细胞色素c (cytochrome c) 是一类在生物体内广泛存在的血红素蛋白，由亚铁血红素(heme) 和细胞色素c蛋白前体(apocytochrome c) 组成。依据结构细胞色素c大致分为4类：1) 血红素结合位置接近N端；2) 血红素结合位置接近C端；3) 多个血红素与多肽链结合；4) 除血红素外还有其他辅因子与多肽链结合^[1]。作为电子载体，细胞色素c主要负责细胞内和细胞间电子和能量的传递，在细胞呼吸中发挥着不可或缺的作用。根据底物和反应体系的不同，细胞色素c已经被开发应用于环境污染修复^[2-3]、生物传感^[4]、微生物燃料电池^[5]以及重金属的迁移转化^[6]等多个领域。通过研究发现，细胞色素c还具有诱导细胞凋亡的作用，虽然其作用机制还有待进一步阐释，但是在癌症治疗方面展现了广阔的应用前景^[7-8]。另外作为生物药物，静脉注射细胞色素c可用于急救或者辅助治疗各种原因引起的组织缺氧。

作为胞外蛋白(可溶性周质蛋白或锚定在内膜、细胞表面上)，在细胞色素c的分子成熟过程中，其蛋白前体和亚铁血红素都必须穿过内膜转移到胞外，经过翻译后修饰的蛋白前体与亚铁血红素共价结合，正确折叠后组装成具有功能的细胞色素c。蛋白前体中负责共价结合血红素的半胱氨酸残基必须在氧化性的周质环境中保持还原状态，而同时溶液中必须存在疏水性的血红素。最后，前体蛋白中血红素结合基序C-X-X-C-H中的半胱氨酸残基与血红素的乙烯基在硫醇氧化还原酶的催化下形成硫醚键^[9]。目前生物体中有3种被认可的细胞色素c成熟系统，其中分布最广泛且最复杂的是Ccm系统，由8个或9个膜相关蛋白组成^[10-11]，主要存在于α-变形菌门和γ-变形菌门，古菌，异常球菌纲，以及一些β和δ-变形菌门。第二种为由4种膜蛋白组成的Ccs系统^[12-13]，主要存在于叶绿体、革兰氏阳性菌、蓝藻菌、ε-变形菌门、大部分β变形菌门以及部分δ-变形菌门。第三种系统由一个高分子量的跨膜蛋白细胞色素c铁原卟啉裂解酶组成，存在于真菌、无脊椎动物和脊椎动物线粒体中，是目前发现的最简单的细胞色素c成熟系统^{[10-11, 14-15]}。

作为异源表达的模式宿主，野生型大肠杆菌(Escherichia coli) 在氧气缺乏条件下能够将细胞色素c作为厌氧呼吸链的一部分进行组装^[16]，而pEC86质粒的成功构建，使E. coli能够表达细胞色素c成熟相关蛋白CcmABCDEFGH，为细胞色素c的异源表达提供了便利。目前对于细胞色素c的研究主要集中在γ变形菌和δ-变形菌中^{[1, 17-19]}，而对于古菌来源的细胞色素c仍然缺乏研究。已知存在于甲烷厌氧氧化古菌(anaerobic methanotrophic archaea, ANME) 中的细胞色素c在甲烷厌氧氧化(anaerobic oxidation of methane, AOM) 过程中发挥着举足轻重的作用，但是由于至今未能成功表达来源于ANME的细胞色素c，AOM的电子传递机制仍未可知^[20-21]，阻碍了进一步的环境生物技术应用。

本研究通过对密码子、表达载体、诱导条件以及表达宿主等一系列蛋白表达条件的优化，成功表达了来自未培养厌氧甲烷氧化古菌的细胞色素c，为难培养微生物细胞色素c的异源表达提供了重要的指导，同时也为深入研究该类型细胞色素c介导的电子传递机制以及将来的环境生物技术应用，迈出了关键的一步。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 质粒和菌株

pET28a (Novagen) 为常规蛋白表达载体，携带卡那霉素抗性基因；pET22b (Novagen) 携带与目的蛋白融合的信号肽序列(pelB) 以及氨苄青霉素抗性基因；pEC86质粒用于过量表达E. coli的ccmABCDEFGH基因簇，以辅助细胞色素c的成熟^[22]；携带氯霉素抗性基因的pBBR1MCS1质粒用于在奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis) 中过量表达细胞色素c^[23]。E. coli BL21(DE3) 和S. oneidensis MR-1^[24] (中国科学院微生物研究所李寅课题组惠赠) 用作细胞色素c过量表达的宿主菌株。

