同源异型盒(Homeobox) 基因是指能够编码产生保守同源异型盒结构域的转录因子编码基因。一个典型的同源异型结构域由60个氨基酸组成，60个氨基酸形成了3个螺旋区域，第一和第二螺旋形成环状结构，第二和第三螺旋形成螺旋-角-螺旋的结构^[1]。Homeobox基因最早发现于果蝇的第3条染色体上，随后证实该类基因广泛存在于动物和植物中，果蝇的Antp基因和玉米的Knotted-1基因分别为动物和植物中最早被克隆的基因。在植物中，根据结构特征可将Homeobox转录因子家族成员分为14类：HD-ZIPⅠ、HD-ZIPⅡ、HD-ZIPⅢ、HD-ZIPⅣ、PLINC、WOX、DDT、PHD、NDX、LD、PINTOX、SAWADEE、KNOX和BELL；在PlantTFDB中，Homeobox转录因子家族被分为5个家族：HD‐ZIP、TALE、WOX、HB-PHD和HB-other^[2]。其中，TALE转录因子家族包含KNOX亚家族和BELL亚家族，编码1个由63个氨基酸组成的非典型同源结构域，额外的3个氨基酸(P, Y, P) 残基连接在第一螺旋区域和第二螺旋区域之间。KNOX蛋白基本包含KNOX1、KNOX2、ELK和Homeodomain 4个结构域，拟南芥中KNATM蛋白不含Homeodomain结构域但属于KNOX家族。研究表明，含KNOX1结构域的基因在分生组织中表达，对于分生组织的发育起着重要作用；含KNOX2结构域的基因在调控植物细胞壁的次生生长以及根、茎、种皮、心材的发育方面发挥重要作用^[3]。BELL蛋白包含POX和Homeodomain 2个结构域，在胚珠发育、叶柄发育和果实形成过程中起着重要作用^[4]。

随着生物信息学和植物全基因组测序的快速发展，杨树^[5]、辣椒^[6]、百脉根^[7]、亚洲棉^[8]等物种基因组中分别鉴定到35、20、40、46个TALE转录因子家族成员。杨树TALE转录因子家族成员中发现了11个盐胁迫响应基因，其中ptTALE5经过胁迫处理后上调表达，可能在应对盐胁迫中具有重要功能。辣椒TALE转录因子家族各亚族之间保守基序几乎完全一致，表明辣椒TALE转录因子家族进化过程高度保守。百脉根中鉴定出的TALE转录因子家族成员存在多条结构域缺失的序列，表明百脉根在进化过程中出现假基因化现象，可能某些基因会出现功能缺失。亚洲棉TALE转录因子家族的研究中发现部分TALE成员在棉纤维次生细胞壁(secondary cell wall, SCW)增厚期表达，为进一步了解纤维SCW生物合成网络提供了线索。

萝卜(Raphanus sativas)属于十字花科萝卜属，是重要的蔬菜作物。研究萝卜TALE转录因子的功能和调控机制有助于萝卜的功能基因组研究和分子育种。本研究以象牙白萝卜为实验材料，在全基因组范围内识别和鉴定了TALE基因家族成员，并对其基因结构、在基因组中的位置、与近缘植物中同源基因的共线性关系、启动子区顺式作用元件、组织表达特征、编码蛋白的理化性质和模拟蛋白质结构、系统发育关系等进行分析，研究结果将为萝卜TALE转录因子的生物学功能解析提供有用信息。

1 材料与方法 1.1 数据来源

通过植物转录因子数据库(PlantTFDB，http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/) 下载萝卜(Raphanus sativus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana）、水稻(Oryza sativa subsp. japonica) 和胡杨(Populus euphratica) 的TALE转录因子信息，象牙白萝卜全基因组测序由中国农业科学院蔬菜花卉研究所等单位协作完成^[9]。

1.2 萝卜TALE基因家族的鉴定

本研究从PlantTFDB4.0中下载得到萝卜TALE转录因子蛋白序列，利用在线工具ClustalW进行多序列比对获得ALN格式文件，通过Hmmbuild软件自制萝卜的隐马尔可夫模型(hidden markov model, HMM)，之后利用Hmmsearch软件在象牙白萝卜中比对搜索E值小于1e^-10的所有蛋白序列。并利用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Batch-CD-search工具复筛含有完整BELL、KNOX结构域的萝卜TALE家族蛋白序列。利用TBtools^[10] (https://github.com/CJ-Chen/TBtools) 进行保守结构域可视化。

