2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 刘思敏, 齐海山
- LIU Simin, QI Haishan
- 赖氨酸脱羧酶分子改造及固定化合成1, 5-戊二胺研究进展
- Molecular engineering and immobilization of lysine decarboxylase for synthesis of 1, 5-diaminopentane: a review
- 生物工程学报, 2022, 38(12): 4403-4419
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(12): 4403-4419
- 10.13345/j.cjb.220400
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文章历史
- Received: May 19, 2022
- Accepted: July 14, 2022
- Published: July 20, 2022
引用本文
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1, 5-戊二胺又名尸胺，在农业[1]、食品[2]、医药[3]和工业领域均有广泛应用。尤其在工业领域，可以和多种二元羧酸聚合制备性能优良的生物基聚酰胺PA5X。如与丁二酸缩聚合成的PA54，耐油溶胀性、耐冲击性以及防渗透性性能优异[4]；与己二酸缩聚合成的PA56，吸潮透气性好、拉伸强度高[5]；与癸二酸缩聚合成的PA510，其机械性能强、熔点高、密度低[6]。生物基聚酰胺PA5X可广泛应用于汽车零部件、包装材料、电子设备及航空技术等领域[7-8]。全球每年消耗约3000万t的聚酰胺产品，且呈持续上升趋势[9]。石油基聚酰胺材料面临石油资源的短缺以及生产过程中环境污染等问题。与传统石油基材料相比，生产1 t的生物基材料可以节省(55 000±34 000) J的一次能源(自然存在的、未经人类改造为另一种形式的能源)，减少(3±1) t的CO2当量温室气体排放[10]。因此，1, 5-戊二胺作为制备新型生物基聚酰胺材料的重要原料，有望替代石化基己二胺，在聚酰胺材料市场发挥重要作用。
1, 5-戊二胺的生物合成法主要包括微生物从头合成及全细胞催化[11-12]。微生物从头合成是指宿主菌株利用葡萄糖、纤维二糖等碳源合成1, 5-戊二胺，常用的宿主包括大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌[7, 13-15]。该方法可利用多种底物生产1, 5-戊二胺，除常见糖类外，还可以利用甘油、甲醇、甲烷等物质。Kim等[13]通过用强启动子H30调控来自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei) 的赖氨酸脱羧酶ldcC基因，并将其整合至谷氨酸棒状杆菌lysE位点构建了重组菌株GH30HaLDC，以葡萄糖为底物生产1, 5-戊二胺，产量可达125 g/L，是目前微生物从头合成的最高产量。全细胞催化是指以l-赖氨酸溶液为底物，利用表达赖氨酸脱羧酶的工程细胞催化生成1, 5-戊二胺[16]。Ma等[17]在大肠杆菌中共表达赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase, CadA) 和尸胺-赖氨酸转运蛋白(cadaverine-lysine antiporter protein, CadB)，构建了全细胞催化体系，16 h后1, 5-戊二胺产量可达221 g/L，摩尔产率达到92%。全细胞催化整个催化过程简单，副产物少，且底物l-赖氨酸已经成功实现了商业化，是一种生产1, 5-戊二胺的理想原料。无论是全细胞催化还是微生物从头合成，赖氨酸脱羧酶均是生产1, 5-戊二胺过程中的关键酶。
文献报道了多种植物和微生物来源的赖氨酸脱羧酶，例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)[1]、尸毒杆菌(Bacterium cadaveris)[18]、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)[19]、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)[20]、大肠杆菌(Escherichia coli)[21]等。目前，NCBI数据库里收录的大都是来自微生物的赖氨酸脱羧酶序列。