2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 张颖, 刘展志, 李光耀, 付雪妮, 张钰成, 王志远, 田亚平, 吴敬
- ZHANG Ying, LIU Zhanzhi, LI Guangyao, FU Xueni, ZHANG Yucheng, WANG Zhiyuan, TIAN Yaping, WU Jing
- 碳水化合物结合模块-嗜热子囊菌角质酶融合蛋白在PET降解中的应用
- The application of carbohydrate binding module-Thermobifida fusca cutinase fusion protein in polyethylene terephthalate degradation
- 生物工程学报, 2022, 38(1): 217-225
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(1): 217-225
- 10.13345/j.cjb.210036
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文章历史
- Received: January 12, 2021
- Accepted: March 29, 2021
引用本文
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2. 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122;
3. 江南大学 教育部食品安全国际合作联合实验室, 江苏 无锡 214122
2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;
3. Joint Laboratory for International Cooperation in Food Safety by the Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
塑料是最常用的合成材料之一，坚固耐用，重量轻且具有成本效益[1]，已广泛应用于各类商品，如食品包装、高分子材料、粘合剂等。自20世纪50年代以来，全球塑料产量呈指数级增长，截至2017年，全球累计合成塑料生产量已超83亿t[2]。聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET) 是一种石油基塑料，由对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA) 和乙二醇(ethylene glycol, EG) 通过酯键聚合而成，分子结构致密[3]，因其具有良好的热塑性、耐用性、稳定性，被广泛应用于制造食品外包装、饮料外包装等。1973年由Wyeth[4]发表有关PET瓶的专利，之后20世纪80年代开始广泛生产一次性软饮料瓶。
PET制品降解困难，在环境中持续积累会对生态构成严重威胁[5]，也是“白色污染”的主要来源之一，目前回收利用是处理PET废弃物的主要手段[6]。而针对无法有效回收利用的塑料PET处理方法主要包括填埋、焚烧[7]及生物降解[8]等。填埋需占用土地资源，处理时间漫长，还会污染环境；焚烧产生的二噁英、一氧化碳等有毒气体和烟尘会造成二次污染；目前，生物降解技术因其环境友好特性逐渐成为研究热点。生物降解主要是通过酶作用PET材料，通过水解酯键将其断裂成双(2-羟基乙基) 对苯二甲酸酯(bis(2-hydroxyethyl) terephthalate, BHET) 和2-羟乙基甲基对苯二甲酸酯(2-hydroxyethyl methyl terephthalate, MHET)，继而水解为终产物EG和TPA。
目前，文献报道能降解PET的酶主要有角质酶、脂肪酶、羧酸酯酶、木瓜蛋白酶[9]和PETase[10]等。角质酶(EC3.1.1.74) 是可以水解角质的酯酶，还可以降解一些长链、短链脂肪酸酯、可溶性的合成酯和乳化的甘油三酯，是一种多功能水解酶，可以降解PET。但是PET表面光滑疏水，分子结构致密，限制了角质酶对PET的结合与降解。张瑶等研究发现，利用具有PET基材结合能力的碳水化合物结合模块(carbohydrate binding module, CBM) CenA构建角质酶Tfuc-CenA融合蛋白，可将角质酶的PET结合能力增强1.4–1.7倍，PET降解效率提高1.5倍[11]。Espino-Rammer等发现木霉(Trichoderma) 来源的疏水蛋白HFBs (HFB4和HFB7) 可显著提高角质酶TfCut1对PET的水解效率[12]。Ribitsch等研究同样表明，真菌来源的疏水蛋白可显著增强TfCut1对PET膜表面的有效吸附以及降解活性[13]。Islam等在锚定肽(anchor peptide，AP) 方面开展了深入研究，将锚定肽Tachystain TA2与弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata) 来源的角质酶Tcur1278构建融合蛋白，可对聚氨酯降解效率提升6.6倍[14]。因此，通过添加CBM、AP等外源疏水结合模块以及分子改造等手段，可以有效提高PET降解酶对PET表面的结合能力，提高酶的底物可及性，从而促进PET降解。
