2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 倪子鑫, 武清扬, 杨云, 邓慧莉, 周子维, 赖钟雄, 孙云
- NI Zixin, WU Qingyang, YANG Yun, DENG Huili, ZHOU Ziwei, LAI Zhongxiong, SUN Yun
- 茶树CsCCD基因家族全基因组鉴定及乌龙茶LED补光晾青下表达分析
- Genome-wide identification of CsCCD gene family in tea plant (Camellia sinensis) and expression analysis of the oolong tea processing with supplementary LED light
- 生物工程学报, 2022, 38(1): 359-373
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(1): 359-373
- 10.13345/j.cjb.210455
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文章历史
- Received: June 17, 2021
- Accepted: September 2, 2021
- Published: September 9, 2021
引用本文
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2. 福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002
2. Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China
茶树Camellia sinensis是一种多年生常绿经济作物，在世界各地广泛种植。其鲜叶经过一系列加工工艺而制成可供饮用的茶，是世界三大饮料之一，具有多种保健功效。如何提升茶叶品质一直是研究者关注的热点，大量研究显示，对鲜叶采后传统加工环节进行优化处理可使茶叶香气、滋味品质得到提升[1-3]，因此，探讨加工环节优化创新方法及研究其对茶叶品质提升的内在机理具有重要意义。
类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD) 是一类含有能结合Fe2+的RPE 65 (retinal pigment epithelium 65 kDa protein) 结构域的非血红素铁酶[4]，Schwartz等[5]于1997年首次报道玉米Viviparous14 (VP14) 能催化9-顺式-紫黄质在11'12'双键位置断裂生成脱落酸。拟南芥中有9条基因与VP14高度相似，其中5条与脱落酸合成相关的基因被命名为NCED (9-顺式-环氧化-类胡萝卜素双加氧酶)，分别为NCED2、NCED3、NCED5、NCED6和NCED9；其余4条类胡萝卜素裂解双加氧酶被命名为CCD1、CCD4、CCD7和CCD8[6]。CCD1、CCD4与降异戊二烯香气物质的形成相关，能在特定的位点裂解氧化类胡萝卜素而生成一系列水溶性低阈值的香气物质，其中具代表性的β-紫罗酮阈值仅有0.12 ng/L[7]，带有木质及紫罗兰香气；β-大马烯酮带有玫瑰花香，是葡萄酒、茶叶中重要的赋香物质[8]，也对花卉、蔬菜和水果等香气品质形成具有重要贡献[9-10]；CCD7、CCD8与独脚金内酯的生成有关，能调节植物生长发育[11-12]。CCD基因家族成员广泛存在于园艺植物中，且已在多个物种中得到鉴定，如柑橘(Citrus clementina) 14个[13]，苹果(Malus domestica) 21个[14]，番茄(Solanum lycopersicum) 7个[15]，葡萄(Vitis vinifera) 19个[16]，油菜(Brassica napus L.) 30个[17]，CCD基因家族成员命名方式取决于其与拟南芥基因的同源性[18-19]。
研究表明，CCD基因家族成员启动子区域含光照响应元件，而LED光作为节能环保的冷光源运用于茶叶生产中能使茶叶品质得到不同程度的改善[20-21]。目前尚未见对茶树CsCCD基因家族成员鉴定及乌龙茶晾青过程光照对CsCCD基因表达量影响的报道，本研究通过对茶树CsCCD基因家族成员全基因组鉴定及表达量分析，探寻茶树鲜叶不同叶位及乌龙茶加工过程中光照处理下的表达情况，为进一步了解茶树CsCCD基因家族功能及优化加工工艺方法并提升茶叶品质奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料以‘铁观音’一芽三叶鲜叶为试验材料，按闽南乌龙茶加工工艺，室内萎凋至顶二叶垂软后置于竹制摇青桶(长60 cm，直径35 cm) 中，采取“看青做青”的加工方式，晾青过程设置LED光照射/黑暗两个处理，其中LED采用白光光强(380±15) μmol/(m2·s)，每次晾青后取样。环境温度25 ℃，湿度65%，取样进行3次重复，用液氮速冻后放于–80 ℃冰箱中保存。