我们在NCBI数据库中选择了收录数量最多的19种不同物种(肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、类肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella quasipneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、金黄色葡萄杆菌(Staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)) 来源的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行系统进化树构建。如图 1所示，这19种赖氨酸脱羧酶分为5簇，其中属于肠杆菌目来源的7种和属于弧菌目来源的2种在同一簇，芽孢杆菌目Listeria monocytogenes和假单胞菌目Pseudomonas aeruginosa各成一簇，伯克氏菌目菌种来源的2种赖氨酸脱羧酶自成一簇，其余6种成一簇。该系统进化树不仅可以反映已有的赖氨酸脱羧酶的进化和同源关系，还可以确定新发现的酶与已有的酶的进化和同源关系[22]。
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| 图 1 不同赖氨酸脱羧酶菌株系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of different lysine decarboxylases. |
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其中，大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶研究最为广泛，赖氨酸脱羧酶有两种，一种是组成型赖氨酸脱羧酶LdcC，可以在不加任何诱导剂的条件下表达；另一种是诱导型赖氨酸脱羧酶CadA[23-24]。赖氨酸脱羧酶在催化l-赖氨酸生产1, 5-戊二胺的过程中，需要添加辅酶磷酸吡哆醛(pyridoxal-5′ phosphate, PLP)，每一个脱羧反应周期中都会消耗H+，使反应体系的pH随反应进行而逐渐增高，导致赖氨酸脱羧酶的多聚体结构被破坏[25]。因此，提高赖氨酸脱羧酶的活性，加强该酶结构稳定性和pH耐受性对于开发高效的1, 5-戊二胺生产工艺至关重要，下文将介绍赖氨酸脱羧酶的作用机理、赖氨酸脱羧酶的分子改造方法、固定化策略及未来展望，旨在提升1, 5-戊二胺生产效率并降低生产成本。
1 赖氨酸脱羧酶的结构及性能赖氨酸脱羧酶通常是一种由5个二聚体组成的十聚体结构(图 2)，每个单体的核心结构域紧密相连形成二聚体，其单体分为3个结构域，分别是N端翼结构域(残基1–129)、核心结构域(残基130–563) 和C端结构域(残基564–715)，其中核心结构域由连接区域和两个子结构域(PLP结合结构域和子结构域4) 组成[24]。体系pH的变化会影响赖氨酸脱羧酶的催化活性，主要原因是赖氨酸脱羧酶的多聚体构象会随着pH的变化而改变，在较低的pH条件下，酶通常是以低聚物的形式存在，在较高的pH条件下，酶会形成十聚体和二聚体，且二聚体占比会随着pH的增加而增加。而赖氨酸脱羧酶的最佳构象是十聚体，因此，赖氨酸脱羧酶的催化能力往往随着pH增加先变强再变弱[26]。
Marc等[23]对LdcC酶的催化参数进行了测定，发现该酶pH活性广泛，最适pH为7.6，高于CadA的5.5；最适温度是52 ℃，与CadA相同。尽管LdcC的最适pH比CadA高，但CadA的比酶活通常高于LdcC，且CadA具有更优越的热稳定性，在70 ℃的条件下活性尚能保持，而LdcC从37 ℃开始，活性便会随着温度的增加而下降。在表 1中总结了目前已经报道的赖氨酸脱羧酶的最适温度和最适pH，不同来源的赖氨酸脱羧酶最适条件有很大不同。
| Lysine decarboxylases | Optimum temperature (℃) | Optimum pH | Origin | References |
| LdcC | 37 | 6.5 | Hafnia alvei | [19] |
| LdcC | 52 | 7.6 | Escherichia coli | [23] |
| LdcC | 37 | 7.0 | Klebsiella pneumoniae | [27] |
| Ldc | 50 | 6.0 | Selenomonas ruminantium | [28-29] |
| Ldc | 55 | 5.5 | Klebsiella oxytoca | [30] |
