杜鹃花是闻名于世的观赏花卉，素有“花中西施”之美称，是中国十大传统名花之一，但中国的杜鹃花资源研究和开发利用存在不足^[1]。‘云锦’杜鹃Rhododendron fortunei为杜鹃花科Ericaceae杜鹃花属Rhododendron植物，为中国特有的杜鹃属物种，是常绿杜鹃亚属的代表种之一，主要生长在海拔600–2 000 m的山脊阳处或林下^[2]。云锦杜鹃叶形大，花形美丽且清香，有较高的园艺观赏价值^[3]。杜鹃花属中具有香气的品种甚少，云锦杜鹃开发潜力巨大，具有良好的产业化前景。

植物香气物质由许多低分子量、易挥发的化合物组成，包括类异戊二烯、类苯丙酸和脂肪酸衍生物^[4]，是次生代谢的产物^[5-6]。近年来，本研究团队分析了云锦杜鹃花瓣中香气组成，发现云锦杜鹃特征香气成分主要是苯环型物质、萜烯类物质和醇类物质，其中苯环型物质相对含量最高，萜烯类物质种类最多，在所有特征香气成分中苯甲酸甲酯香气值最高^[7]，苯甲酸甲酯是由苯丙烷类代谢途径合成。

苯丙烷类代谢途径的第一步是芳香氨基酸苯丙氨酸(L-Phe) 在苯丙氨酸解氨酶(PAL) 的催化下脱氨形成肉桂酸，再由肉桂酸(Ca) 形成一系列有气味的挥发性化合物^[8]。PAL是苯丙烷类代谢途径的第一限速酶^[9]，是植物次生代谢研究最多的酶^[10]。现已成功地从白及、茶树、葡萄、洋葱和小麦等多种植物中分离克隆出PAL基因^[11-15]，其中Gonda等^[16]发现L-Phe在甜瓜果实中被PAL代谢为芳香物质，且外源L-Phe处理后其芳香挥发物的产生水平增加^[17]；Tasaki等^[18]也发现PAL参与松茸芳香物质的合成；在牵牛花中过表达PhPAL，与对照相比苯甲酸甲酯含量增加100倍^[19]；将PAL抑制剂应用于绣球花组织后，挥发性苯甲醛和苯甲酸甲酯的排放大幅减少^[20]。大多数植物香气化合物的生物合成过程非常复杂，是由多个酶在不同组织中共同完成^[21]，在不同的植物中作用机制也不完全相同。在目前对杜鹃的研究中，PAL对下游产生植物香气物质基因的调控机制尚未清晰。

本实验以云锦杜鹃为材料，首次克隆了云锦杜鹃PAL基因(RhPAL) 的cDNA序列，并对其进行生物信息学分析；运用实时荧光定量PCR技术分析云锦杜鹃不同组织在不同发育阶段RhPAL的表达规律，并利用酶联免疫反应法测定其酶活性；结合L-Phe和Ca的含量变化分析结果，以了解香气挥发物释放的发育节律和花香形成的基本生化过程。

云锦杜鹃采集于浙江省宁波市四明山国家森林公园。随机选取3株8年生长势较好的植株，从中挑选无机械损伤、无病虫害的杜鹃花及花瓣附近的叶片(新叶和老叶)。根据杜鹃花瓣张开的程度将杜鹃花的开花过程分为4个时期：花苞期，花瓣未张开；半开期，花瓣张开；盛开期，花瓣全部开放；衰败期，花瓣开始萎蔫，并将花瓣与花蕊(雄蕊和雌蕊) 分离(图 1)。处理好的样品放入液氮速冻后，置于–80 ℃超低温冰箱保存，用于后续基因克隆和表达分析。

图 1 云锦杜鹃不同花期花瓣及其他组织的形态 Fig. 1 The characteristics of petals and other tissues of Rhododendron fortunei in different flowering stages.