1.2 茶树CsCCD基因家族成员的鉴定茶树基因组和蛋白组序列下载自茶树基因组学与生物信息学平台(TPIA: http://tpia.teaplant.org/)，从Pfam数据库(https://pfam.xfam.org) 下载CCD蛋白特征结构域RPE 65 (PF03055) 的隐马尔可夫模型，并利用HMMER软件(V3.0) hmmsearch筛选出茶树数据库中目标蛋白序列信息(E < 0.01)，获得茶树CsCCD基因家族候选成员。从拟南芥数据库中(https://www.arabidopsis.org/) 下载拟南芥9个CCD家族成员蛋白序列信息[22]，与下载的茶树数据库本地Blast同源比对，筛选长度 > 100 aa且identity > 50%的茶树CsCCD家族候选成员。保留上述两步鉴定出的共有茶树CsCCD基因家族候选成员结果，将序列信息提交到SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)，验证其含有RPE65结构域，得到CsCCD基因家族成员。
1.3 茶树CsCCD家族蛋白理化性质分析采用在线工具Expasy (http://web.expasy.org/compute_pi/) 预测CsCCD家族成员的氨基酸个数、等电点、分子质量、不稳定系数与亲水性指数等蛋白理化性质，利用在线工具WOLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/) 预测亚细胞定位。
1.4 CCD家族系统发育进化树构建使用MEGA7.0软件ClustalW功能对茶树、拟南芥、水稻[23]、葡萄[24]、苹果[14]、番茄[15]共6个物种CCD基因家族氨基酸序列进行多序列比对，采用最大似然法(maximum likelihood method) JTT+G模型构建系统发育进化树，校验参数Bootstrap值设置为1 000[25-27]，采用在线工具iTOL (https://itol.embl.de/) 对进化树进行美化[28]。
1.5 茶树CsCCD基因家族基因结构及蛋白质保守基序(Motif) 分析利用茶树基因组gff3格式文件及氨基酸序列信息，对茶树CsCCD家族成员进行基因结构分析，使用在线工具MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) 对其保守基序进行分析，预测值设置为12个，最后采用TBtools[29]的Gene structure view (advanced) 功能对获得的基因结构及内含子外显子分布、保守基序信息进行可视化绘图。
1.6 茶树CsCCD基因家族染色体定位与进化树构建利用茶树基因组gff3格式文件中CsCCD家族成员在染色体上的分布信息，使用TBtools软件Gene visualize from GTF/GFF功能进行可视化绘图。
1.7 茶树CsCCD基因家族启动子顺式作用元件分析采用TBtools软件提取茶树CsCCD基因家族成员基因启动子序列(起始密码子ATG上游2 000 bp)，采用PlantCARE在线软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 对启动子顺式作用元件进行分析，根据结果文件自身功能注释及相关文献报道[30-32]整理各顺式作用元件功能，并采用Excel软件分类整理统计绘制柱状图，使用TBtools软件绘制热图。
1.8 茶树CsCCD家族蛋白互作预测分析利用在线工具String (https://string-db.org) 对CsCCD家族成员进行蛋白互作预测，选用拟南芥CCD家族作为参考，其他参数采用默认设定值。
1.9 茶树CsCCD基因家族成员基因表达分析采用RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司) 提取茶树叶片RNA，利用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司) 将RNA逆转录为cDNA。RT-qPCR选用20 μL体系，其中HieffⓇqPCR SYBRⓇGreen Master Mix (No Rox)荧光染料(上海翊圣生物科技有限公司) 10 μL，ddH2O 7.4 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL。选用DNAMAN软件设计基因上下游引物(表 1)，内参基因参照Zhou等[33]研究结果，选用CsGADPH与CsTBP，其中CsGADPH作为不同叶位鲜叶的内参基因，CsTBP作为加工过程中在制叶片的内参基因。采用罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR仪测定基因相对表达量，每个处理设置3个技术重复。使用2-△△Ct方法[34]计算茶树CCD基因相对表达量水平，SPSS 18.0软件分析显著性差异水平(P < 0.05)，并用GraphPad Prism v8.0作图。