1.3 萝卜TALE基因家族序列结构分析

根据鉴定得到的TALE基因家族成员及基因结构注释文件，利用TBtools中gene structure view (advanced) 分析其基因结构。利用MEME (http://meme-suite.org/index.html)对TALE基因家族氨基酸序列保守域和结构元件进行分析，基序数量寻找10个。

1.4 TALE基因家族染色体定位与直系同源关系

根据鉴定出的象牙白萝卜TALE基因家族成员信息及象牙白萝卜基因结构注释信息文件，利用TBtools中的gene location visualize from GTF/GFF功能进行TALE基因家族的染色体定位。结合拟南芥和象牙白萝卜的基因结构注释信息文件及基因组文件，使用TBtools中的One step MCScanX功能得到萝卜与拟南芥直系同源基因信息，以‘36-2-R0N’表示序列所定位的萝卜染色体号，N(包括0-9)为染色体编号，以‘AT-ChrN’表示序列所定位的拟南芥染色体号，N(包括0-5)为染色体编号。使用TBtools软件dual systeny plot功能绘制萝卜与拟南芥的直系同源基因图。

1.5 萝卜TALE基因家族启动子顺式作用元件分析

通过PlantCARE网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 的‘search for care’工具进行TALE基因起始密码子上游2 000 bp区域的顺式作用元件预测，最后利用TBtools的simple bioSequence viewer功能对生成的结果进行可视化分析。

1.6 萝卜TALE家族基因表达特性分析

TALE基因家族表达分析使用的转录组数据由本实验室测序完成。转录组数据包括‘象牙白’萝卜愈伤、肉质根、叶、薹、花、角果6个组织及‘心里美’萝卜肉质根芽期、破肚期、肉质根膨大前期、膨大盛期、成熟期5个发育时期^[11]。表达量经过log₂(RPKM) 标准化处理，利用TBtools软件绘制热图^[12]。

1.7 萝卜TALE家族蛋白的理化性质与三维结构分析

蛋白长度、分子质量、等电点和亲水性等理化性质的分析通过在线工具ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/) 完成；信号肽的判断分析通过在线工具SignalP4.1Sever (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 完成；亚细胞定位预测通过在线工具wolfpsort (https://wolfpsort.hgc.jp/) 完成；蛋白三维结构建模分析通过在线工具SWISS MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive) 完成。

1.8 萝卜TALE基因家族系统进化分析

采用MEGA-X软件构建TALE基因家族系统进化树，构建模型选择邻接法(neighbor-joining)，利用bootstrap method和pairwise deletion，重复次数设置为1 000。使用在线工具iTOL (https://itol.embl.de/)^[13]美化系统进化树。

2 结果与分析 2.1 萝卜TALE转录因子家族成员的筛选与鉴定

经Hmmsearch程序检索及Batch-CD-search工具复筛，在象牙白萝卜43 239条氨基酸序列中找到32条符合条件的序列，加上一条和拟南芥KNATM同源的氨基酸序列Rsa10037940，象牙白萝卜中共得到33条TALE氨基酸序列。除蛋白Rsa10037940外，这些氨基酸序列均含有1个保守的Homeobox-KN结构域。33条TALE氨基酸序列根据结构域的差异可以分为BELL和KNOX 2个亚家族。象牙白萝卜BELL亚族包含21个成员，其中17个成员含有POX、Homeobox-KN结构域，4个成员含有POX-superfamily、Homeobox-KN结构域。象牙白萝卜KNOX亚族包含12个成员，其中7个成员含有KNOX2、KNOX1，Homeobox-KN、ELK结构域，2个成员含有KNOX2、KNOX1、Homeobox-KN结构域，成员Rsa10036281含有KNOX2-superfamily、ELK、Homeobox-KN结构域，成员Rsa10019161除了含有KNOX2、KNOX1、Homeobox-KN 3种结构域之外，还含有Neurochodrin结构域，成员Rsa10037940仅含有KNOX2-superfamily结构域(图 1)。