本研究将炭疽杆菌(Bacillus anthraci) 来源的BaCBM2与嗜热子囊菌(Thermobifida fusca) 的角质酶Tfuc构建融合蛋白，并表征了该融合蛋白的酶学性质及其PET降解性能，为废弃PET的生物降解提供了技术支持。
1 材料与方法 1.1 材料和仪器胰蛋白胨、酵母粉购于英国Oxiod公司；PET膜购于德国Goodfellow公司；对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)、对硝基苯丁酸酯(4-nitrophenyl butyrate, pNPB)、对硝基苯酚(p-nitrophenol, pNP) 购于美国Sigma公司，均为色谱级；2×Phanta Max Master Mix、DNA Marker购于南京诺唯赞生物科技技术股份有限公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒购于碧云天生物科技有限公司；直链烷基苯磺酸盐(Linear Alklybezene Sulfonates, LAS) 等常用试剂购于国药集团。
1.2 培养基及缓冲液LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。
LB固体培养基(g/L)：在LB液体培养基里加入1%的琼脂粉(W/V)。
TB发酵培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO4 2.31。
磷酸钾缓冲液：100 mmol/L K2HPO4用100 mmol/L KH2PO4调pH至8.0
结合缓冲液(binding buffer)：25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，500 mmol/L NaCl。
洗脱缓冲液(elution buffer)：25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，500 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑。
1.3 目的基因的合成根据NCBI中BaCBM2氨基酸序列(MK349005) 和连接肽氨基酸序列(GGGGS)3，合成基因。
1.4 PCR扩增获取目的基因大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET- 24a(+)-Tfuc (NCBI登录号：WP_011291330.1)，E. coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-eGFP (NCBI登录号：ABG78037.1) 由本实验室合成。设计引物(表 1)，利用PCR扩增BaCBM2和连接肽基因。
| Primer names | Primer sequences (5′→3′) | Size (bp) |
| BaCBM2-eGFP-F | GAAGGAGATATACATGCCACCTTCTCA | 27 |
| BaCBM2-eGFP-R | TGATACACGGGACATTGCCGCTGCAG | 26 |
| BaCBM2-Tfuc-F | AGGAGATATACATATGGCCACCTTCTCAGT | 30 |
| BaCBM2-Tfuc-R | ATAAGGGTTGGCCATTGCCGCTGCAGCTGC | 30 |
根据天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书中的步骤回收PCR产物，随后将胶回收的片段作为Mega引物，用megaprimer PCR of whole plasmids (MEGAWHOP) 构建重组质粒pET24a(+)-BaCBM2-Tfuc和pET20b(+)-BaCBM2- eGFP。