| Gene names | Forward primers (5′→3′) | Reverse primers (5′→3′) |
| CsCCD1a | ACTTCACAGCCTCACCACT | TGACAAACTCACCATTCAGG |
| CsCCD1b | ACTTGCCGCCTTGAGAA | GCTGATAGTTTCCTCTGTGATG |
| CsCCD4 | CGTGTCAGTATCAGAAGGCG | TCGGGATTGTTAGGGTCCT |
| CsCCD7a | GCAAAAATATCCCGAGCCAT | TGAGATAATAGGTCCCGCAC |
| CsCCD7b | ATACTAGTGTGTTGGGGTGG | CCTATGGTGTCCAAACTCCT |
| CsCCD8 | CGTGCGGGACCTATTATCT | CAACCATCTTTCCACCTTTC |
| CsNCED3a | CGGACATTGAAATCCCAC | CCCAAGCATTCCAAAGA |
| CsNCED3b | GCTAAGCCCAAACCCTCTA | GCAAGTCGGGATAGTAACG |
| CsNCED3c | GAAATCCCACTCTCAGAACC | TCTTCCCAAGCATTCCAG |
| CsNCED6a | CGAGTATTGGTTTGGTGGA | TGACTTATTCCCGCACG |
| CsNCED6b | ATCGCTCATCCTAAGGTGG | GAATCATAGTCGGCTGGTG |
| CsGADPH | TTGGCATCGTTGAGGGTCT | CAGTGGGAACACGGAAAGC |
| CsTBP | GGCGGATCAAGTGTTGGAAGGGAG | ACGCTTGGGATTGTATTCGGCATTA |
在茶树中共筛选出11个CsCCD基因家族成员，并根据拟南芥中同源基因命名，同一亚族基因按小写字母排序(表 2)。CsCCD家族成员氨基酸个数在192–643 aa之间，平均值为519 aa；分子质量为21 208.91–71 755.57 Da，平均值为57 643.35 Da，等电点位于4.84–9.41之间，大部分呈酸性；共有5个成员蛋白质不稳定系数 < 40，为稳定蛋白，其中CsCCD1、CsCCD8、CsNCED6亚族所有成员为稳定蛋白；亲水指数均 < 0，说明CsCCD家族成员均为亲水性蛋白；亚细胞定位预测结果显示，大多数CsCCD家族成员定位在叶绿体中，也有少数成员定位在细胞骨架、过氧化酶体和细胞质中。
| Gene name | Gene ID | Annotated members in Arabidopsis thaliana | Number of amino acids | PI | Molecular weight | Instability index | Hydropathicity Index | Subcellular localization |
| CsCCD1a | CSS0012422.1 | AtCCD1 | 479 | 5.80 | 54 013.07 | 28.75 | –0.265 | Cytoskeleton |
| CsCCD1b | CSS0036960.1 | AtCCD1 | 192 | 4.84 | 21 208.91 | 25.10 | –0.394 | Cytoskeleton |
| CsCCD4 | CSS0017602.1 | AtCCD4 | 613 | 5.99 | 66 721.94 | 42.01 | –0.177 | Chloroplast |
| CsCCD7a | CSS0033793.1 | AtCCD7 | 643 | 6.00 | 71 755.57 | 41.04 | –0.272 | Peroxisome |
| CsCCD7b | CSS0041110.1 | AtCCD7 | 643 | 6.08 | 71 740.56 | 40.77 | –0.281 | Chloroplast |
| CsCCD8 | CSS0030796.1 | AtCCD8 | 557 | 7.01 | 61 872.75 | 30.94 | –0.284 | Chloroplast |
