核盘菌Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary是一种世界性的死体营养型真菌，可侵染600多种植物^[1]，自1837年报道以来，一直是以毁灭性病害的形式出现。病原菌在侵染植物过程中可分泌多种细胞壁裂解酶类物质，包括果胶酶、纤维素酶、角质酶等，其中角质酶不仅可以水解植物最外层保护组织——角质层和木栓层^[2-3]，许多植物病原真菌的角质酶还和病原菌的毒性相关，例如在桃褐腐病菌Moniliania fructicola中，过表达MfCUT1可以增强病原菌侵染李属植物的能力^[4]，在玉米黄斑病菌Curvularia lunata中，敲除ClCUT7可降低其对玉米叶片的毒力^[5]。油菜轻叶斑病菌Pyrenopeziza brassicae的角质酶单突变株NH10-1224在经角质诱导后未检测出角质酶的活性，扫描电镜下也未在突变株中观察到角质酶渗入到角质层而引起侵染症状，更加直观地表明角质酶是P. brassicae侵染油菜角质层的必要前提^[6]。角质酶除参与病原菌的毒性外，还参与真菌侵染结构和附着胞的形成^[7-8]，此外，在蚕豆锈病致病过程中，角质酶通过参与孢子粘贴到寄主表面的方式参与其侵染过程^[9]。

角质酶属于丝氨酸酯酶，既可催化水解不溶性多聚体角质的酯键，也可以作用于其他长链、短链脂肪酯、乳化的甘油三酯等^[10]，来源于腐皮镰刀菌Fusarium solani^[11]和炭疽病菌Glomerella cingulata^[12]角质酶的晶体结构已被解析，它与脂肪酶或酯酶通过共同的α/β水解酶进行折叠^[13]。角质酶可降解脂肪族或芳香族聚酯，甚至对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET) 也具有较好的降解作用^[14-15]，近年来角质酶被人们所重视，将特异腐质霉Humicola insolens的角质酶进行重组原核表达，发酵条件经优化后发酵罐产生的角质酶酶活最高可达2 233 U/mL，是摇瓶水平酶活的13倍^[16]。在培养基中含有木瓜角质的情况下，镰刀菌Fusarium falciforme发酵液测得的角质酶活性可达(3.42±0.24) U/mL^[17]。虽然从病原菌中诱导表达的角质酶报道较多，但目前角质酶活性也仅限于研究层面，市面上角质酶产品非常稀缺，因此寻求一种高效表达的角质酶用于工程酶的开发非常有必要。本研究从具有较强侵染能力的核盘菌中筛选得到高效表达的角质酶基因，采用异源表达的方法得到该角质酶，进一步对其特性进行研究，以期为后期该蛋白的开发利用奠定基础。

核盘菌(菌株编号：CCTCC AF 2021085 Sclerotinia sclerotiorum Ss10715) 为前期从油菜秸秆中分离并保存于实验室，pMD18-T载体、RNA提取试剂盒、反转录及定量PCR所用试剂盒均购自宝生物工程(大连) 有限公司，Escherichia coli DH5α感受态细胞、Escherichia coli BL21(DE3) 感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司，pET-28a(+) 载体为本实验室保存。4-硝基苯丁酸酯(4-nitrophenyl butyrate, PNP) 购自上海麦克林生化科技有限公司，Ni²⁺-NTA亲和纯化柱子、核酸及蛋白电泳所用试剂均购自生工生物工程(上海) 有限公司。

收集PDA培养基上生长的4个不同时期(PDA培养基上生长的菌丝、菌丝团渗出液体、开始形成黑色素、成熟的菌核阶段) 的核盘菌，以及菌丝侵染24 h的板蓝根叶片为样本，按照TaKaRa公司RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，1.5%琼脂糖凝胶检测RNA提取质量并用微量紫外分光光度计测定浓度。以提取的总RNA为模板，将其反转录为cDNA，以EF-F/EF-R为引物检测cDNA的质量，检测合格后以此为模板进行PCR及RT-PCR扩增。从核盘菌基因组数据库中共检索得到8个角质酶基因序列，采用同源克隆的方法设计PCR及RT-PCR引物(表 1)。以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR结合RT-PCR结果筛选出角质酶的主效基因，将主效基因进行胶回收，回收产物与pMD18-T simple vector连接并转化E. coli DH5α感受态细胞，挑选PCR鉴定为阳性的菌株送生工生物工程(上海) 有限公司进行测序。

将克隆得到的角质酶主效基因SsCut-52序列进行分析，使用ExPasy在线工具ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 预测SsCut-52的基本理化性质，使用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/) 预测蛋白质信号肽和亚细胞定位。将其氨基酸序列提交NCBI进行序列比对，利用MEGA软件邻接法(neighbor-joining method) 构建SsCut-52蛋白分子系统发育树。