将上述PCR产物用DpnⅠ在37 ℃处理2 h，随后经热激转化至E. coli JM109，挑取单菌落测序。测序成功后，热激转化至E. coli BL21(DE3)，分别得到重组菌E. coli BL21(DE3)/pET24a(+)- BaCBM2-Tfuc和E. coli BL21(DE3)/pET20b(+)- BaCBM2-eG-FP。
1.6 BaCBM2-Tfuc和BaCBM2-eGFP的表达分别将重组菌接种于液体LB培养基生长8–10 h；按5%接种量将种子液接入TB液体发酵培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养2 h，在菌体浓度OD600为0.5–1.0时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，25 ℃、200 r/min进行摇瓶诱导发酵24 h。
1.7 融合蛋白的分离纯化收集发酵结束的发酵液，测量菌体浓度OD600，将发酵液8 000 r/min、4 ℃离心20 min，收集菌体，用50 mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH 8.0) 吹吸重悬，保证菌体浓度OD600在25–30。提前打开高压匀浆破壁机预冷，进行破壁，至菌液透明且不粘稠，8 000 r/min、4 ℃离心20 min，收集上清，即为粗酶液。用binding buffer平衡镍柱，低流速上样，依次用10、20、30、50、100和200 mmol/L的elution buffer除去杂蛋白，然后用elution buffer洗脱下目的蛋白。
1.8 BaCBM2-eGFP对PET膜的荧光吸附强度测定分别加入2 mL等荧光值的eGFP和BaCBM2-eGFP置于1 cm×1 cm PET膜表面，25 ℃、200 r/min孵育1 h。孵育结束后，用100 mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH 8.0)，25 ℃、5 min洗涤3遍。再用0.25 mmol/L LAS，25 ℃洗去非特异性蛋白吸附。于激光共聚焦显微镜(波长488/530，增益800) 下观察PET膜表面的荧光强度。
1.9 BaCBM2-Tfuc酶活力测定在37 ℃条件下，采用连续分光光度法测定酶活力。反应总体积为1.5 mL，包括30 μL酶液(蛋白浓度20–40 mg/L)、30 μL 50 mmol/L pNPB和1 440 μL 10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，在波长405 nm处，记录pNP的生成速率。
酶活的定义为：每分钟将pNPB催化水解生成1 μmol pNP所需要的酶量即为一个酶活力单位(1 U)。
1.10 酶学性质研究最适反应pH的测定：100 mmol/L pH 6.0–9.5 (梯度为0.5) 的缓冲液，37 ℃预热10 min后，吸取1 440 μL缓冲液至0.5 cm比色皿中，先后加入30 μL的酶液和30 μL的pNPB溶液，摇匀立即放入分光光度计(405 nm)，每隔5 s记录吸光值，反应1 min。以测的最高酶活为100%，计算各个pH下的相对酶活。
最适反应温度的测定：在最适pH下，将缓冲液放置于不同温度(40–90 ℃) 下预热10 min，吸取1 440 μL缓冲液至0.5 cm比色皿中，先后加入30 μL的酶液和30 μL的pNPB溶液，摇匀立即放入分光光度计(405 nm)，每隔5 s记录吸光值，反应1 min。以测的最高酶活为100%，计算各个温度下的相对酶活。
温度热稳定性：将重组酶分别置于40 ℃、60 ℃和80 ℃水浴锅中，每隔一段时间进行取样按照1.9的方法测定残余酶活，定义反应0 h时酶活为100%。
1.11 动力学测定用对硝基苯丁酸酯作为底物测定融合蛋白和角质酶活性。在37 ℃、pH 8.0、底物浓度0.05–10.00 mmol/L范围内测定动力学参数。利用Michaelis-Menten方程，计算动力学数据。
1.12 PET膜降解应用处理PET膜：0.1% SDS溶液于50 ℃孵育30 min，50 ℃超净水孵育5 min，50 ℃无水乙醇孵育5 min，50 ℃烘干。
将Tfuc和重组酶等蛋白量加入含有PET膜(1 cm×1 cm) 的玻璃试管中，分别在40 ℃、150 r/min和60 ℃、150 r/min恒温水浴摇床反应4 d。
1.13 高效液相(HPLC) 测定TPA含量反应结束后，取1 mL反应液，离心取上清，过0.22 μmol/L滤膜，滤液进行HPLC分析。