| CsNCED3a | CSS0015210.1 | AtNCED3 | 606 | 5.78 | 66 712.74 | 42.10 | –0.268 | Chloroplast |
| CsNCED3b | CSS0021789.1 | AtNCED3 | 606 | 6.27 | 67 647.85 | 44.23 | –0.329 | Chloroplast |
| CsNCED3c | CSS0033791.1 | AtNCED3 | 604 | 6.50 | 66 709.66 | 42.18 | –0.312 | Chloroplast |
| CsNCED6a | CSS0041843.1 | AtNCED6 | 383 | 9.41 | 42 998.55 | 30.92 | –0.354 | Chloroplast |
| CsNCED6b | CSS0044321.1 | AtNCED6 | 383 | 9.11 | 42 695.24 | 32.77 | –0.297 | Cytosol |
了解内含子相位差异有助于预测外显子是否可能作为可变剪切的目标，更好地探究各成员的生物学功能。茶树CsCCD基因家族成员进行基因结构分析结果显示(图 1)，各个成员间外显子个数及基因长度差异较大，其中CsCCD1a含有11个外显子，10个内含子；CsCCD7a、CsCCD7b含有8个外显子，7个内含子；CsCCD1b、CsCCD8含有6个外显子，5个内含子；CsCCD4、CsNCED6a、CsNCED6b含有3个外显子，2个内含子；CsNCED3亚族所有成员含1个外显子，无内含子。内含子相位(intron phase) 表示内含子位于密码子不同碱基后的位置情况，CsCCD1a存在phase 0、phase 1和phase 2，CsCCD4存在phase 0、phase1，其余含有内含子的家族成员内含子相位均为phase 0。
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| 图 1 茶树CsCCD基因家族成员基因结构与保守基序分布 Fig. 1 Genetic structure and conserved motifs of CsCCD gene family members. |
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通过在线工具MEME分析CsCCD家族蛋白保守基序，CCD1亚族成员共有motif 5、motif 12，CCD7亚族成员共有motif 9、motif 2、motif 6、motif 5、motif 12与motif 10；CCD8亚族成员含有motif 2、motif 10、motif 5与motif 12；CCD4与NCED3亚族所有成员保守基序一致，均含有motif 8、motif 1、motif 4、motif 9、motif 3、motif 11、motif 2、motif 7、motif 5、motif 12与motif10；NCED6亚族成员均含motif 8、motif 1、motif 4、motif 3、motif 11、motif 2与motif 12。CsCCD所有成员所共有的保守基序为motif 12，同一亚族成员间序列相对保守。
2.3 茶树CsCCD基因家族染色体定位分析茶树CsCCD基因家族染色体定位分析结果显示(图 2)，11个家族成员中有10个成员能精确定位在15条茶树基因组的3、5、6、7、8、9、12、14号染色体上，其中CsCCD7亚族所有成员分布在3号染色体上，CsCCD1亚族所有成员分布在6号染色体上。
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| 图 2 茶树CsCCD基因家族染色体定位分析 Fig. 2 Chromosome locations of CsCCD gene family members. |
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利用在线工具String对茶树CsCCD家族成员蛋白互作网络进行预测，以拟南芥蛋白数据库为参考共比对到6个家族成员(图 3)，节点蛋白之间不同颜色的连线代表不同的互作预测方法，包括蛋白同源、基因共现、共表达、数据库数据与文本数据挖掘。互作分值由不同预测方法综合得出，默认以0.4作为存在蛋白互作的筛选条件，其中CCD7与其他5个家族成员间均存在互作，CCD8与CCD7、CCD1、CCD4 (图中预测名为NCED4) 存在互作，NCED3、NCED6只与CCD7存在互作。与NCED亚族成员相比，CCD亚族成员间互作关系较强；整体上看，比对到的所有CCD家族成员构成一个互作网络，且互作类型较多，推测该家族成员蛋白可能在行使功能方面关联性较强。