1.1.2 培养基和培养条件

TB培养基(%，W/V)：1.2蛋白胨，2.4%酵母粉，0.4%甘油，17 mmol/L KH₂PO₄，72 mmol/L K₂HPO₄，121 ℃灭菌20 min；LB培养基(%，W/V)：1蛋白胨，0.5酵母粉，1氯化钠，1.5–2.0琼脂(固体培养基加入)，121 ℃灭菌20 min。卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp) 和氯霉素(Cm) 在E. coli培养基中的使用浓度分别为50 μg/mL、100 μg/mL和34 μg/mL；S. oneidensis MR-1培养基中氯霉素(Cm) 的使用浓度为25 μg/mL。E. coli和S. oneidensis MR-1均在200 r/min转速条件下振荡培养，常规培养温度分别为37 ℃和30 ℃。

1.1.3 主要试剂和仪器

1 000×金属离子溶液(mmol/L)：0.15 CuSO₄，4.3 FeSO₄，0.1 Mo⁶⁺，45 CaCl₂，3.8 ZnSO₄，0.9 MnSO₄，0.086 Co(NO₃)₂。所有的抗生素均来源于北京索莱宝科技有限公司，各种限制性内切酶、Q5超保真DNA聚合酶和T5外切酶均购于New England Biolabs (NEB)，2× rapid mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Axygen公司，DNA纯化试剂盒购自Omega试剂公司。

pH计，Mettler Toledo公司；PCR仪和离心机，Eppendorf公司；紫外-可见分光光度计，ThermoFisher Scientific公司；超声破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法 1.2.1 基因克隆

PCR反应体系(50 μL)：5 μL 5×Reaction缓冲液、5 μL 5×High GC缓冲液、0.5 μL dNTPs (10 mmol/L)、1 μL引物F、1 μL引物R、0.5 μL模板DNA、0.2 μL Q5 polymerase (2 U/μL)，最后加去离子水补足至25 μL。PCR用到的引物罗列在表 1中。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃复性20 s，72 ℃延伸30 s，变性→复性→延伸过程重复30次，最后72 ℃再延伸6 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验后，进行纯化。

1.2.2 表达载体的构建

我们采用T5外切酶组装的方法对DNA片段和酶切的质粒载体进行连接，以此构建重组质粒^[25]。T5外切酶组装反应体系：2 μL 5×TEDA，酶切后质粒载体摩尔质量与DNA片段的摩尔质量相等，最后用去离子水补至10 μL；连接方法：将以上反应体系在30 ℃下进行反应，根据片段长度判断所需的反应时间(10–50 min)；最后将此连接产物转化到E. coli感受态细胞中。所有构建的菌株和质粒列于表 2中。质粒抽提、DNA片段回收、酶切、酶连反应等均参照试剂(盒) 说明书，相关分子生物学方法参照文献[26]。DNA测序委托金唯智生物科技有限公司。

1.2.3 蛋白表达和鉴定

SDS-PAGE：配置12%分离胶和5%的浓缩胶，先在低压120 V下将蛋白样品跑到浓缩胶尾部至同一水平线，再在高压150 V下分离不同大小的蛋白，最后经考马斯亮蓝染色并脱色处理直至看到清晰的蛋白条带。

Western blotting：一抗为小鼠抗His·Tag抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG。首先将蛋白样品进行SDS-PAGE垂直电泳，切胶转PVDF膜，按阴极/海绵/两层滤纸/胶/膜/两层滤纸/海绵/阳极的顺序放入电转仪中，电转在4 ℃下进行，条件为100 V、20 min；随后将膜转到封闭液中室温封闭2 h，随后加入适当浓度的一抗，4 ℃过夜，用缓冲液漂洗，加入二抗，室温静置2 h，再用BeyoECL Moon极超敏ECL化学发光试剂盒(Beyotime，中国) 进行显色，最后目的条带通过净光密度进行定量分析(Tanon 1600 GIS 1D分析软件)。

细胞色素c的光谱表征：菌体细胞破碎后取上清，加入终浓度为5 mmol/L的连二亚硫酸钠，对氧化型的细胞色素c进行还原，并在400–600 nm波长范围内测定其吸收光谱。还原型细胞色素c具有明显的可见光谱吸收现象，在3个不同波长下具有吸收峰：分别为α (550 nm)、β (521 nm) 和γ (415 nm)。

1.2.4 进化树构建

首先在NCBI中对目的蛋白CytC4进行序列比对，将数据库中所有相似蛋白序列合并至一个fasta格式文件中，导入MEGA7，并通过Clustal W进行多序列比对分析。通过最大似然法进行发育分析^[27]，bootstrap参数设置为1 000 (一般认为500以上时，节点分析结果可信)^[28]，由此通过MEGA7得到CytC4的系统进化树^[29]。

