造纸工业是拉动国民经济增长和促进社会发展的重要基础原材料支柱产业之一。近几年，中国已成为全球最大的纸产品生产国和废纸回收国^[1]。与此同时，随着森林资源保护力度的加大，以及森林原木砍伐的减少，废纸回收利用越来越受到人们的重视。废纸回收再利用主要是将废纸进行回收后得到的二次纤维经过一系列加工以生产再生纸，此过程不仅可以节约大量植物原料、能源，降低成本，而且有利于环境保护^[2]。

随着废纸回收利用率的不断提高以及制浆造纸白水循环系统封闭程度的不断增加，废纸回收过程中的胶黏物问题日趋严重，对再生纸的实际生产造成了严重影响^[3]。胶黏物通常是指二次纤维回收过程中产生的各种各样的沉积物^[4]。胶黏物的沉积会导致再生纸质量和生产效率的降低。控制纸浆中胶黏物的方法主要有机械法^[5]、化学法^[6]和生物法^[7]。目前，胶黏物的处理还是以传统的化学法为主，主要是通过化学吸附、改性、分散、固定和表面钝化等作用来达到控制胶黏物的目的，但成本过高，且存在二次污染等问题。因此，具有高效、专一、无污染等优势的生物酶法在胶黏物控制中的应用逐渐受到国内外造纸行业的重视。

生物酶法主要是通过酶解胶黏物组分中的酯键，降低胶黏物黏性，减少胶黏物粒径，进而防止胶黏物的絮凝。在处理胶黏物的诸多生物酶中，酯酶的效果最为显著，且应用最为广泛^[8]。角质酶属于丝氨酸酯酶，是一种可以降解角质的水解酶^[9]，后续研究发现角质酶对于可溶性酯、不溶性甘油三酯及各类聚酯都具有降解作用，是一种多功能酶^[10]。Hong等^[11]研究发现，角质酶对胶黏物的主要成分聚丙烯酸酯有一定的降解作用，可以通过水解聚丙烯酸酯的酯键，防止聚酯絮集。

胶黏物在水相环境中主要以固体形式存在，而角质酶的催化活性中心与固体长链聚酯的结合能力有限。锚定肽能有效提高目的蛋白对特定底物的结合能力，且不会引起反应体系理化条件的变化^[12]。Rübsam等^[13]发现锚定肽LCI对聚丙烯有很强的结合能力。Islam等^[14]将锚定肽Tachystatin A2 (TA2) 与角质酶Tcur1278构建成融合蛋白，对聚氨酯纳米颗粒的降解效率是Tcur1278野生型的6.6倍。因此，将角质酶和能与胶黏物聚酯结合的锚定肽连接，有助于提高角质酶对胶黏物的结合效率，从而提高降解效率。

本研究将特异性腐质霉(Humicola insolens) 来源的角质酶HiC和锚定肽TA2构建融合蛋白HiC-TA2，经过毕赤酵母(Pichia pastoris) KM71发酵表达后表征HiC-TA2的酶学性质，并将HiC-TA2对胶黏物的模式底物聚丙烯酸乙酯(PEA) 的降解效果进行了表征。

1 材料与方法 1.1 菌种和质粒

大肠杆菌(Escherichia coli) JM 109和毕赤酵母(Pichia pastoris) KM71为本实验室前期保藏，重组质粒pPIC9K-HiC由本实验室前期构建并保藏^[15]，TA2锚定肽和连接肽基因由上海天霖生物科技有限公司合成并拼接在pET-20b表达载体上。

1.2 材料与仪器

酵母粉、蛋白胨购自英国Oxoid公司；对硝基苯丁酸酯(pNPB)、PEA购自美国Sigma- Aldrich公司，其中PEA的分子量在17 000 Da左右；2×Phanta Max Master Mix、蛋白marker、DNA marker购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒购于碧云天生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；其他国产分析纯试剂均购自国药集团。

PTC-200型核酸扩增仪购于美国MJ Research公司；DYY-6C型核酸电泳仪购于北京六一电泳仪厂；蛋白电泳仪、凝胶成像仪购于美国Bio-Rad公司；恒温振荡培养箱购于上海知楚仪器；紫外可见分光光度计购于日本Shimadzu公司；GC-2030AF型气相色谱仪购自日本岛津公司；纳米粒度及ZETA电位分析仪购于英国马尔文仪器有限公司。

