兰酶的活性氢键网络“AHBN”，选择了2个在AHBN外边缘的残基Thr477、Asn680进行定点突变。突变体N680D改变了原子电荷方向，改善了pH敏感性与pH稳定性。突变体T477N形成的极性氢π键(Hp-π) 键，距离从3.1 Å缩小到2.7 Å，影响了His445的pKa值，提高了pH稳定性。最终组合突变体N680D/T477N进一步改善了BNPulA324的pH稳定性、pH敏感性。Chen等[64]根据B. acidopullulyticus普鲁兰酶的晶体结构，基于与催化残基相连的氢键来识别可能改变pKa的残基的方法，共筛选出19种氨基酸突变为带正电荷的Arg。其中，突变体L627R的最适pH值从5.0下降到4.0，且相对活性为野生型的1.2倍。Xie等[65]将P. yayanosii CH1 Ⅱ型普鲁兰酶活性中心残基替换以及蛋白表面氨基酸突变相结合策略，获得了组合突变体Q13H/I25E，组合突变体的最适pH为5.0，与野生型相比最适pH从6.4下降到5.0；在pH为5.0时催化效率提高了3.3倍；比活力提高了2倍为63.9 U/mg；在酸性pH (pH 4.0−5.4) 条件下保持4.0 h后几乎保持了初始活性，表现出更高的耐酸性。
(3) 定点突变提高普鲁兰酶的催化活力
定点突变不仅可以对普鲁兰酶进行热稳定性改造，也被用于提高普鲁兰酶的催化活力。王馨叶[66]使用EVcouplings生物信息工具将B. naganoensis普鲁兰酶BnPul氨基酸全序列进化耦联位点分析，根据其耦联强度与空间分布位置理性分组残基对，进行饱和突变，构建得到的突变体A232G/I226A。突变体的比活力为550.0 U/mg，是野生型BnPul活力的1.5倍。分析认为，酶活力提高的原因可能是由于突变引起的远端效应对酶促反应产生影响。为了提高计算的精确度，王馨叶将全序列缩小范围到结构域考察了结构域内与结构域间的残基对催化效率的影响，使用EVcouplings分别分析BnPul结构域CBM48、催化结构域和C-末端的氨基酸序列，并且使用EVcomplex分析CBM48和催化结构域氨基酸序列间的进化耦联位点，根据耦联强度与空间结构位置，选择了7对残基对进行饱和突变，最终获得叠加突变体V328L/I565L比活力为870.0 U/mg，是野生型BnPul活力的2.4倍。
3.2.2 普鲁兰酶的结构域或肽段改造普鲁兰酶一般由5−6个结构域组成，其中N端包括2−3个结构域，且多为CBM结构域。N端的CBM结构域通常与底物结合有关，并且与催化结构域之间的联系相对松散。普鲁兰酶的结构域或肽段改造主要集中在对N端CBM结构域或肽段的截短、替换等。
研究表明，普鲁兰酶不稳定结构域或肽段的截短突变可以提高其热稳定性并改善酶的表达水平。这可能是由于结构域或肽段的切除使得普鲁兰酶的分子量变得更小，结构更紧凑，而且有利于酶的跨膜运输和正确折叠，提高了胞外分泌效率。段绪果[67]对B. deramificans普鲁兰酶PulBd的N端结构域或肽段(CBM41、相关linker及X25) 进行截短突变，构建了突变体Puld1′、Puld1和Puld2。结果显示，突变体的分泌效率分别是天然酶的3.1、3.4和3.8倍，比活力分别是天然酶的88.1%、92.1%和61.8%。Pang等[2]根据NCBI保守结构域搜索分析PulPY结构域，对PulPY的N端和C端结构域进行了截断。截短突变体Δ28N+Δ791C的最适温度提高到100.0 ℃，比活力为32.2 U/mg，是野生型PulPY的6.0倍。王馨叶[66]采用在线工具DisMeTa对普鲁兰酶BnPUL无序结构进行预测，并对其进行删除改造，结果显示突变体ΔN5和ΔN106的比活力分别为410.0 U/mg和490.0 U/mg，是野生型的1.3倍与1.9倍。分析发现，ΔN5删去了N端1−5位氨基酸无序片段，使得酶结构更加精简与紧凑，无规则结构含量降低，使得酶稳定性大大提高。突变体ΔN106删除了CBM41结构域，使得酶与底物的空间位阻变小，有利于活性中心与底物的接触。