2 结果与分析 2.1 编码蛋白基因序列的优化

通过对第405天的锰依赖型甲烷厌氧氧化生物反应器中的样品基因组进行信息挖掘，在未培养厌氧甲烷氧化古菌Candidatus Methanoperedens sp.中发现了一段全长为693 bp (NJD76635.1) 且具有4个血红素结合基序-CXXCH-的编码序列(FIB08_05990)，并将该基因命名为cytC4。细胞色素c为呼吸链上一个重要的电子传递蛋白，进化相对保守，依据最大似然法对该蛋白序列进行进化树分析(图 1)，找到两个近源蛋白。但目前尚无对这两个近源蛋白的相关报道，无法对CytC4的表达提供参考依据。为使该厌氧甲烷氧化古菌来源的细胞色素c能够在E. coli中表达，首先根据E. coli密码子偏好性对cytC4基因进行了首次密码子优化，但并未发现明显的目的蛋白表达。随后，使用E. coli Codon Usage Analyzer 2.1 by Morris Maduro (http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm) 对基因序列进行分析，发现编码苏氨酸的密码子ACA的使用频率在10%以下，因此将首次优化序列中的两个ACA密码子优化为E. coli高频苏氨酸密码子ACC，得到最终优化后的基因序列。

2.2 细胞色素c异源表达载体的优化

首先通过金唯智合成密码子优化后的基因序列，再通过在线信号肽预测网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 分析信号肽的位置(图 2)，最后利用同源重组以及T5外切酶将去掉自身信号肽序列的cytC4基因构建到pET28a上，利用质粒NcoⅠ酶切位点上ATG起始不带标签的目的蛋白的表达，获得重组质粒pET28a-deSP-CytC4，利用该重组质粒表达CytC4，结果在超声破碎后的细胞上清液中未发现目的蛋白，且与连二亚硫酸钠反应未检测到特征吸收峰(图 3A)。根据目的蛋白的性质，将表达载体更换为携带有pelB信号肽序列的pET22b，pelB属于Sec转运途径的典型信号肽，将去除原始信号肽并在C端添加有组氨酸标签(His·Tag)的基因序列构建到pET22b上，获得重组质粒pET22b-deSP-CytC4，利用该重组质粒表达CytC4，同样未检测到蛋白表达和特征吸收峰(图 3B)。将His·Tag置于目的蛋白的N端或C端可能会对目的蛋白的折叠产生严重影响，因此对pET22b质粒进行了改造，在pelB信号肽序列后插入了His·Tag序列，借此将His·Tag改为融合到目的蛋白的N端，同时在His·Tag序列后添加一个凝血酶位点，以避免His·Tag与目的蛋白距离过进而影响目的蛋白的正确折叠，所获得质粒命名为pET22b-HisTb。然后以pET22b-HisTb为表达载体，对已有报道的Geobacter sulfurreducens来源的细胞色素c7编码基因和cytC4基因进行相同条件的异源表达，对诱导表达后的细胞裂解上清液进行光谱分析，均检测到了细胞色素c的特征吸收峰(图 3C–D)，表明pET22b-HisTb可用于细胞色素c的异源表达。

2.3 诱导条件的优化

诱导剂浓度、微量金属元素、诱导温度与转速等不同培养条件可能会在很大程度上影响目的蛋白的表达量。许多细胞色素对诱导时的IPTG浓度非常敏感，低浓度的IPTG可以更好地促进细胞色素c的分子成熟，因此将IPTG浓度从50 μmol/L降为20 μmol/L。细胞色素c的成熟依赖于多种微量金属元素，因此在原有培养基的基础上加入了微量金属元素溶液。同时为减少包涵体的形成，将诱导温度从30 ℃降低到16 ℃。最后，为避免过多氧气对细胞色素c分子成熟的影响，将转速从200 r/min调整至100 r/min。结果显示，通过一系列培养条件的优化，和图 3C相比，细胞上清液中CytC4的特征吸收峰得到了明显的加强，说明培养条件的优化对细胞色素c的表达有促进作用，另外利用His·Tag抗体对CytC4的表达进行了Western blotting分析，进一步验证了CytC4的成功表达(图 4B)。但是通过SDS-PAGE分析，没有发现明显的目的蛋白条带，说明CytC4的表达量仍然较低。

2.4 异源表达宿主的优化

虽然对以E. coli为表达宿主进行一系列优化后，目的蛋白能够成功表达，但是表达量仍然较低，不足以进行大量纯化。而S. oneidensis属于γ变形菌门，以呼吸多样性和生物发电著称，含有大量的细胞色素c。通过分析其基因组，发现S. oneidensis能够利用Ccm系统有效进行自身细胞色素c的成熟。S. oneidensis MR-1在该属中是最早完成全基因测序的菌株，也是一株新兴的高效异源表达宿主^[30]。因此利用S. oneidensis作为细胞色素c的异源表达宿主，有可能获得更高的CytC4蛋白表达量。