| PaLdc | 60 | 6.5 | Photobacterium angustum | [31] |
| AsLdc | 50 | 7.5 | Aliivibrio salmonicida | [31] |
| EtLdc | 60 | 7.0 | Edwardsiella tarda | [31] |
| GoLDC | 30 | 9.0 | Gluconobacter oxydans | [32] |
| PpLDC | 30 | 9.0 | Bacillus licheniformis | [32] |
| BlLDC | 60 | 7.0 | Pseudomonas putida | [32] |
| CadA | 52 | 5.5 | Escherichia coli | [23] |
| CadA | 37 | 7.0 | Klebsiella pneumoniae | [27] |
| CadA | 37 | 6.0 | Vibrio vulnificus | [33] |
| CadA | 40–50 | 5.5 | Vibrio parahaemolyticus | [34] |
| SmcadA | 40 | 6.0 | Serratia marcescens | [35] |
| Unnamed | ND | 7.0 | Geobacillus thermodenitrificans | [36] |
| Unnamed | 37 | 7.5 | Soybean | [37] |
大肠杆菌中诱导型赖氨酸脱羧酶CadA发现更早且研究更深入，CadA作为Cad系统中的一员，在低pH和过量赖氨酸的条件下诱导表达以减轻酸胁迫[38]。大肠杆菌的Cad系统包括编码CadA和CadB的CadBA操纵子，以及膜整合转录激活因子CadC[39-41]。LysP是一种赖氨酸特异性渗透酶，可以感知外源赖氨酸的变化，与CadC共同诱导大肠杆菌对赖氨酸的适应[40, 42]。如图 3所示，当富赖氨酸环境(> 5 mmol/L) 是酸性条件(pH < 6.8) 时，CadC和LysP之间的相互作用减弱，此外，l-赖氨酸的结合/易位使LysP的构象进一步改变，从而导致CadC和LysP的解离[43]。然后，激活的CadC取代H-NS蛋白，与CadBA上游区域的Cad1和Cad2位点结合，激活CadBA操纵子的转录和表达，从而实现l-赖氨酸向1, 5-戊二胺的合成[44]。同时，CadA活性还被ppGpp和产物1, 5-戊二胺抑制，ppGpp是一种严格的反应效应物，在缺乏氨基酸的细胞中迅速积累，以防止赖氨酸过度消耗，而当1, 5-戊二胺过量时，会与CadC结合抑制其活性[24]。
赖氨酸脱羧酶是一种折叠型Ⅰ型PLP依赖酶(图 4A)，PLP又被称为维生素B6，是许多酶催化反应的辅助因子，在涉及氨基酸的代谢途径中发挥关键作用[26, 45]。大多数依赖于PLP的酶催化过程都包括以下步骤：首先形成一个内部的醛亚胺，其中PLP与一个高度保守的活性位点赖氨酸残基结合，形成一个席夫碱，这样才能激活酶。随后，PLP-酶复合物与底物发生反应，PLP在氨基底物上形成一个新的席夫碱[46]。Rocha等[26]提出了一种赖氨酸脱羧酶在PLP的辅助下催化合成1, 5-戊二胺的机制，如图 4B所示，主要有以下4个步骤：PLP上的醛基亲核攻击活性位点Lys367的氨基，两者形成稳定的酶-PLP复合物，即内部的醛亚胺，l-赖氨酸攻击内部醛亚胺导致PLP与Lys367之间的亚胺键发生断裂，与此同时，PLP会与l-赖氨酸的氨基结合形成一个外部的醛亚胺；l-赖氨酸发生脱羧反应，释放CO2并且形成醌中间体；醌中间体从反应介质中获得H+，实现了质子化再次形成外部醛亚胺；最后随着最终产物1, 5-戊二胺的生成释放，内部醛亚胺重新建立，进入生产1, 5-戊二胺的循环。
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| 图 4 大肠杆菌中赖氨酸脱羧酶(PDB号：3N75) 的3D结构及催化机制[26] Fig. 4 The 3D structure and mechanism of lysine decarboxylase (PDB No. 3N75) in E. coli[26]. A：3D结构，底部是其活性位点，绿色是内部醛亚胺的位置；B：赖氨酸脱羧酶在PLP辅助下生产1, 5-戊二胺的机制 (A) The 3D structure, with the active site at the bottom and the internal aldoimide in green. (B) The mechanism of lysine decarboxylase production of 1, 5-pentanediamine assisted by PLP. |