2.2 萝卜TALE家族转录因子的蛋白结构分析

使用MEGA-X构建象牙白萝卜TALE家族氨基酸序列的系统进化树显示(图 2A)，33条萝卜TALE家族蛋白可以分为8个类群：KNOX亚族分为3个类群，BELL亚族分成5个类群。设置基序数量为10，利用MEME在线工具对萝卜TALE家族氨基酸序列进行分析发现，不同的氨基酸序列包含的motif数量从4–8个不等(图 2B)。除氨基酸序列Rsa10037940外，其他家族成员均含有motif1、motif3保守基序，说明motif1、motif3基序保守性最强，对应结构域为Homeobox-KN结构域。除了共有基序motif1、motif3外，KNOX亚家族motif5保守，POX亚家族motif4保守，各亚家族的独特保守基序可能与各亚家族的不同功能相关。

2.3 萝卜TALE家族基因结构分析

在象牙白萝卜基因组中提取编码这些转录因子的基因，发现TALE家族的基因序列结构差异较大(图 2C)，Rsa10008122序列最长，为14 199 bp；Rsa10036281序列最短，仅1 031 bp。各亚族之间内含子数目变化具有一定的规律性，BELL亚族成员之间内含子个数在2–4之间，KNOX亚族成员之间内含子个数在3–5之间。家族成员中除了Rsa10037940、Rsa10038304、Rsa10030646、Rsa10020180、Rsa10037078、Rsa10017083、Rsa10008122、Rsa10033513、Rsa10037168等序列含有5′UTR或3′UTR外，其他成员均不含5′UTR和3′UTR。序列含有5′UTR和3′UTR对于mRNA的稳定性有重要作用，这些没有UTR的基因可能是没有注释出来，而非真的没有UTR。

2.4 萝卜全基因组TALE基因染色体定位以及与近缘物种的直系同源关系

TALE家族基因在象牙白萝卜基因组9条染色体上均有分布，从Chr1至Chr9分别有3、7、3、7、1、3、3、2和3个基因(图 3)。象牙白萝卜与拟南芥TALE基因家族成员共线性分析发现，象牙白萝卜中30个TALE基因和拟南芥中17个TALE基因互为直系同源基因。在拟南芥3号染色体上没有直系同源基因分布。其中象牙白萝卜和拟南芥TALE家族基因中互为同源基因的对应关系见表 1和图 4。

萝卜和拟南芥同为十字花科植物，亲缘关系较近，因此具有保守性较好的共线性区块。推测在进化过程中染色体水平上发生的融合、断裂，改变了萝卜和拟南芥基因的相对物理位置，甚至造成了2个物种染色体数目的变化，但是家族基因所在位置的共线性排列依旧保守。除个别TALE家族基因外，萝卜TALE家族基因与拟南芥TALE家族基因有一对多的共线性关系，这一结果与萝卜在与拟南芥分化之后基因组发生过三倍化事件这一理论相吻合。

2.5 萝卜TALE基因家族启动子特征分析

萝卜TALE基因家族启动子特征分析表明，其成员上游2 000 bp区域存在大量对赤霉素、生长素、低温、水杨酸、干旱诱导、脱落酸、茉莉酸甲酯响应的顺式元件(图 5)。其中，Rsa10040100启动子上只有1个脱落酸响应元件。66.7%的成员包含茉莉酸甲酯响应元件，81.8%的成员包含脱落酸响应元件，45.5%的成员包含干旱诱导的MYB结合元件，60.6%的成员包含生长素响应元件，30.3%的成员包含低温响应元件，63.6%的成员包含水杨酸响应元件，36.4%的成员包含赤霉素响应元件。

2.6 萝卜TALE家族基因的表达特性分析

基于转录组数据对萝卜TALE基因家族成员的表达特性进行分析(图 6)。结果显示，TALE基因家族成员在萝卜不同组织(肉质根、薹、愈伤、花、叶片、角果) 中表达量存在较大差异，Rsa10026944和Rsa10026407在各组织中均高表达，Rsa10002437在各组织中的表达量均较低；Rsa10037047在薹中表达量较高，Rsa10025037在愈伤组织中表达量较高；KNOX亚族成员在不同组织间的表达量比较均一。

对萝卜TALE家族基因在‘心里美’萝卜肉质根5个发育时期中的表达量进行分析(图 7)，发现Rsa10038773、Rsa10017083、Rsa10020487、Rsa10021426这4个基因在心里美材料的肉质根的5个不同发育时期中，都具有较高的表达量。Rsa10020180在心里美萝卜的5个生长时期呈现出表达量由低到高的表达趋势。