预测信号肽切割位点，根据SsCut-52成熟肽cDNA片段设计引物，上游引物为5′-CGGAATTCGCGCCCATTACCACCGGACC-3′ (下划线为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物为5′-CCCTCGAGTTTAGCGGCAGCAACCACAA-3′ (下划线为XhoⅠ酶切位点)，以cDNA为模板进行目的基因的扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶回收，用EcoRⅠ和XhoⅠ分别将PCR产物和pET-28a(+) 质粒进行双酶切，分别回收酶切产物，二者经T4 DNA连接酶在25 ℃连接2 h后转化E. coli DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性菌株并将双酶切鉴定正确的菌株进行测序，将测序正确的重组质粒命名为pET-28a(+)-Cut52，并将测序正确的质粒转化至E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中，经PCR验证正确的重组细胞作为诱导菌株。

将导入pET-28a(+)-Cut52载体的E. coli BL21(DE3) 感受态细胞进行扩大培养，按照1︰100的体积比接入LB液体培养基(卡那霉素50 mg/mL) 中进行扩大培养，培养至OD₆₀₀为0.6–0.8时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)，至终浓度为0.4 mmol/L。28 ℃、220 r/min诱导表达，每隔1 h取1 mL样品，连续诱导5 h，将样品进行离心收集菌体，用100 μL磷酸盐缓冲液(PBS) 重悬菌体后加入20 μL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液沸水浴10 min，离心取上清进行SDS-PAGE胶检测其表达量。为了进一步纯化SsCut-52，将诱导所得菌液离心收集菌体，加入超声波破碎缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，pH 7.8) 进行重悬，混匀后超声破碎(开2 s/关3 s) 30 min，离心后向沉淀中加入8 mol/L的尿素溶解包涵体，4 ℃过夜溶解并收集上清液。

由于角质酶以包涵体形式存在，因此采用梯度透析法进行复性，将包涵体溶解上清液装入透析袋中，4 ℃条件下依次在不同浓度的透析缓冲液(6 mol，4 mol，2 mol，1 mol，1×PBS)中进行透析，每个梯度透析12 h以上，SDS-PAGE检测透析效果。为了得到纯化的SsCut-52，采用Ni-NTA亲和层析柱将透析后的蛋白液进行分离纯化，参照蛋白纯化试剂盒说明书进行操作。分别用10 mmol/L，100 mmol/L、500 mmol/L的咪唑洗脱液进行冲洗，用SDS-PAGE检测洗脱效果。将复性纯化的SsCut-52进行低温冷冻干燥，重组角质酶活性的测定参考Sooksai等^[17]的方法进行，酶活定义为每分钟催化对硝基苯丁酸酯水解生成1 μmol对硝基酚的酶量即为一个酶活单位。

在30 ℃条件下测定重组角质酶的活性，配制不同pH值0.1 mol/L的缓冲液[醋酸钠缓冲液(pH 3.0-6.0)、NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液(pH 6.0-8.0)、Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0) 和硼酸盐缓冲液(pH 9.0-11.0)]^[17]，并以该pH值的缓冲液配制0.1 mol/L的硝基苯丁酸酯作为底物，每个体系里面加入800 μL缓冲液、500 μL底物、100 μL Triton X-100、3 mg SsCut-52纯化蛋白，反应10 min后测重组酶水解底物的水平，每个pH值平行测定5次取平均值分析pH的稳定性。为测得不同温度(20–80 ℃) 对重组酶活性的影响，在pH 6.0条件下测定，反应体系同上，分析其热稳定性。

用灭菌牙签将板蓝根植株的真叶表面刺伤，分别接种核盘菌菌丝块，然后在菌丝块周边分别加入100 μL的PBS缓冲液和SsCut-52纯化复性蛋白液，保鲜膜包裹保湿，每个处理重复3次，置于光照培养箱中进行培养(25 ℃，12 h光照/12 h黑暗)，每日对其侵染情况进行观察并记录。

以PDA培养基上生长不同阶段的菌丝、菌核，以及核盘菌菌丝侵染48 h的板蓝根叶片为材料，从核盘菌基因组数据库中分析并成功克隆了8个角质酶基因，其条带单一且均已测序获得相关序列。为研究角质酶侵染植物过程中的主效基因，设计定量PCR引物进行qPCR检测，由图 1可明显地分析出XM_001585452在核盘菌侵染植物的时候高效表达，在核盘菌生长的4个不同阶段(S1–S4) 其表达量也高于其他角质酶基因，因此我们将其确定为主效基因并命名为SsCut-52。

图 1 RT-PCR分析核盘菌8个角质酶基因在不同阶段的表达量 Fig. 1 Analysis of the expression level of 8 cutinase genes of Sclerotinia sclerotiorum at different stages used RT-PCR. S1, S2, S3 and S4 represent the hyphae growing on PDA medium, liquid exudation, medanin begins to form and mature sclerotia, respectively. Infected indicates that Sclerotinia sclerotiorum hyphae-infected leaves of Banlangen for 48 h.