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为了进一步提升1, 5-戊二胺的生产效率，研究人员对赖氨酸脱羧酶进行了分子改造来提高酶的稳定性，主要包括定向进化策略、定点突变策略以及“EKylation”策略(图 5)。
定向进化是提高目标蛋白功能的一种方法，可以通过快速进化成功生成一个大的突变体库，然后通过高通量筛选或选择方法来获得所需的突变体，一个改进的突变体被用作后续循环的模板，直到满足所需的生物催化剂改进程度[19, 50-56]。Wang等[19]利用易错PCR和DNA改组技术构建了大肠杆菌JM109/pTrc99a-ldcLDC突变体，并且建立了一种基于pH指标的敏感高通量筛选策略，溴甲酚紫作为LBBL板中的颜色指示剂，可以准确、快速地筛选阳性转化子。通过高通量筛选获得了改良的突变体，其中LDCV147F/E583G突变体的催化活性最高，是野生型LDC活性的1.62倍，分析发现E583G位点发挥关键作用。且与野生型LDC比对，LDCE583G的Vmax是野生型LDC的1.32倍，LDCE583G突变体的1, 5-戊二胺产量比野生型LDC提高了1.48倍。这一结果可能是因为E538位于LDC的C端结构域(C-terminal domain, CTD)，而CTD是进入酶活性位点通道的一部分[57]，所以E583G这一突变有效提升了酶活性。另外，随着计算机技术的快速发展，Xi等[47]将定向进化和计算引导的虚拟筛选结合起来提高赖氨酸脱羧酶CadA的稳定性，开发了一种高通量筛选方法(以0.1%麝香草酚蓝和0.1%酚酞(3︰1, V/V) 组成的混合指示剂) 来区分在50 ℃和pH 8.0条件下的赖氨酸脱羧酶活性，并基于这种高通量筛选方法，对CadA进行了定向进化。分别使用CUPSAT、iStable和Rosetta-ddG对不同位点进行了虚拟饱和诱变，筛选出突变体E445Q，在50 ℃和pH 8.0的条件下，1, 5-戊二胺的产量提高了13%。筛选出的四点突变体K477R/E445Q/ F102V/T88S显示出优越的性能，于70 ℃孵育70 min后残留活性为49.14% (野生型为5.81%)，在50 ℃条件下催化2.0 mol/L l-赖氨酸溶液生成160.7 g/L (野生型为143.7 g/L) 1, 5-戊二胺。通过分析野生型和K477R十聚体界面上K543和E104之间的盐桥及距离(图 6A)，表明盐桥相互作用可以阻止CadA十聚体的解离；对比477位点突变前后表面电荷分布(图 6B和6C)，发现突变体K477R周围有更多的正电荷，而这些正电荷可以中和蛋白质表面的负电荷，减少蛋白质表面不利的静电相互作用，有助于提高稳定性。定向进化策略的优势就在于能提升酶的大部分性能，包括酶的催化活性、稳定性以及底物谱等，但需要开发配套的高通量筛选方法。
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| 图 6 野生型CadA (PDB: 3N75) 和突变体K477R[L4] [47] Fig. 6 The wild type CadA (PDB: 3N75) and K477R mutant[47]. A：十聚体界面上K543和E104′之间的盐桥及距离477位点周围静电表面的比较；B：野生型；C：K477R突变体。蓝色表示正电荷，红色表示负电荷 (A) Salt bridge and distance between K543 and E104' at the decamer interface. Comparison of the electrostatic surface around residue 477. (B) The wild-type CadA. (C) The K477R mutant. Blue means positive charge, while red means negative charge. |