2.7 萝卜TALE基因家族蛋白的三维结构与理化性质分析

植物蛋白质的高级结构决定其生物学功能及活性大小。对象牙白萝卜33个TALE基因家族成员进行蛋白三维结构建模分析，28条氨基酸序列搜索到了相似度大于30%的模板，其氨基酸三维结构表明不同亚型成员的蛋白3D结构具有高度的相似性。结构的主要成分为3个α-螺旋。β-折叠与β-转角散布于整个蛋白序列中(图 8)。另外5个蛋白质的结构可信度低，本研究未采纳其预测的结构。如大小差异较大的Rsa10037940和Rsa10019161等蛋白质。

利用生物信息学方式对TALE基因家族编码蛋白进行分析，结果表明该家族蛋白长度变化范围为139 aa (Rsa10037940) 到995 aa (Rsa10019161)；蛋白分子量最大的为110 116.7 Da (Rsa10019161)，最小的为15 868.86 Da (Rsa10037940)。该家族蛋白除Rsa10002699、Rsa10007991、Rsa10020180以外均为酸性蛋白，等电点小于7。亲水性分析表明，该家族蛋白均为亲水蛋白，平均亲水性(GRAVY) 均为负值。该家族成员均检测不到信号肽，表明它们可能没有跨膜运输功能。亚细胞定位网站分析结果显示，33个编码蛋白均定位在细胞核，这也与转录因子定位在细胞核调控基因表达的功能相吻合(表 2)。

2.8 萝卜TALE转录因子家族进化关系

构建系统发育进化树对于基因功能分析十分重要。利用氨基酸序列构建萝卜、拟南芥、水稻和胡杨的NJ系统发育树(图 9)，结果显示在4个物种中TALE转录因子家族可以被划分为Class Ⅰ–Ⅷ共8组。其中Class Ⅰ、Class Ⅱ、Class Ⅲ为KNOX亚族，Class Ⅳ、Class Ⅴ、Class Ⅵ、Class Ⅶ、Class Ⅷ为BELL亚族。同一分组TALE转录因子家族氨基酸序列亲缘关系较近，其中Class Ⅰ TALE转录因子家族成员数量最多，有31个；Class Ⅲ TALE转录因子家族成员数量最少，含有7个。由图可以看出萝卜和拟南芥的TALE氨基酸序列总是聚在一起，同源性最高，其次是胡杨，水稻TALE氨基酸序列进化树距离最远，有1个KNOX亚族成员和3个BELL亚族成员游离在双子叶植物的8个分支之外，表明这些基因在单、双子叶植物中产生了独立的进化方向。TALE转录因子家族内各亚族数量关系上，拟南芥和萝卜KNOX亚族成员数量均少于BELL亚族成员数量，但是胡杨和水稻KNOX亚族成员数量均多于BELL亚族成员数量，表明不同物种间TALE转录因子家族之间系统进化方向并不相同。

3 讨论

TALE转录因子的结构域有KNOX、BELL、Homeodomain 3种，在调控植物生长发育、分生组织形成和维持器官形态发生方面发挥重要作用^[14]。KNOX结构域对于顶端分生组织的调控和激素的合成途径有重要作用，研究发现，赤霉素合成途径中的关键酶基因GA20ox1可以被KNOX结构域抑制表达^[15]。BELL蛋白与KNOX蛋白总是形成异二聚体发挥作用，BELL蛋白调控分生组织和花的发育，但其功能冗余^[16]。

本研究通过对象牙白萝卜TALE基因家族的检索与筛选，在象牙白萝卜中共鉴定到了33个TALE基因家族成员。其基因差异表达分析发现BELL亚族的Rsa10026944、Rsa10026407、Rsa10037168、Rsa10041765主要在肉质根表达。Rsa10026944、Rsa10026407在家族成员氨基酸序列进化关系中处于Class Ⅵ，Rsa10026407、Rsa10037168在家族成员氨基酸序列进化关系中处于Class Ⅳ。Rsa10026944、Rsa10026407与拟南芥对应的同源基因为BLH2，其在种子粘液分泌细胞中显著表达，与种子萌发和幼苗早期发育有关^[17]。Rsa10037168与拟南芥对应的同源基因为BLH6，研究证明BLH6和BREVIPEDICELLUS之间存在相互作用的关系，共同调控根和茎的发育^[18]。而KNOX亚族的Rsa10037047、Rsa10025037主要在薹和愈伤组织中表达。Rsa10037047、Rsa10025037与拟南芥对应的同源基因分别为KNAT4和KNAT5，研究表明，KNAT4和KNAT5在拟南芥根中具有细胞型特异性表达模式。此外，它们沿纵根轴和内根原基的表达具有不同的空间限制模式^[19]。水稻胚胎发生过程中KNOX基因在茎间分生组织区域表达，表明这些基因参与了茎间分生形成的调节^[20]。目前关于TALE基因组织表达的研究表明：BLH1与种子萌发和幼苗早期发育有关^[21]，BLH4调控叶形发育^[16]，BLH8在营养体向生殖体过渡过程中起着重要作用^[22]，BLH9调控花序茎的生长^[23]，KNAT6参与分生组织活性和器官分离^[24]，KNAT7与次生壁的形成有关^[25]。