1.3 培养基

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，固体培养基另添加琼脂粉15.0。

YPD培养基(g/L)：胰蛋白胨20.0，酵母提取物10.0，葡萄糖20.0。

MD固体培养基(g/L)：琼脂粉15.0，葡萄糖20.0，生物素4.0×10^–4，YNB 13.4。

BMMY培养基(g/L)：酵母提取物10.0，YNB 13.4，生物素4.0×10^–4，胰蛋白胨20.0。

BMGY培养基(g/L)：胰蛋白胨20.0，YNB 13.4，酵母提取物10.0，生物素4.0×10^–4，甘油10.0。

1.4 PCR扩增目的基因及重组质粒的构建

实验涉及的引物如表 1所示。利用PCR扩增TA2和连接肽基因。PCR反应体系(50 μL)：2×Phanta Max Master Mix (25 μL)，TA2和连接肽基因(1 μL)，引物HiC-TA2-F (10 μmol/L, 0.5 μL)，引物HiC-TA2-R (10 μmol/L, 0.5 μL)，ddH₂O (23 μL)。PCR扩增条件为：预变性：94 ℃，4 min；变性：98 ℃，10 s；退火：55 ℃，30 s；延伸：72 ℃，30 s；充分延伸：72 ℃，10 min；4 ℃，保存。其中变性-退火-延伸重复30个循环。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，随后以胶回收的DNA片段作为Mega primer，用大引物全质粒扩增法(Megaprimer PCR of whole plasmids, MEGAWHOP)^[16]构建重组质粒pPIC9K-HiC-TA2。PCR反应体系(50 μL)：2× Phanta Max Master Mix (25 μL)，Mega primer (2 μL)，质粒DNA模板pPIC9K-HiC (0.5 μL)，ddH₂O (22.5 μL)。PCR扩增条件为：预热：72 ℃，5 min；预变性：98 ℃，2 min；变性：98 ℃，30 s；退火：55 ℃，30 s；延伸：72 ℃，6 min；充分延伸：72 ℃，10 min；4 ℃，保存。其中变性-退火-延伸重复25个循环。37 ℃下，将上述PCR产物用DpnⅠ处理2 h，随后经热激转化至E. coli JM109，挑取单菌落测序。

1.5 重组质粒的转化及毕赤酵母转化子的筛选与摇瓶发酵

将测序成功的重组质粒pPIC9K-HiC-TA2进行线性化处理。线性化的体系为(10 μL)：10×L缓冲液(1 μL)，质粒(7 μL)，ddH₂O (1 μL)，SacⅠ (1 μL)。将上述体系加入到1.5 mL EP管中，放置于37 ℃恒温水浴锅中酶切2 h，将处理后的质粒经电击转化导入到毕赤酵母KM71的感受态细胞中，1 mol/L山梨醇复苏1.5 h后涂布在MD固体平板上，30 ℃培养2–3 d。

将已在MD平板上长成单菌落的毕赤酵母用灭菌枪头挑取到浓度不同的G418 YPD平板上进行筛选，点种完成后置于30 ℃恒温培养箱培养。挑取在高浓度G418板仍然生长的20株单菌落到10 mL的YPD培养基中，30 ℃培养1 d。之后从各个YPD培养基中取2.5 mL菌液接种到50 mL的BMGY培养基中，30 ℃培养1 d，同时保种到甘油管。之后在超净台中将50 mL培养液全部倒入已经灭菌好的离心管中，封口，5 000 r/min，离心5 min。去掉上清，将菌体通过吹吸的方式转移进25 mL的BMMY培养基中，并加入375 μL甲醇。30 ℃培养，每隔24 h补加250 μL的甲醇，共培养4 d。之后测定上清液酶活，上清液即为重组酶的酶液，酶活高的即为毕赤酵母的高拷贝转化子。

1.6 角质酶的酶活测定

采用连续分光光度法测定角质酶的酶活^[17]。反应总体系为1.5 mL，其中包括30 μL角质酶的酶液(蛋白浓度在5–10 mg/L之间) 和1 470 μL含50 mmol/L硫磺脱氧胆酸钠与10 mmol/L pNPB的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)；将反应体系于37 ℃下进行反应，反应过程中，通过紫外分光光度计检测反应液在波长405 nm处的吸光度，以记录对硝基酚的生成速率。