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定点突变是指通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 等方法向目的DNA片段中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等，是一种提高酶的稳定性的常用方法。通常有两种方法可以产生突变结构：引物延伸[58]和DNA替换[59]。为了提高赖氨酸脱羧酶的结构稳定性，Kim[60]课题组通过定点突变在赖氨酸脱羧酶多聚体的界面处引入4对二硫键，如图 7所示，分别是A1(V91C/G445C)、A2(F102C/T544C)、B1(F14C/K44C)和C1(P233C/L628C)，在不同的pH条件下，对这4株以及野生株的活性进行了检测。B1突变体对高pH的条件更加耐受，当在pH 9.0条件下孵育后，野生型CadA只剩下9%的活性，而B1突变体保留了84%，在pH为10.0的条件下，该突变体依旧保持了其76%的原始活性。突变体B1的半衰期增加216倍，这一结果表明，通过二硫键共价连接的十聚体复合体结构不仅显著提高了B1突变体的碱性pH稳定性，而且还显著提高了B1突变体的热稳定性。在B1的基础上进行另一轮突变体筛选，得到突变体B1/L7M/N8G，该突变体的1, 5-戊二胺产量达到了157 g/L，而野生型的产量只有119 g/L。这说明对赖氨酸脱羧酶的十聚体界面进行二硫键突变是一种有效地提高酶稳定性及1, 5-戊二胺产量的策略。Kou等[48]通过对赖氨酸脱羧酶的多聚界面进行工程化设计，选择最佳的突变体T88S并对其性能进行了测试，与野生型CadA相比，T88S具有更高的热稳定性，在70 ℃条件下的半衰期增加了2.9倍，熔化温度从76 ℃增加至78 ℃。在pH为8.0的条件下培养10 h后，野生型和突变体残留的活性分别是57%和78%。结果表明通过界面工程加强十聚体结构可以增强赖氨酸脱羧酶在碱性pH条件下的活性及稳定性。T88S的1, 5-戊二胺产率为40 g/(L·h)，高于野生型的28 g/(L·h)。进一步证明赖氨酸脱羧酶的多聚体界面残基在结构稳定性及其催化功能中发挥重要作用。定点突变策略具有突变率高、重复性好的优点，但需要建立在蛋白质三维结构已知的条件下，通过分析其分子结构与功能之间的关系确定可以突变的氨基酸位点。
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| 图 7 野生型CadA (PDB: 3N75) 的界面区域[60] Fig. 7 Interfacial region of wild-type CadA (PDB: 3N75)[60]. A：二聚体结合形成十聚体的两个界面，分别记为A和B，分别预测了2对和1对二硫键；B：组成二聚体的两个单体之间的界面C，预测了1对二硫键 (A) The two interfaces at which the dimer binds to form the decamer, denoted A and B, predicted two and one pair of disulfide bonds, respectively. (B) Interface C between the two monomers forming the dimer, predicted one pair of disulfide bonds. |
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化学修饰策略的目的是通过对蛋白质结构进行化学反应来得到新的生物耦联物，同时还可以保持蛋白质的完整性和功能，是一种有效的改造蛋白方式，通常包括酰基化、甲基化、泛素化、糖基化和硫酸化等[61-62]。而由阳离子和阴离子基团组成的两性离子聚合物可以为蛋白质提供一个稳定的环境，含有重复交替带电的谷氨酸(Glu, E) 和赖氨酸(Lys, K) 残基的聚(EK) 多肽可以用来修饰蛋白质，将这一策略称为“EKylation”[63-65]。Du等[49]在赖氨酸脱羧酶的C端融合一段聚(EK) 多肽获得了工程化赖氨酸脱羧酶CadA-EK (图 8A)。在不同pH及温度下，CadA-EK的酶活均远远大于野生型CadA。CadA-EK的耐碱性增强，在pH为8的条件下孵育30 min后，CadA全部失活，而CadA-EK的残留活性无下降。在有机溶剂和蛋白变性剂中孵育30 min后，CadA-EK的残留活性是CadA的2–7倍。4 ℃储存21 d后，CadA-EK可以保留最初酶活力的50%，而CadA全部失活。通过对这两种酶的动力学参数测试，发现CadA-EK的催化效率是CadA的2倍。该研究提出了“拥抱握手”模型对CadA-EK催化活性和稳定性提升机理进行解释。如图 8B所示，将二聚体的两条链分别命名为“A链”和“H链”，经过分子动力学模拟分析，H链poly(EK) 多肽中的Glu残基与A链的Lys290A、Lys287A、Arg288A之间存在氢键作用，将其定义为“拥抱”模型。