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| 图 3 茶树CsCCD家族成员蛋白互作网络预测 Fig. 3 Predication of the interactions among CsCCD gene family members. |
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分析启动子顺式作用元件可以了解调控基因表达的诱导因素，更全面地了解基因功能。利用在线网站PlantCARE对茶树CsCCD基因家族成员基因翻译起始位点上游2 000 bp启动子顺式作用元件进行分析，结果显示，茶树CsCCD基因家族成员含有核心启动子元件(TATA-box、CAAT-box)，生长发育相关元件(CAT-Box、CCGTCC-box、circadian、HD-Zip 1)，结合位点相关元件(AT-rich element、Box Ⅲ、CCAAT-box、MBS、MYB-bindng site) 等多种功能启动子顺式作用元件，选择类胡萝卜素降解途径及茶叶加工过程密切相关的激素响应、胁迫响应、光响应等顺式作用元件进行分析(图 4)。
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| 图 4 茶树CsCCD基因家族成员启动子顺式作用元件分布 Fig. 4 Distribution of cis-acting regulatory elements of CsCCD gene family members. |
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CsCCD基因家族启动子序列包含大量胁迫响应、激素响应和光响应相关顺式作用元件，胁迫响应元件78个，激素响应元件104个，光响应元件142个，多因子响应元件91个，共计415个。胁迫响应元件中热诱导型元件STRE与厌氧诱导型元件ARE数量较多，共占51.3%。激素响应元件中，脱落酸响应元件ABRE占比最大，存在于所有家族成员中，共30个，在CsCCD4、CsNCED3a中发现较多；此外也有乙烯响应元件ERE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif、生长素响应元件TGA-element、AuxRR-core和水杨酸响应元件TCA-element。光响应元件的元件种类、数量最多，主要有Box4、G-box、GATA-motif、I-box、ATCT-motif、TCT-motif、ATC-motif、GT1-motif等，所有成员均含有box4、G-box。CsCCD4含有光响应元件数量最多(22个)，其他亚族成员含有9–16个光响应元件不等。多因子响应元件MYB、MYB-like sequence、MYC具有响应逆境胁迫、激素应答的功能，所有成员均含MYC。以上结果表明，CsCCD基因家族的表达可能响应多种逆境胁迫，受多种激素调控，推测光照在其表达调控过程可能扮演重要角色。
2.6 植物CCD家族系统进化树的构建及分析为了解茶树与其他物种之间CCD家族的进化关系，对茶树Camellia sinensis 11个、拟南芥Arabidopsis thaliana 9个、葡萄Vitis vinifera 8个、水稻Oryza sativa 10个、苹果Malus domestica 17个、番茄Solanum lycopersicum 6个共计61个CCD基因家族成员氨基酸序列进行系统发育树构建，结果(图 5) 显示，CCD家族可分为5个亚族，分别为CCD1、CCD4、CCD7、CCD8与NCED亚族，其中CCD8亚族、CCD7亚族各呈一支，与其他亚族成员间进化关系较远；而CCD1、CCD4、NCED亚族之间聚类在同一分支中，进化关系较近。同一亚族中，茶树CsCCD家族在进化树中与葡萄、苹果、番茄的亲缘关系距离更近；而水稻大多单呈一支，与其他物种进化关系较远，表明CCD家族在双子叶植物间亲缘关系较单子叶植物更近。
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| 图 5 茶树、拟南芥、葡萄、水稻、苹果、番茄CCD蛋白系统发育进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree of CCD in Camellia sinensis, Arabidopsis thaliana, Vitis vinifera, Oryza sativa, Malus domestica and Solanum lycopersicum. |