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用液氮研磨保存的杜鹃花花瓣样品，总RNA的提取过程参照Rnaprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书(TIANGEN，China)。按照(NovoScript Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)第一链合成试剂盒(Novoprotein，China) 说明书合成第一链cDNA。根据试剂盒SMARTer^Ⓡ RACE 5′/3′Kit (TaKaRa，China) 说明书，以杜鹃总RNA为模板，分别合成3′RACE和5′RACE cDNA。

通过对GenBank中茶树(KY865305.1)、芒果(KF929403.1)、当归(KP257432.1) 和长春花(AB042520.1) 等植物PAL基因完整CDS序列进行同源比对，找出高度保守区段，利用Primer 6.0软件设计一对简并引物(表 1: F1，R1)，进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后连接至pMD18-T载体(TaKaRa，China)，转化DH5α感受态细胞(Novoprotein，China)。筛选阳性克隆，经菌液PCR鉴定后选取2–4个阳性克隆送至北京擎科生物科技有限公司测序验证。

根据测序得到的云锦杜鹃PAL基因保守区片段设计3′ RACE引物和5′ RACE引物(表 1: F2，R2)。分别进行PCR扩增，回收产物连接至pEASY-Blunt zero Cloning Kit (北京全式金生物技术有限公司)，转化DH5α感受态细胞。经阳性筛选及菌液PCR鉴定后选取2–4个阳性克隆送至北京擎科生物科技有限公司测序验证，得到云锦杜鹃PAL基因3′ RACE序列和5′ RACE序列。测序结果应用DNAMAN软件和NCBI在线工具Blast对RhPAL与其他物种PAL基因进行同源比对分析。

采用ORF finder查询ORF并预测RhPAL氨基酸序列；采用DNAMAN软件进行同源蛋白质序列比对；采用MEGA6.0软件构建系统进化树；采用SOPMA软件分析蛋白质序列的二级结构；采用Expasy ProtParam和ProtScale预测蛋白质的理化性质和疏水性/亲水性；采用NetPhos分析蛋白质的磷酸化位点；采用Swiss-Model预测蛋白质的三级结构；采用NCBI网站中Conserved domains Research软件对云锦杜鹃PAL蛋白进行结构域预测。

分别提取云锦杜鹃不同组织在不同发育阶段的总RNA，反转录合成cDNA第一链，以此为模板进行qRT-PCR扩增，每个样品设置3次生物学重复。根据RhPAL的CDS区应用Primer 6.0软件设计qRT-PCR正向引物和qRT-PCR反向引物(表 1: F3，R3)，参考TransStart Tip Green qPCR SuperMixS说明书(北京全式金生物技术有限公司) 进行qPT-PCR扩增，样本和内参分别设3个重复。

取云锦杜鹃不同组织在不同发育阶段的样品于液氮中研磨，称取0.1 g研磨后样品，加入1 mL PBS (pH 7.4) 缓冲液，进行3个生物学平行。4 ℃、8 000 r/min离心30 min，取上清液为粗酶液，于4 ℃保存。按照植物酶联免疫试剂盒(上海科兴生物科技有限公司)说明书进行PAL酶活性测定。

取云锦杜鹃不同组织在不同发育阶段的样品于液氮中研磨，称取0.1 g研磨后样品，加入1 mL甲醇(色谱纯) 溶液，涡旋混匀后置于冰浴中超声破碎15 min。将破碎后的组织匀浆在4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上层液体进行旋转蒸发有机溶剂，最后取得样品于45 μm过滤器中过滤后进行测定，每个样品进行3个生物学平行。

云锦杜鹃花瓣中总RNA凝胶成像呈清晰完整的28S rRNA和18S rRNA条带(图 2A)。NanoDrop法测得核酸浓度A₂₆₀/A₂₈₀为1.97，A₂₆₀/A₂₃₀为2.03，说明提取的总RNA纯度较高。

图 2 云锦杜鹃PAL基因PCR扩增 Fig. 2 PCR amplification of PAL gene from Rh. fortunei.