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经TA克隆获得的SsCut-52基因全长为768 bp，含一个开放阅读框(open reading frame, ORF)，编码255个氨基酸，将该序列提交到NCBI并获得序列号MZ611860。在线预测该蛋白质的分子量大小为25.74 kDa，理论等电点为4.57，N端信号肽为17个。将该cDNA及其编码的氨基酸序列在NCBI网站上进行Blast比对，采用neighbor-joining作进化树分析，结果表明，MZ611860和葡萄孢属Botrytis角质酶同源性最高，和蜡盘菌属Rutstroemia角质酶亲缘关系也较近，与小毛盘菌属Lachnellula、曲霉属Aspergillus、篮状菌属Talaromyces等亲缘关系较远(图 2)。

图 2 基于邻接法构建的角质酶氨基酸序列系统进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree of cutinases amino acid sequence constructed by neighbor-joining method.

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利用EcoRⅠ和XhoⅠ对重组子和pET28a(+)分别进行双酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定分别在5 300 bp和700 bp附近出现2条亮带，而空载则只在5 300 bp处出现条带。此外，重组质粒的测序结果与克隆序列完全一致，表明SsCut-52原核表达载体构建成功。将测序鉴定正确的重组质粒SsCut-52转化大肠杆菌BL21(DE3)，经0.4 mmol/L IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析，结果显示，融合蛋白经过28 ℃诱导后在25–30 kDa间出现蛋白条带，随着诱导时间的增加其表达量逐渐增大，其在诱导4 h后表达量最高(图 3)。

图 3 重组pET-28a(+)-Cut52载体转化BL21菌株诱导表达不同时间蛋白表达SDS-PAGE分析 Fig. 3 SDS-PAGE profile of proteins in strain BL21 transformed with the recombinant vector pET-28a(+)-Cut52. M: protein molecular weight standard; 1–6: total proteins of recombinant strain pET-28a(+)-Cut52 after induced for 5 hours; 7: strains harbouring pET-28a(+) after induced for 5 hours.

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诱导收集的大肠杆菌BL21(DE3) 菌液经超声波破碎，SDS-PAGE检测结果表明上清液中无蛋白条带(图 4，lane 1)，目的蛋白以包涵体形式存在(图 4，lane 2)，即该融合蛋白不可溶。用8 mol/L尿素对包涵体进行溶解，大部分目的蛋白可被溶解(图 4，lane 3)，经离心采用梯度透析法进行复性，复性后的蛋白溶液经Ni²⁺-NTA亲和层析柱进行分离纯化。用10 mmol/L和100 mmol/L的咪唑洗脱液不能将目的蛋白洗脱下来(图 4，lane 4和lane 5)，但当用500 mmol/L的咪唑洗脱液可以把目的蛋白完全洗脱(图 4，lane 6)。将复性纯化的SsCut-52进行低温冷冻干燥，1 mL纯化的蛋白液可获得0.03 g冻干粉。

图 4 重组蛋白SsCut-52的纯化分析 Fig. 4 Purification and analysis of recombinant SsCut-52. M: protein molecular weight standard; 1: crushing supernatant; 2: crushing precipitation; 3: dissolution of crushing precipitation using 8 mol/L urea; 4: sample from the eluted solution with 10 mmol/L imidazole; 5: sample from the eluted solution with 100 mmol/L imidazole; 6: sample from the eluted solution with 500 mmol/L imidazole.

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侵染结果表明，滴加PBS缓冲液的板蓝根叶片接种菌丝后产生的病斑面积明显比滴加纯化的SsCut-52叶片病斑面积小(图 5)，说明核盘菌的角质酶在病原菌侵染板蓝根叶片过程中具有一定的促进作用。

图 5 SsCut-52对于核盘菌菌丝侵染板蓝根叶片的影响 Fig. 5 Effects of SsCut-52 on the infection of Banlangen leaves by Sclerotinia sclerotiorum hyphae. (A, C) Infection status of 48 h and 72 h, respectively, after dropping refolding protein SS-Cut52. (B, D) Infection status of 48 h and 72 h, respectively, after dropping PBS buffer.