首先，通过红色荧光蛋白(mCherry) 检测araC-pBAD与lacI-pTac两种启动子在S. oneidensis MR-1中的启动子强度，当分别使用2 mg/mL的阿拉伯糖和0.2 mmol/L的IPTG时，红色荧光蛋白在S. oneidensis中分别取得了相应启动子的最高表达强度(图 5A–B)。之后将cytC4基因构建到pBBR1MCS1质粒上，利用两种诱导型启动子araC-pBAD和lacI-pTac启动CytC4的表达，同时在CytC4上分别用两种不同的信号肽-pelB和cytC4本身的信号肽，获得的重组质粒分别命名为pBBR1MCS1-araC-pBAD-pelB-CytC4、pBBR1MCS1-araC-pBAD-CytC4、pBBR1MCS1-lacI-pTac(OO)-pelB-CytC4、pBBR1MCS1-lacI-pTac(OO)-CytC4 (图 5C)，并将该重组质粒通过接合转移的方式转入S. oneidensis MR-1中，利用其自身的Ccm系统来帮助CytC4的分子成熟。在30 ℃下培养携带有重组质粒的S. oneidensis菌体细胞，并加入2 mg/mL阿拉伯糖或0.2 mmol/L IPTG诱导CytC4的表达，菌体细胞超声破碎取上清液后进行Western blotting分析(图 5D)，发现虽然lacI-pTac启动子的启动强度明显高于araC-pBAD，却几乎检测不到CytC4的表达，因此推测高强度表达CytC4影响了其正确折叠，无法获得有功能的可溶性CytC4。而采用诱导型启动子araC-pBAD，CytC4在S. oneidensis中均取得了较高的表达量，其中表达量最高的为S. oneidensis pBBR1MCS1-araC-pBAD-CytC4菌株，CytC4在该菌株中的表达量较以E. coli作为表达宿主时高10倍左右，表明S. oneidensis是表达CytC4较为理想的宿主。

3 讨论

近年来，有关细胞色素c在电化学方面的作用机制及其应用的研究日益受到重视。随着分子生物学技术的发展，异源表达可以摆脱原始菌株的可培养限制，同时细胞色素c的分子成熟过程非常复杂，需要一整套辅助蛋白的参与，因此构建表达水平高，稳定性好的表达系统成为一项重要的研究内容，将为解决难培养微生物中细胞色素c的电子传递机制及其应用奠定基础。

本研究在E. coli为表达宿主的基础上进行了一系列的条件优化，虽然成功获得了带有His·Tag的目的蛋白CytC4，但是表达量很低。已有研究表明，His·Tag会干扰细胞色素c的分子成熟，尤其是对于含有多个血红素辅基的细胞色素c，进而减少成熟细胞色素c的收率^[31]。其中的原因可能是非天然组氨酸配体的配位作用会造成蛋白的错误折叠，导致一个动力学陷阱，进而积累错误折叠的蛋白质^[32-33]。但是对于CytC4来说，即使去除了His·Tag，其蛋白表达量也没有明显提高，说明His·Tag可能并不是影响CytC4高水平表达的一个主要因素。

此外，利用E. coli来表达成熟的CytC4，需要辅助质粒pEC86的参与，该质粒表达 E. coli来源的Ccm系统，即由8个蛋白组成的CcmABCDEFGH，而S. oneidensis的Ccm系统由9个蛋白组成，即CcmABCDEFGHI。虽然E. coli的CcmH_Ec被认为融合了CcmH和CcmI两个蛋白的功能，但是在S. oneidensis中，CcmH_So和CcmI_So并不是CcmH_Ec蛋白的简单拆分。另外在荚膜红细菌Rhodobacter capsulatus中，CcmH_Rc和CcmI_Rc这两个蛋白也是分开的^[34]，并且对细胞色素c的成熟过程是必需的。虽然CcmI_So对于典型细胞色素c的成熟不是必需的，但是很可能在此厌氧甲烷氧化古菌来源CytC4的成熟过程中发挥了重要作用，使CytC4在S. oneidensis中的表达量得到了较明显的提高^[1]。

总之，本研究成功表达了未培养厌氧甲烷氧化古菌来源的CytC4，为难培养微生物细胞色素c的大量表达创造了一个良好的技术平台，同时也为体外深入研究细胞色素c的生理功能，电子传递机制以及今后潜力巨大的环境生物技术应用，迈出了重要的一步。