角质酶酶活的定义为：在37 ℃下，每分钟催化pNPB水解生成1 μmol对硝基酚的酶量即为一个酶活力单位(1 U)。

1.7 蛋白纯化方法

(1) 透析：将装有发酵液的透析袋置于缓冲液中透析过夜。将透析完后的酶液用孔径为0.22 μm的无机相滤膜过滤。

(2) 阴离子交换柱MonoQ纯化：阴离子交换柱MonoQ先用去离子水冲洗5个柱体积，再用缓冲液A (50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 8.5) 平衡。将样品完全吸入阴离子交换柱后，使用缓冲液A冲洗3–5个柱体积来洗去未结合的蛋白；用缓冲液B (缓冲液A+1 mol/L NaCl) 进行梯度洗脱，流速为1 mL/min。在波长280 nm下利用紫外进行检测，收集蛋白浓度 > 50个单位的蛋白峰洗脱液。对收集到的蛋白样品用SDS-PAGE进行分析。

(3) 纯化完成后，依次用去离子水、0.5 mol/L的NaOH、去离子水对阴离子交换柱进行冲洗，最后保存于20%乙醇中。

1.8 酶学性质研究 1.8.1 最适pH和pH稳定性的测定

最适pH：分别在不同pH条件下(pH 6.0–9.0) 测定角质酶的酶活，定义最高点酶活为100%，其余点的酶活与之按百分比计算其相对酶活。缓冲体系为：Tris-HCl缓冲体系(pH 7.0–9.0)、磷酸钾缓冲体系(6.0–7.0)。

pH稳定性：37 ℃下，将一定量的重组酶的酶液分别于pH 5.0–10.0的缓冲液中孵育72 h后测定酶活。将孵育前酶活设为100%，后续时间点的酶活与之按百分比计算其相对酶活。所用缓冲液的体系为：磷酸钾缓冲液(pH 5.0–6.0)、Tris-HCl缓冲液(pH 7.0–8.0) 和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0–10.0)。

1.8.2 最适温度和温度稳定性的测定

最适温度：在最适pH下，分别测定等量酶液在不同温度条件下(30–90 ℃) 的酶活，定义最高酶活为100%，计算不同温度条件下的相对酶活。

温度稳定性：将酶液放置于30 ℃和50 ℃中，定时取样测其酶活。定义0 h的酶活为100%，剩余酶液酶活与之按百分比计算其相对酶活。

1.9 水解PEA的性能表征 1.9.1 PEA浊液经水解后的浊度测定

(1) PEA溶液的配制：取1 g PEA至丙酮中，用丙酮定容至100 mL，摇匀得到浓度为1%的溶液，备用。

(2) 取1 mL浓度为1%的PEA溶液于15 mL旋盖玻璃瓶中，再加入用Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L，pH 8.0) 稀释过的融合蛋白溶液，使终体积为10 mL，实验组和对照组加入的目的蛋白含量均为2.5 nmol。在50 ℃、150 r/min的水浴摇床中反应6 h，利用分光光度计测定波长600 nm处的反应体系的浊度变化。定义初始反应时的浊度为100%，反应时各时间点的浊度与之按百分比计算其相对浊度。空白对照组不加酶，实验组为HiC酶液处理组和HiC-TA2融合蛋白酶液处理组，每个实验组做3个平行对照。

(3) 绘制反应体系的相对浊度变化图，判断PEA的处理效果。

1.9.2 PEA浊液经水解后的粒径测定

将上述反应结束的反应液进行煮沸灭酶，冷却后取1 mL反应液进行离心，并使用0.22 μm孔径大小的水相滤头对上清液进行过滤。过滤后的反应液使用纳米粒度及ZETA电位分析仪来检测体系的粒径，每个实验组做3个平行对照。

1.9.3 水解产物的测定

将上述反应结束后的反应液使用顶空气相色谱法分析乙醇含量。色谱柱：DB-WAX (30 m× 0.32 m×0.25 μm)，柱温箱最高温度为180 ℃，分流比为5︰1，柱温为40 ℃，柱流量为1.2 mL/min，FID检测器温度为260 ℃，空气、氢气、尾吹气的流量比分别为400 mL/min、40 mL/min、30 mL/min。

2 结果与分析 2.1 重组质粒pPIC9K-HiC-TA2的构建

利用MEGAWHOP构建重组质粒pPIC9K-HiC-TA2的过程如图 1所示。

2.2 工程菌P. pastoris KM71/pPIC9K-HiC- TA2的转化子筛选与摇瓶发酵

经过平板筛选和摇瓶筛选，最终筛选到的对pNPB的酶活最高的转化子的酶活为21 U/mL。通过超滤管离心来浓缩HiC-TA2酶液并进行阴离子交换柱纯化，并对纯化后的HiC-TA2进行SDS-PAGE分析和比酶活测定，结果如图 2所示。HiC的蛋白大小约为20 kDa，符合之前文献报道的结果。融合蛋白HiC-TA2的蛋白大小约为30 kDa，符合预测结果，比酶活为1 900 U/mg。