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采用RT-PCR方法和RACE方法扩增RhPAL全长cDNA，先通过RT-PCR克隆云锦杜鹃RhPAL基因保守区得到长度1 191 bp的片段。根据测序结果分别设计3′ RACE与5′ RACE引物，经PCR扩增后将纯化产物连接转化至大肠杆菌中。将3段测序结果拼接得到长2 700 bp的RhPAL，拼接所得的RhPAL包含一个ATG起始密码子和TAG终止密码子，以及28 bp的polyA尾，使用特异性引物(表 1: F4，R4) 进行PCR扩增，得到2 175 bp的PCR产物，与拼接所得序列一致。ORF阅读框全长2 145 bp (图 2B)，编码715个氨基酸，GenBank登录号为MW735988。使用DNAMAN软件将云锦杜鹃PAL蛋白质序列和白梨(NP001306736.1)、山茶(ASU87404.1)、绚丽(AFG30054.1)、淫羊藿(AFU90757.1)、中国李(AFP24940.1) 的PAL蛋白质序列进行多重比较，相似度达90.0% (图 3)。根据比较结果，应用MEGA 7.0软件，选择18种植物PAL氨基酸序列构建系统进化树，发现云锦杜鹃PAL蛋白与其他物种PAL蛋白有较高的保守性(图 4)，其中云锦杜鹃PAL蛋白与猕猴桃、山茶亲缘关系最近。

图 3 云锦杜鹃与其他植物PAL氨基酸序列的多重比较 Fig. 3 Multiple alignment of deduced amino acids sequences of PAL from Rh. fortunei and other plants.

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图 4 云锦杜鹃PAL与其他物种PAL蛋白质的系统进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of PALs from Rh. fortunei and other species.

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通过Expasy网站中的ProtParam软件预测RhPAL编码的蛋白质序列的基本理化性质，云锦杜鹃PAL蛋白的分子量为77.58 kDa；理论等电点为6.03，该蛋白为酸性蛋白；总的负电荷残基(天冬氨酸+谷氨酸) 为84；总的正电荷残基(精氨酸+赖氨酸) 为74；亲水性平均值为–0.138，表明为亲水性蛋白；不稳定系数为35.95，是不稳定蛋白。

利用NetPhos3.0推测云锦杜鹃PAL蛋白质的磷酸化位点(图 5)，在多肽链上存在49个磷酸化位点，其中丝氨酸(Ser) 48个、苏氨酸(Thr) 36个、酪氨酸(Tyr) 13个。

图 5 云锦杜鹃PAL蛋白质氨基酸翻译后磷酸化修饰预测 Fig. 5 Prediction of the post-translational phosphorylation sites of PAL in Rh. fortunei.

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利用SOPMA对RhPAL编码蛋白质进行二级结构预测，该蛋白的二级结构含有α-螺旋，β-转角、延伸链和无规则卷曲，其占比分别为56.70%、5.87%、7.96%和29.47%，表明云锦杜鹃PAL蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲结构组成。运用SWISS-MODEL工具对云锦杜鹃PAL编码蛋白进行三级结构预测，在蛋白质数据库中选择与云锦杜鹃PAL蛋白序列一致性较高的蛋白为模板进行同源模建，得到云锦杜鹃PAL蛋白结构模型。与二级结构预测相符，含有大量α-螺旋和不规则卷曲。

通过NCBI网站中Conserved domains search软件对云锦杜鹃PAL蛋白进行结构域预测，第11-714氨基酸的位置处含有一个甲基转移酶基因家族特有的PLN02457保守结构域，属于Lyase_I_Like超家族；此外，云锦杜鹃PAL蛋白具有保守的酶活性中心序列，与拟南芥、葡萄、茉莉和烟草等植物的酶活性中心序列一致，包含高度保守的Ala-Ser-Gly氨基酸三联体，其位于苯丙氨酸/组氨酸解氨酶的活性中心^[22]。ASG氨基酸三联体可以通过自身环化脱水而自动转化为3, 5-二氢-5-亚甲基-4H-咪唑-4-酮(MIO) 辅基(3, 5-dihydro-5-methyliden-4H- imidazol4-one, MIO) 作为PAL的重要辅助因子发挥作用^[23]，进一步说明云锦杜鹃PAL蛋白属于PAL家族。