然而，有些结构域的截短突变会对普鲁兰酶的折叠和活性产生不利影响。Wang等[68]发现Anoxybacillus sp. WB42来源的普鲁兰酶N-末端CBM68结构域的缺失不仅未能提升酶的催化能力还降低了酶的热稳定性和底物选择性。张石玉[69]对来源于甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus) 的PulPB1的N端CBM68截短，发现产生了大量的包涵体且其催化活性与稳定性都发生下降。段绪果[67]对天然酶PulBd进行改造，在切除了CBM41、X25的突变体Puld2基础上再次切除了X45，发现突变体不但没有酶活，而且产生大量包涵体。因此，推测上述结构域是普鲁兰酶蛋白折叠以及维持蛋白的正确构象所必需的，该结构域的缺失极易导致包涵体的形成和酶活性的丧失。
此外，嵌合酶策略是指通过酶工程改造的方法对蛋白质进行结构域的交换或嵌入，从而改造酶蛋白的热稳定性等特性。该策略也被用于对普鲁兰酶的改造。Li等[70]对热小链地芽孢杆菌(Geobacillus thermocatenulatus) 普鲁兰酶的N末端进行剪切和杂交拼接得到730T (缺失N末端85个氨基酸的PulGT)、730T-U1 (730T的N末端与CBM41和X45-X25结构域拼接) 和730T-U2 (X45-X25域拼接的730T)。结果显示，突变体730T-U1形成大量包涵体，蛋白难以可溶表达。突变体730T-U2的Km值为32.9 mg/mL，为PulGT的1.4倍。这表明N末端X45-X25结构域的插入，降低了酶的底物结合能力。此外，突变体730T和突变体730T-U2在65.0 ℃下的热稳定性均明显下降，表明X45-X25结构域的剪接虽然没有显著影响蛋白质表达，但对其热稳定性产生了负面影响。
4 总结与展望普鲁兰酶能够高效水解淀粉分子中的α-1, 6-葡萄糖苷键，在淀粉深加工工业中具有重要的应用价值。近年来，随着相关行业对普鲁兰酶需求的日益增加，该酶逐渐成为食品酶学领域的研究热点之一。本文综述了普鲁兰酶产酶菌株的筛选、编码基因的鉴定及克隆表达方面的研究现状；并从宿主菌株、表达元件及发酵条件优化等方面探讨了影响普鲁兰酶产酶异源表达水平的关键因素；总结了Ⅰ型、Ⅱ型普鲁兰酶结构解析方面的进展，对比了不同类型普鲁兰酶在结构域组成、活性中心及关键催化残基等方面的共性及不同之处；梳理了酶分子改造技术在普鲁兰酶耐热性、耐酸性及催化活力等方面的研究进展。总结发现，普鲁兰酶研究及生产中仍然存在着酶性能不佳，以及产酶水平低、成本高等不足，是当前及未来研究中需要解决的几个主要问题。笔者认为可以通过以下方面来进一步开展相关研究：(1) 从极端环境、生物数据库等挖掘不同来源微生物中的普鲁兰酶新编码基因，以获得具有独特性能的天然普鲁兰酶；(2) 近年来，在蛋白质结构的AI预测、计算机辅助酶分子设计等技术发展迅猛，这些新技术的应用为改善普鲁兰酶性能(耐热性、耐酸性等) 提供了更多的技术手段和机遇；(3) 此外，基于普鲁兰酶蛋白结构及序列空间相互作用的深入研究，进一步阐明影响普鲁兰酶难以可溶性表达的分子机制，并进行针对性地强化改造，有望对提升该酶可溶性表达水平起到重要作用；(4) 在挖掘并改造表达元件、优化发酵体系的同时，通过宿主菌株的改造，提高宿主对重组“毒性蛋白”过量表达的耐受性，增加宿主细胞存活力、减少退化现象，进一步提高普鲁兰酶的发酵水平。
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