H链的poly(EK) 多肽中的Glu残基与A链poly(EK) 肽的Lys残基之间存在氢键作用，定义为“握手”模型，同样，H链poly(EK) 多肽的Lys残基与A链的Asn294A、Glu291A相互作用(拥抱模型)，并与A链poly(EK) 的Glu残基相互作用(握手模型)。在“拥抱-握手”作用机制下，由于两条链的紧密结合导致两个二聚体单体之间的结合变得更紧密，有助于稳定催化反应过程中的过渡态，从而提升催化常数。同时，由于poly(EK) 多肽的超亲水性，可以将水从酶分子的疏水区域“抽”出，不仅可以改变活性中心的微环境，也可以提高酶的结构刚性，使其稳定性提升。“EKylation”修饰功能蛋白操作简单，目前已经实现对β-内酰胺酶、聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶、赖氨酸脱羧酶的修饰改造。“EKylation”修饰有望成为一种通用的蛋白改造策略，用于提升酶分子的催化功能。
随着工业酶市场的扩大以及固定化酶更稳定、易分离、可重复的优点，研究人员致力于开发不溶性固定化酶，并广泛应用于制药、食品、纺织业等各个领域[66-69]。已有多种材料用于酶分子的固定，包括海藻酸盐、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、碳纳米管、介孔二氧化硅、氧化石墨烯、陶瓷、金属有机框架MOF材料等[70-71]。表 2总结了固定化赖氨酸脱羧酶的研究。由于赖氨酸脱羧酶依赖于PLP发挥活性，一些PLP与酶共固定的方法也吸引了研究人员的兴趣。下面将介绍赖氨酸脱羧酶的酶固定及与辅酶PLP的共固定研究进展。
| Enzymes | Immobilization carriers | Co-immobilization with PLP | Cycles (times—conversion) | 1, 5-diaminopentane (g/L) | References |
| CadA | 3-hydroxybutyric acid and related proteins | No | 5 times—75% | ND | [72] |
| LDCEt | MOF(UIO-66-NH2) | No | 5 times—58% | 182.59 | [73] |
| CadA | Chitin-chitin binding domain | No | 4 times—57% | 135.60 | [74] |
| CadA | Barium alginate | No | 4 times—40% | 36.78 | [75] |
| CadACLEA | None | No | 10 times—53% | 10.22 | [76] |
| LDC | Chitin-chitin binding domain | Yes | 5 times—55% | ND | [77] |
| CadA-KE | Barium alginate | Yes | 5 times—30% | 184.53 | [78] |
目前，赖氨酸脱羧酶的固定包括胞内固定及胞外固定。胞内固定又称为原位固定，如图 9A所示，Seo等[72]建立了一种胞内固定化体系，通过将P(3HB) 颗粒相关蛋白(PhaP1) 的碱基序列添加在cadA基因的3′末端实现了PhaP1与CadA融合，该融合体可以与细胞内的P(3HB) 结合。固定化CadA-P(3HB) 复合物具有更好的热稳定性，在50 ℃下的半衰期为70 h，在5个循环反应中获得了75%–80%的转化率。结果表明原位固定化的CadA是一种稳定的、可重复使用的赖氨酸脱羧酶，这种固定化策略的优势在于不需要额外的酶纯化及固定化过程，但是相关质粒的加入也造成一定程度的细胞负担。选择合适的载体来对酶分子进行固定是最常用的酶固定化策略，如图 9B所示，Yao等[73]首次提出将赖氨酸脱羧酶(LdcEt) 固定在锆基金属有机骨架材料UIO-66-NH2的表面这一策略。且LdcEt@UIO-66-NH2比游离LdcEt具有更高的催化效率和酶活性、更宽的pH和温度反应范围。与游离酶相比，LdcEt@UIO-66-NH2在高水平底物浓度(365.3 g/L) 条件下，2 h内催化产生的1, 5-戊二胺滴度达到182.59 g/L，高于游离酶的产量(161.34 g/L)。酶固定策略可选择载体较多，且载体多是不溶性材料，更容易实现固定化酶的分离及储藏。这些研究均表明，固定化赖氨酸脱羧酶是一种提高其稳定性和循环催化能力的有效策略。