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由6图可以看出，SsCut-52在pH 3.0–10.0均表现出降解底物对硝基苯丁酸酯的活性，其在pH 6.0时活性最高，达到3.46 U/mg。当pH在4.0–5.0或者7.0–10.0时，其残余活性也可达到60%以上，但当pH为3.0或11.0时，SsCut-52活性迅速下降，残余活性分别降到11.7%和5.6% (图 6A)。SsCut-52在温度为20–30 ℃时活性最高，之后随着温度的上升蛋白活性逐渐下降，80 ℃其活性完全丧失，在温度为40–70 ℃范围内，其残余活性也由89%降到17% (图 6B)，表明SsCut-52不耐高温。

图 6 重组蛋白SsCut-52最适pH值(A) 及最适温度(B) 测定 Fig. 6 Determination of optimum pH (A) and temperature (B) of recombinant SsCut-52 protein.

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本文从核盘菌中克隆出了8个角质酶基因，并筛选出其主效基因SsCut-52，该基因在核盘菌侵染植物的时候高效表达，在核盘菌生长4个不同阶段(S1–S4) 的表达量也明显高于其他角质酶基因，表明核盘菌的角质酶也是被诱导表达的。植物病原真菌通过分泌少量的角质酶感受与寄主的接触，通过接触产生角质单体，从而诱导真菌产生更多的角质酶侵入寄主，角质酶通过与角质接触激活转录和表达^[18]，核盘菌菌丝接种植物叶片1 h内就可以检测到SsCUTA的转录表达^[19]，表明角质酶被诱导产生的过程非常迅速。从小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis获得的角质酶基因RcCUT1在侵染植物18–240 h之间都检测到了表达，但基因RcCUT6在整个侵染阶段都没有表达，RcCUT2–RcCUT5不同侵染时间点表达量有差异^[20]。我们检测核盘菌菌丝侵染板蓝根叶片24 h角质酶基因的表达，仅有SsCut-52高量表达，其他7个角质酶基因都微量表达，表明不同病原菌在侵染植物过程中角质酶的表达模式有差异。角质酶除了具有诱导酶的特性外还与植物致病性密切相关，吴群等^[21]用核盘菌角质酶SsCut粗蛋白和纯化蛋白浸润烟草叶片，可引起烟草叶片的过敏性坏死反应。李丹丹^[22]推测核盘菌角质酶SsCUT2可能通过诱发植物活性氧的迸发引起本氏烟草产生类似过敏性反应的细胞死亡，具有类似激发子的功能。本研究用SScut-52纯化复性蛋白液滴加到核盘菌菌丝块侵染的板蓝根叶片上，引起的病斑面积明显比对照组大，表明角质酶在菌丝侵染板蓝根叶片过程中具有一定的促进作用，这进一步说明核盘菌角质酶具有蛋白激发子的功能，与植物致病性有关。

本研究从核盘菌中筛选出的主效基因SsCut-52全长为768 bp，预测的蛋白质分子量大小为25.74 kDa，测得比活力为3.45 U/mg。从病原真菌中获得的角质酶其分子量在15–60 kDa，大部分角质酶都具有脂肪酶的功能，且作用于4-硝基苯丁酸酯(4-nitrophenyl butyrate, PNP) 的活性较高^[23-27]。将桃褐腐菌Monilinia fructicola的角质酶基因cut1连接到pET-28a载体上，诱导18 h后测得角质酶活性可达每100 μL 4 U^[26]。而嗜热放线菌Thermobifida fusca中克隆并表达的角质酶Tfu_0882和Tfu_0883纯化后的活性分别可达223.1 U/mg和458.2 U/mg^[28]。目前已报道的角质酶大都存在于破碎的上清里面，但本研究将重组质粒进行诱导后检测的重组蛋白以包涵体形式存在，因此采用稀释复性的方法对包涵体进行复性，后通过Ni-NTA柱纯化收集目的蛋白，最终获得具有活性的角质酶。本文虽在复性和纯化过程中会造成一部分角质酶活性的损失，但这也为角质酶原核表达包涵体蛋白的复性条件提供了参考方法。

本研究从核盘菌中获得的角质酶最适温度为20–30 ℃，在pH 4.0–10.0时活性均较高，并且可促进核盘菌菌丝侵染板蓝根叶片，这也与核盘菌的强侵染性及宿主广泛相关，在春季子囊孢子或菌丝侵染植物，适宜的温度给病原菌提供了适合大量繁殖的条件，也为角质酶发挥最大作用提供了可能性。前人报道的角质酶最适pH值在8.0–9.0范围内，而在pH值中性条件下(6.0–8.0) 酶活较低^{[16, 25, 29]}，SsCut-52在pH 6.0时活性最高，当pH在4.0–5.0或者7.0–10.0时其残余活性也可达到60%以上，这就表明SsCut-52在相当宽的pH值范围内都具有较高的活性，可为该酶的进一步开发利用提供参考依据。