利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 技术，以杜鹃EF1α (DUH018457.1) 作为内参基因，得到RhPAL在云锦杜鹃不同组织在不同发育阶段的相对表达水平(图 6)。结果表明，RhPAL在云锦杜鹃的花瓣、花蕊和叶片中均有表达，但表达量存在明显差异。RhPAL在云锦杜鹃花瓣不同发育阶段中表达量呈上升趋势，花苞期最低，衰败期最高，衰败期RhPAL的表达量约为花苞期的10倍；RhPAL在云锦杜鹃叶片不同发育阶段表达量呈下降趋势，新叶中表达量较高，且约为老叶的2倍；RhPAL在云锦杜鹃花蕊中雌蕊表达量较高，在雄蕊中较低，盛开期雌蕊RhPAL的表达量为雄蕊的3倍；在云锦杜鹃不同组织中，新叶RhPAL的表达量最高，与盛开期雌蕊表达量相近，约为盛开期花瓣和盛开期雌蕊的3倍。

图 6 云锦杜鹃不同花期的花瓣及其他组织的RhPAL表达量分析 Fig. 6 Expression analysis of RhPAL content in petals and other tissues of Rh. fortunei at different flowering stages. Different lowercase letters indicate significant differences (P≤0.05).

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应用Elisa试剂盒法，分析云锦杜鹃不同组织在不同发育阶段中PAL酶活性时空变化(图 7)。云锦杜鹃不同组织中PAL酶活性变化与RhPAL表达趋势并不相同。PAL酶活性在云锦杜鹃花瓣不同发育阶段中酶活性呈明显下降趋势，花苞期最高衰败期最低，花苞期PAL酶活性约为衰败期的1.5倍；PAL酶活性在云锦杜鹃叶片不同发育阶段呈下降趋势，新叶中酶活性较高，且约为老叶的2倍；PAL酶活性在云锦杜鹃花蕊中雌蕊酶活性较高，在雄蕊中较低，盛开期雌蕊PAL酶活性为雄蕊的1.2倍；在云锦杜鹃不同组织中，花苞期花瓣PAL酶活性最高，约为新叶的2倍，约为盛开期雄蕊的1.5倍。

图 7 云锦杜鹃不同花期的花瓣及其他组织PAL蛋白酶活性 Fig. 7 The activities of PAL in petals and other tissues of Rh. fortunei at different flowering stages. Different lowercase letters indicate significant differences (P≤0.05).

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根据LC-MS分析结果，在云锦杜鹃4个花期的花瓣中，L-Phe含量呈现升高的变化趋势(图 8A)，与RhPAL的表达水平变化趋势相一致，花苞期含量最低衰败期最高，衰败期L-Phe含量约为花苞期的2倍；在盛开期的花蕊中，雄蕊的L-Phe含量略低于雌蕊；L-Phe在云锦杜鹃叶片不同发育阶段表达量呈下降趋势，新叶中含量较高，且约为老叶的4倍。在云锦杜鹃4个花期的花瓣中，Ca含量的变化趋势与L-Phe相同(图 8B)，花苞期含量最低衰败期最高，衰败期Ca含量约为花苞期的2倍；在盛开期的花蕊中，雄蕊的Ca含量低于雌蕊，雌蕊中的含量约为雄蕊的3倍；新叶中Ca的含量略高于老叶。

图 8 云锦杜鹃不同花期花瓣及其他组织l-Phe和Ca含量 Fig. 8 L-Phe (A) and Ca (B) content in petals and other tissues of Rh. fortunei at different flowering stages. Different lowercase letters indicate significant differences (P≤0.05).