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| 图 9 酶固定化的机制[72-73] Fig. 9 Mechanism of enzyme immobilization[72-73]. A：PhaP1融合蛋白固定在细胞内P(3HB) 颗粒上；B：赖氨酸脱羧酶(LdcEt) 固定在锆基金属有机框架材料(MOF)UIO-66-NH2上 (A) Immobilization of PhaP1 fusion protein on intracellular P(3HB) granules. (B) Immobilization of lysine decarboxylase (LdcEt) on the surface of the zirconium-based metal-organic framework material (MOF) UIO-66-NH2. |
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赖氨酸脱羧酶是一种PLP依赖性的酶，在催化生产1, 5-戊二胺的过程中往往需要外源添加PLP，实现辅酶PLP和酶分子的共固定将会使辅酶实现循环使用，这将节省催化过程的成本[75]。一种用几丁质有效共固定赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase, LDC)和PLP的方法被提出[77]，通过调节几丁质的去乙酰化程度来增强PLP的吸附和固定化，通过融合的几丁质结构域来固定LDC，这是利用几丁质实现赖氨酸脱羧酶和PLP共固定的首次报道。自给自足的生物催化剂在5个循环后保持了超过55%的原始活性，该策略为实现PLP依赖的酶的共固定化提供了一种新的途径(图 10A)。Mi等[78]在通过“EKylation”获得CadA-KE的基础上，利用海藻酸钡微球一步纯化并固定CadA-KE，并通过聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI) 的引入实现辅酶PLP和酶的共固定(图 10B)，此方法得到的共固定化酶在2 mol/L l-赖氨酸溶液中可以产生184.53 g/L 1, 5-戊二胺。55 ℃孵育30 min后，共固定化酶的转化率约为外源添加PLP的5倍，65 ℃孵育30 min后，共固定化酶仍旧保持高活性(约80%)，而未共固定的酶已经完全失活。共固定化酶在储存30 d后，转化率几乎没有下降，而未共固定的酶的转化率下降至38.26%。此外，共固定化酶的催化效率提升了3.4倍，并且实现了连续催化l-赖氨酸生产1, 5-戊二胺，产率为14.28 g/(L·h)。这些结果表明实现赖氨酸脱羧酶与辅酶PLP的共固定是一种有效的策略，可以节省操作时间和成本。
聚酰胺材料广泛应用于我们的日常生活中，常见的石油基聚酰胺材料往往面临着石油资源不可再生，生产过程中的副产物造成环境污染等问题，而合成生物学技术的发展使得利用清洁可再生的能源生产聚酰胺材料成为可能。1, 5-戊二胺是生产生物基聚酰胺的重要单体，有望替代石油基己二胺在聚酰胺市场发挥重要作用。赖氨酸脱羧酶作为生物合成1, 5-戊二胺的关键酶，其结构稳定性较差，容易受到反应环境(尤其是pH) 的影响。提升赖氨酸脱羧酶的催化能力及稳定性是提升1, 5-戊二胺产量的重要方法，目前常用的改造方法是分子改造以及进行固定化，鉴于目前研究进展，未来可以在下述方面加强研究。
(1) 不同物种来源赖氨酸脱羧酶性能研究。赖氨酸脱羧酶来源十分广泛，仍有多种不同来源的酶学特性未进行深入研究。因此，通过对不同物种来源的赖氨酸脱羧酶性能研究可以更加了解其构效关系，挖掘催化性能更好的酶，进一步提升1, 5-戊二胺的生物生产效率。比如利用多肽识别模式挖掘出爱德华氏菌(Edwardsiella tarda) 来源的赖氨酸脱羧酶LdcEt，稳定性好，催化活性高，具有一定的工业化应用潜力[79]。
(2) 基于人工智能技术的高效赖氨酸脱羧酶理性设计研究。近年来，该技术已经在酶定向进化中发挥了重要作用，可以对蛋白质结构以及功能进行预测。该技术依赖于蛋白质数据库，对所需数据的准确性及数量要求较高。对酶结构的准确预测，能大大简化设计新型高效赖氨酸脱羧酶的进程，有望获得催化活性和稳定性更好的赖氨酸脱羧酶。
(3) 自组装蛋白纳米结构的深入研究。该结构利用可以自组装的蛋白(例如酿酒酵母蛋白Sup35) 作为酶固定化载体。与普通的固定化载体相比，这种自组装可以实现对载体表面酶固定位点的精确操控，还可以通过对载体蛋白质的修饰实现对固定酶的催化界面调控，有利于提高固定化酶在不同环境中的稳定性和活性。利用自组装蛋白质为载体对赖氨酸脱羧酶进行固定的效果值得期待。
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