色谱条件：Agilent 1200 HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，Athena C18-WP，100 Å，4.6 mm×250 mm，5 μm色谱柱，Agilent紫外检测器，流动相采用65% (V/V) 1%乙酸溶液和35%的甲醇溶液，柱温设定为30 ℃，流速为0.5 mL/min。
1.14 扫描电子显微镜(SEM)观察样品室的真空“PVG”值，当其达到9.0×10–5 Pa时，放入处理好的样品。在低放大倍数，调节聚焦使样品清晰，移动样品位置，找到目标区域后，调节放大倍数，锁定后进行扫描图像，保存图片。
2 结果与分析 2.1 融合蛋白BaCBM2-eGFP的构建及对PET膜结合能力分析以pET20b(+)-eGFP为模板，以BaCBM2- eGFP-F、BaCBM2-eGFP-R为引物(表 1)，构建融合蛋白BaCBM2-eGFP。
BaCBM2-eGFP融合蛋白与PET膜孵育结合后，使用激光共聚焦显微镜检测融合蛋白对PET膜的结合情况。结果显示(图 1)，对照组eGFP与PET膜孵育、洗脱后，PET膜上没有荧光残留。BaCBM2-eGFP与PET膜孵育，洗脱后PET膜上还残留荧光信号，表明BaCBM2对PET有一定的结合能力。
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| 图 1 激光共聚焦显微镜结果(×40) A：孵育后未洗脱BaCBM2-eGFP；B：孵育后未洗脱eGFP；C：洗脱后BaCBM2-eGFP；D：洗脱后eGFP Fig. 1 Results of laser confocal microscopy (×40). (A) BaCBM2-eGFP is not eluted after incubation. (B) eGFP is not eluted after incubation. (C) BaCBM2-eGFP after elution. (D) eGFP after elution. |
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以pET24a(+)-Tfuc为模板，以BaCBM2- Tfuc-F、BaCBM2-Tfuc-R为引物(表 1)，构建融合蛋白BaCBM2-Tfuc。
融合蛋白BaCBM2-Tfuc发酵表达后，收集菌体，高压匀浆破壁机破壁，离心留上清，即为粗酶液。用20%硫酸铵沉淀，再用镍柱纯化制备纯酶，SDS-PAGE分析结果如图 2所示。Tfuc预测蛋白大小为29 kDa，BaCBM2-Tfuc预测蛋白大小为37 kDa，与蛋白条带所处位置基本一致。
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| 图 2 SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis. M: standard molecular weight protein; 1: Tfuc purified protein; 2: BaCBM2-Tfuc purified protein. |
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按1.10中所述方法测定融合蛋白BaCBM2-Tfuc在37 ℃下、pH 6.0–9.5的缓冲体系中pNPB水解活性。融合蛋白BaCBM2-Tfuc在pH 7.5–8.0的缓冲液中酶活较接近，pH 8.0为融合蛋白的最适pH (图 3)，表明融合蛋白BaCBM2-Tfuc在弱碱性环境下酶活较高。角质酶Tfuc的最适pH也为8.0[15]。
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| 图 3 BaCBM2-Tfuc最适pH Fig. 3 Optimal pH of BaCBM2-Tfuc. |
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融合蛋白BaCBM2-Tfuc在40–80 ℃条件下酶活随温度增加逐步增加。温度超过80 ℃时，BaCBM2-Tfuc的酶活略微下降(图 4A)。将融合蛋白分别放置于40 ℃、60 ℃和80 ℃中，每隔一段时间进行取样，测定pNPB水解酶活性，以未保温(4 ℃保存，pH 8.0) 的酶液活性为100%。融合蛋白在60 ℃ (Tfuc最适温度) 条件下半衰期为30 h (图 4C)，在40 ℃条件下保持210 h后酶活还保持在60%以上(图 4B)。融合蛋白的最适反应温度为80 ℃，但是在这个温度下融合蛋白很快就会完全失活(图 4D)，且PET在80 ℃下结晶率还会有所提高，不利于降解。综合以上理由，选择40 ℃和60 ℃进行PET降解应用。