萝卜和拟南芥的共线性分析发现，萝卜TALE家族30条基因序列与拟南芥中17条TALE基因序列具有共线性，多数萝卜TALE家族基因与拟南芥TALE家族基因有一对多的共线性关系，表明萝卜与拟南芥基因组分化后发生过基因家族复制事件，Rsa10034188未在拟南芥中发现共线性基因。表明萝卜TALE家族成员在物种分化后进化出新的功能。

分析TALE家族成员的氨基酸序列进化关系、基因序列结构和氨基酸保守基序发现，系统发育进化树中关系紧密的成员外显子长度相似。含有相似基因结构的家族成员氨基酸保守基序也相似。TALE转录因子家族蛋白Homeobox-KN结构域具有较强保守性，可作为后续功能验证的靶向序列。Rsa10037940不含Homeobox-KN保守结构域，表明此基因在进化过程中结构域发生了丢失，基因功能也可能发生了改变。在萝卜TALE家族成员中Rsa10008122存在1个约8 kb的5′UTR；Rsa10019161除了含有KNOX保守结构域还多出来1个Neurochondrin结构域，经过和WK10039萝卜(SAMN03084390) 基因组注释文件的比对，发现Rsa10008122和Rsa10019161的序列在萝卜WK10039基因组(SAMN03084390) 中分别被注释成2个基因，Rsa10008122中约8 kb的5′UTR在WK10039萝卜基因组中被单独注释成一个基因，Rsa10019161中多出来的结构域也被单独注释成一个基因，表明Rsa10008122在象牙白萝卜基因组或WK10039萝卜基因组中有一个可能存在注释错误或拼接错误。

根据基因结构，将萝卜TALE家族成员的氨基酸序列分成了8类，其中KNOX亚族分为3类，BELL亚族分为5类，据报道，拟南芥、棉花、石榴、杨树等植物的TALE家族氨基酸序列分类情况与此一致^[26]，表明植物中TALE基因家族序列保守性较强。拟南芥、萝卜、水稻、杨树4种植物的TALE蛋白系统进化分析中，BELL和KNOX亚家族分支明显，表明氨基酸序列上差异较大，可能2个亚家族分化时间较早。萝卜和拟南芥在分化上存在一致性，可能由于两者都属于十字花科，亲缘关系较近。萝卜和水稻在分化上差异较大，可能由于单双子叶植物在进化方向上有所不同。

启动子区域的顺式元件分析发现，TALE基因启动子序列包含多个与激素反应和非生物胁迫相关的顺式元件。富含茉莉酸甲酯、脱落酸、水杨酸、赤霉素、生长素、低温诱导、干旱胁迫等响应元件，表明萝卜TALE基因与逆境胁迫调控有关^[27]。这些结果与石榴^[26]、棉花^[8]等研究结果类似，说明TALE基因启动子具有一定的保守性。

邓浪等发现信号肽与蛋白质定向转运功能有关^[28]，信号肽分析表明，萝卜中TALE基因家族蛋白不参与细胞中蛋白质定向转运活动。蛋白理化性质分析表明，萝卜TALE基因家族蛋白的分子质量和氨基酸数量差异较大，表明TALE基因家族对于萝卜的调控方式可能更为复杂，调控效果更加多样。

目前，TALE基因家族已在多种植物中被鉴定出来，但是关于萝卜TALE基因家族的鉴定仍未见报道，本研究利用生物信息学手段在象牙白萝卜中鉴定出了33个TALE基因家族成员，研究了其理化性质及系统分化特点，并结合转录组数据对基因表达特性也进行了分析，萝卜TALE基因家族的鉴定及分析有助于后续对其成员的功能进行深入研究。