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为了解茶树CsCCD基因家族在不同叶位的表达量差异情况，采用RT-qPCR对其基因表达量进行相对定量检测，结果显示(图 6)，CsCCD1亚族在第2、3叶表达量显著高于第1叶及嫩茎，CsCCD4亚族表达量趋势与CCD1亚族一致，叶片成熟度越高，其表达量越高，第3叶表达量是第1叶6倍以上；CsCCD7亚族2个成员间表达模式不同，不同叶位间差异规律不明显；CsCCD8在嫩茎中表达量显著低于叶片；CsNCED3a与CsNCED3b总体表达趋势一致，第1、2叶表达量显著高于第3叶及嫩茎，而CsNCED3c在嫩茎中表达量显著高于叶片；CsNCED6亚族成员在幼嫩叶片中表达量较成熟叶及嫩茎中高。
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| 图 6 茶树CsCCD基因家族成员在不同叶位相对表达量 Fig. 6 Relative expression of CsCCD gene family members in different leaves. Different lowercase letters indicate significant differences among different leaf positions at 0.05 level. |
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为了解茶树CsCCD基因家族在乌龙茶加工过程中表达量变化情况及不同处理下(LED补光晾青为实验组，黑暗晾青为对照组) 表达量差异情况，采用RT-qPCR对其基因表达量进行相对定量检测，结果显示(图 7)，在乌龙茶加工过程中CsCCD1a、CsCCD1b随着做青次数不断增加，总体呈现表达量下降趋势，第一次摇青后补光晾青的叶片表达量均显著高于黑暗晾青对照。CsCCD4在做青阶段表达量显著下降，前两次摇青后补光晾青的表达量显著高于黑暗晾青对照。CsCCD7两个亚族成员表达模式不同，CsCCD7a在萎凋后表达量最低，显著低于其他处理，推测做青及光照可促进其表达；CsCCD7b表达量随摇青次数不断增加呈现上升趋势，第4次摇青后黑暗晾青叶表达量最高，且显著高于光照处理。CsCCD8表达量呈现先下降后上升再下降的趋势。CsNCED3亚族成员间表达趋势相近，表达量都呈现先升后降的趋势；且在做青前期，黑暗晾青表达量显著高于光照晾青，而在做青后期，光照晾青表达量显著高于黑暗晾青对照。CsNCED6亚家族成员在加工过程中表达量均不及鲜叶，但第一次摇青后补光晾青叶片表达量高于黑暗处理。
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| 图 7 茶树CsCCD基因家族成员在不同处理下相对表达量 Fig. 7 Relative expression of CsCCD gene family members upon different treatments. Different lowercase letters indicate significant differences among different sampling points during processing of Oolong tea at 0.05 level; "*" indicates significant differences between LED treatment (experiment group) and dark treatment (control group) at 0.05 level, while "**" indicates significant differences at 0.01 level. |
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CCD基因家族成员广泛存在于植物中，通常被分为CCD及NCED两大亚族，或CCD1、CCD4、CCD7、CCD8及NCED五大亚族[19, 35]。本研究共在茶树中鉴定出11个CsCCD基因家族成员，所构建的进化树结果中CCD1、CCD4、CCD7、CCD8及NCED聚类在不同分支，区分明显，但NCED亚族成员内部并未按照NCED2、NCED3、NCED5、NCED6、NCED9聚类在一起，而更倾向于按照物种差别聚类，表明NCED亚族成员间蛋白序列相差较小，而CCD与NCED间蛋白序列差异较大，且CCD1、CCD4、CCD7、CCD8亚族间蛋白序列差异也较大[36]。
在茶树中，大部分亚族均含两个或两个以上成员，而CsCCD4亚族仅有一个成员。张亚飞等[13]认为CCD4亚族成员个数差异与物种不同时期不同器官的颜色差异有关，如颜色单一的拟南芥、水稻和马铃薯等植物中仅含1个或少数CCD4，而在不同时期果实颜色有所转变的柑橘、葡萄、苹果、番茄中鉴定出的CCD4亚族成员数目较多。