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| 图 4 BaCBM2-Tfuc最适温度(A) 及温度稳定性(B：40 ℃；C：60 ℃；D：80 ℃) Fig. 4 Optimum temperature (A) and temperature stability (B: 40 ℃; C: 60 ℃; D: 80 ℃) of BaCBM2-Tfuc. |
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为了测试由Tfuc和BaCBM2组成的融合蛋白是否保留了各自的生物学活性，我们使用可溶性模型底物对硝基苯丁酸酯(pNPB) 分别测试了融合蛋白和Tfuc的酶活性。在表 2中给出针对pNPB的动力学参数。与Tfuc相比，融合蛋白Km值增加，kcat有所增加，催化效率(kcat/Km) 也有所增加。相比于Tfuc，融合蛋白N端BaCBM2结构域的疏水性可能阻碍其与pNPB的结合，导致Km升高。此外，由于BaCBM2结构域具有疏水性，导致底物聚集，因此融合蛋白能够更快地与pNPB反应，导致kcat增加。
| Cutinase | pNPB | ||
| Km (mmol/L) |
kcat (s–1) | kcat/Km (mmol/(L·s)) | |
| Tfuc | 0.12±0.02 | 120.79±16.69 | 1 006.57 |
| BaCBM2-Tfuc | 0.17±0.01 | 187.48±1.35 | 1 102.81 |
为了验证BaCBM2-Tfuc融合蛋白能否提高PET的降解效率，以Tfuc为对照，测定了融合蛋白对PET的降解效率，结果见图 5。BaCBM2-Tfuc融合蛋白和Tfuc分别处理PET薄膜4 d后，根据HPLC结果分析，40 ℃下，BaCBM2-Tfuc降解PET膜的降解率是Tfuc的1.3倍；60 ℃下，BaCBM2-Tfuc降解PET膜的降解率是Tfuc的2.8倍。
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| 图 5 对PET薄膜的降解率 Fig. 5 The rate of degrading PET film. |
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王宏阳等[16]报道经耐碱性菌株睾丸酮丛毛单胞菌处理后的PET纤维，失重率为0.41%。日本学者[10]发现一株新的菌株大阪伊德氏杆菌(Ideonella sakaiensis) 201-F6，能够以0.13 mg/d的速率降解PET薄膜。张瑶等[11]研究发现，利用具有PET基材结合能力的碳水化合物结合模块CenA构建角质酶Tfuc-CenA融合蛋白，可将PET降解效率提高1.5倍。对比已有研究，本方法在一定程度上提高了Tfuc对PET的降解效率，优于直接微生物降解和张瑶的Tfuc-CenA融合蛋白。
2.5.2 SEM检测空白对照组(图 6A) 表面光滑。Tfuc处理4 d，表面变得粗糙，并有碎裂及轻微侵蚀现象(图 6B)。BaCBM2-Tfuc融合蛋白经同样条件处理4 d，表面粗糙程度加深，有明显凹槽，呈现大面积侵蚀现象(图 6C)。SEM结果进一步说明碳水化合物结合模块可以提高酶对不溶性PET膜的吸附率，增加PET膜表面酶的浓度，从而提高对PET的降解效率。
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| 图 6 PET薄膜扫描电镜图A：未处理；B：Tfuc角质酶处理；C：BaCBM2-Tfuc处理(8 000×) Fig. 6 SEM image of PET film. (A) Untreated. (B) Tfuc treated. (C) BaCBM2-Tfuc treated (8 000×). |
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通过共聚焦显微镜检测到BaCBM2对PET有一定的结合能力。然后利用MEGAWHOP PCR技术构建融合蛋白BaCBM2-Tfuc。BaCBM2-Tfuc的最适pH为8.0，最适温度为80 ℃。通过对pNPB的动力学测定表明，相比于Tfuc，BaCBM2-Tfuc对pNPB的Km及kcat均有所增加。融合蛋白BaCBM2-Tfuc在60 ℃(Tfuc最适温度) 下半衰期为30 h，对PET膜的降解率是Tfuc的2.8倍。本研究表明通过添加BaCBM2可以有效提高Tfuc对PET表面的结合能力，从而促进PET降解，为废弃PET的生物降解提供了技术支持。
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