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运用SPSS软件分析云锦杜鹃不同花期的花瓣及其他组织中RhPAL基因表达水平和L-Phe、Ca含量之间的相关性，发现RhPAL基因表达水平和L-Phe含量的相关关系系数为0.701**，与Ca含量相关关系系数为0.624*。表明RhPAL与L-Phe、Ca的合成分解密切相关，推测RhPAL参与了L-Phe的代谢分解与Ca的生物合成。

为了了解云锦杜鹃挥发性香气物质释放的分子机制，有必要对控制挥发性香气物质产生的酶和基因进行鉴定。由于云锦杜鹃花中的香气挥发物主要是苯甲酸甲酯，我们决定研究苯类化合物合成途径中代表性酶PAL的酶活性及其转录水平。本研究克隆得到的PAL基因为首次从云锦杜鹃中获得的全cDNA序列，并对RhPAL基因编码的单个蛋白进行一系列生物信息学分析，发现云锦杜鹃PAL蛋白与同为双子叶植物纲的猕猴桃、山茶亲缘关系最近，在保持物种特异性的同时可能还具有类似的生物学功能。

PAL在植物不同组织中的表达具有组织特异性，也受发育的调控；在亚细胞水平上，PAL定位于细胞质和一些膜细胞器如叶绿体、白色体和线粒体等^[24]。侯鹏等^[25]发现大豆PAL基因家族相对表达量最高的部位是叶片，在花中其表达水平较低；乔枫等^[26]在研究枸杞中PAL基因的表达特性时也发现枸杞PAL基因在叶片中表达量最高，其次在花，且随枸杞生长表达量增加。与RhPAL在不同组织中表达量模式相同，推测从早期幼苗到完全生长的成年植物中，PAL在叶和花序茎的维管组织中高表达，但在年轻幼嫩的组织如根尖或茎顶端分生组织中不活跃^[27]。Shang等^[28]发现PAL酶活性在黄瓜雌花和雄花中高于果等部位；玫瑰花瓣是玫瑰香气的主要来源，在释放香气物质的过程中雄蕊也被发现有较大的贡献^[29]，推测云锦杜鹃花蕊也有类似功能。通过对云锦杜鹃PAL酶活性的时空表达分析，发现在花苞中酶活性最高。Bera等^[30]在研究茉莉花香气挥发物的酶促反应时发现，随着茉莉花朵发育，茉莉花瓣中PAL基因表达量逐渐增加，PAL酶活性减弱，与RhPAL在不同开放阶段花瓣中的表达模式和酶活性变化相似，推测为将挥发物更好地挥发到空气中，香气物质几乎都在花瓣和其他花器官的表皮细胞中合成^[31]。通过对云锦杜鹃不同组织中酶活性的测定发现，云锦杜鹃中RhPAL的表达量变化趋势与酶活性变化趋势相反，可以认为酶活性呈下降趋势是器官衰老导致的。考虑到PAL为限速酶，推测叶片中RhPAL表达可能有增强PAL酶活性的作用，叶片中叶绿体发达，可能是苯丙氨酸代谢的重要场所，RhPAL的表达也影响叶片中木质素的累积。

云锦杜鹃作为杜鹃中有香品种，因其带有怡人的清香而备受青睐。该基因的成功克隆为深入研究云锦杜鹃PAL基因生物学功能奠定基础。本研究克隆出云锦杜鹃PAL基因，可以进一步确定其上游启动子的序列和功能，通过转录因子调控目标基因在时间和空间上的特定表达，测定花香化合物的组成与含量，完成RhPAL基因对于云锦杜鹃花香气物质调控机制的探索。此外，本研究在云锦杜鹃中只克隆得到1个PAL基因，在杜鹃花中是否存在PAL家族基因，仍需进一步研究。今后可进一步分析杜鹃花花香合成途径中关键基因的表达模式，为探明杜鹃花PAL基因调控苯甲酸甲酯生物合成的机制提供证据。