CsCCD家族成员氨基酸个数平均值为519 aa，分子质量平均值为57 643.35 Da，与其他物种中CCD家族成员氨基酸个数及分子质量相近，推测其家族成员蛋白结构在各物种中相对保守，但值得注意的是，本研究鉴定出的CsCCD1b氨基酸个数仅为192 aa，与平均水平差异较大，其保守基序仅有motif 5与motif 12，可能由于组装序列不完整或部分序列缺失导致。
茶树CsCCD家族成员蛋白互作网络预测显示，比对到的6个家族成员构成互作网络，且预测方式以蛋白同源、基因共现和文本数据挖掘为主，暂无实验直接验证表明其互作关系。大多数互作蛋白间预测得分范围为0.4–0.5，但值得关注的是，CCD7与CCD8互作预测得分为0.998，包含4种互作预测方式。两者在行使功能中存在密切联系，CCD7裂解9-顺式-β-胡萝卜素后产生的9-顺式-β-阿朴-10'-胡萝卜醛会作为CCD8的底物参与独脚金内酯的形成，而拟南芥中AtCCD7-AtCCD8可能形成异源二聚体，提高类胡萝卜素裂解速率[6, 37]。
3.2 茶树CsCCD基因家族乌龙茶LED补光晾青及不同叶位的表达模式在受到摇青机械力胁迫后，大部分CsCCD基因家族成员表达量都显著下降，值得注意的是，CsNCED3a、CsNCED3b、CsNCED3c呈现大幅上升而后下降的趋势，表达量最高时可达到鲜叶表达量的15–30倍，表明适度机械力胁迫能大量促进其表达。
茶树鲜叶不同部位CsCCD基因表达量不同，鲜叶嫩度为第1叶 > 第2叶 > 第3叶 > 嫩茎。CsCCD亚族各成员总体呈现第2、3叶表达量高于第1叶及嫩茎；CsNCED亚族成员总体呈现随叶片嫩度降低基因表达量降低的趋势，只有CsNCED3c嫩茎中的表达量高达叶片的3倍，推测CsNCED3c在嫩茎中具有特殊功能。制作不同茶类所需原料老嫩不同，乌龙茶鲜叶原料较绿茶、红茶原料更成熟，进一步说明乌龙茶中类胡萝卜素降解产物及相关挥发性成分较高。
茶树CsCCD基因家族成员启动子区域包含大量胁迫响应、激素响应和光响应相关顺式作用元件，其中光响应元件数目多达142个。在杏[30]、番红花[38-39]、桂花[40]等其他物种报道指出CCD基因家族成员中含有大量光响应元件，推测光响应元件在CCD基因家族中广泛存在，其基因表达受光照调控。茶树中已证实CsCCD1、CsCCD4具有裂解玉米黄质、β-胡萝卜素和番茄红素等类胡萝卜素的生物活性，生成芳香物质β-紫罗酮、假紫罗酮、6-甲基-5-庚-2-酮、香叶基丙酮、乙酸香叶酯等类胡萝卜素衍生香气物质[41-42]。本研究探究了茶树CsCCD基因家族成员在乌龙茶补光晾青下的表达模式，CsCCD1、CsCCD4亚族成员经过摇青处理后表达量显著下调，而一摇后经补光晾青处理其表达量显著高于黑暗对照，说明在摇青前期，晾青中光照处理有利于促进CsCCD1、CsCCD4基因表达，推测光照能减缓摇青带来的机械损伤导致的基因表达量下降，有助于茶类胡萝卜素衍生香气物质的形成。后续研究可进一步验证乌龙茶加工过程中胡萝卜素降解产物的变化情况，探寻光照处理对乌龙茶香气品质的提升作用。
4 结论本研究共鉴定出11个茶树CsCCD基因家族成员，含有CCD1、CCD4、CCD7、CCD8与NCED共5个亚族，所有成员蛋白均含有RPE65结构，启动子区域顺式作用元件以胁迫响应元件、激素响应元件、光响应元件和多因素响应元件为主，其中光响应元件最多。基因表达水平受机械力及光照调控，与脱落酸形成相关基因CsNCED3表达量在受机械力胁迫后显著上升，与茶叶类胡萝卜素衍生香气物质直接相关的基因CsCCD1、CsCCD4表达量在LED光照射前期显著上升。这些结果有助于阐明茶树类胡萝卜素降解途径香气形成及独脚金内酯、脱落酸合成的遗传机制与光调控作用，为进一步研究该基因家族在茶树生长发育中的功能、通过调控茶叶加工环境而提升茶叶品质奠定基础。
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钟秋生, 陈常颂, 游小妹, 等. 不同做青环境对丹桂秋季乌龙茶香气品质的影响. 福建农业学报, 2010, 25(4): 468-474. Zhong QS, Chen CS, You XM, et al. Effect of processing conditions on flavor of Dangui oolong tea. Fujian J Agric Sci, 2010, 25(4): 468-474 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1008-0384.2010.04.018 |
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