2.3 HiC-TA2的酶学性质测定 2.3.1 最适温度和温度稳定性的测定

按1.7中所述方法测定HiC-TA2和HiC的最适温度和温度稳定性。结果如图 3–4所示，在30–80 ℃的范围内，HiC-TA2的酶活随着温度的升高而升高，80 ℃时到达最高值，90 ℃时就有了明显下降，因此HiC-TA2的最适温度为80 ℃，与HiC相似。

在温度稳定性方面，HiC-TA2和HiC在50 ℃放置48 h之内均出现了酶活提高的现象，与之前报道过的热激活现象相符^[18]。随后，在30 ℃和50 ℃的环境下，HiC-TA2的酶活随时间的延长而降低，到达240 h左右已低于50%，与HiC的相对酶活变化相似。由此可见，TA2的融合对HiC-TA2的最适温度和温度稳定性均没有明显的影响。

2.3.2 最适pH和pH稳定性的测定

按1.8中所述方法测定HiC-TA2和HiC的最适pH和pH稳定性。结果如图 5–6所示，在pH 6.0–8.5的范围内，HiC-TA2的酶活随着pH的升高而升高，在pH 8.0–8.5时到达最高值，在pH 9.0时会略有下降，与HiC相同。由此可见HiC-TA2与HiC相同，为弱碱性角质酶，最适pH范围为8.0–8.5。

在pH稳定性方面，HiC-TA2和HiC都是在pH 9.0时有最好的稳定性。而HiC-TA2在各pH下的相对酶活始终高于HiC，证明HiC-TA2的pH稳定性高于HiC。

2.4 PEA的降解性能表征 2.4.1 PEA浊液经水解后的浊度变化

如图 7所示，空白对照组的浊度随时间变化一直在缓慢下降，最终在6 h后降为71%。这是因为PEA不溶于水，因此当底物丙酮溶液加入水相反应体系后，PEA会析出，导致反应体系变浑浊。在反应过程中一部分底物会沉淀，导致浊度下降。HiC组的浊度在反应0.5 h后趋于稳定，最终体系的相对浊度稳定在31%。这是因为当底物被酶降解时产物为聚丙烯和乙醇，都是溶于水的有机物，且不会和其他物质发生聚集，因此反应体系的浊度也会下降。浊度下降的越明显，证明酶解效果越好。HiC-TA2组在0.5 h后趋于稳定，由于底物被降解，最终体系的相对浊度稳定在12%，是HiC组的降解效率的1.5倍。图 8为反应后的实物图片，浊度越低反应体系的透光度越高。从图片上能明显看出，在透光度上，HiC-TA2 > HiC > 空白对照。

2.4.2 PEA浊液经过水解后的粒径变化

除了通过浊度变化来体现PEA水解前后聚合物的沉积情况以外，粒径大小也是体现聚合物沉积趋势的方式之一。如表 2所示，空白对照组的粒径较初始相比降低了7.6 nm，HiC处理后体系的粒径减小了50.6 nm，而HiC-TA2处理后体系的粒径减小了299.1 nm。这是因为随着水解的进行，粒子团逐渐变小，PEA相互作用力减弱，粒子团聚集能力变弱。因此，粒径越小证明水解效果越好。HiC-TA2处理后体系的粒径减小值是HiC的6.8倍。由此可见，TA2有助于增强HiC对PEA的水解。

2.4.3 PEA浊液水解后的产物测定

PEA的酯键被酶水解后，分解产物为聚丙烯和乙醇。因此，检测反应体系中的乙醇含量也能作为评估反应进行程度的标准之一。顶空气相色谱法检测乙醇含量的结果如表 3所示。空白对照组也含有微量的乙醇，可能是由于在终止反应的煮沸过程中PEA的部分酯键被高温破坏导致断裂，从而生成乙醇。HiC组的乙醇含量略高于空白对照组，可以证明酯解反应确实在进行。HiC-TA2组的乙醇含量最高，是HiC组的1.4倍，证明HiC-TA2组的PEA酯解程度比HiC组更彻底。由此可见，TA2有助于增强HiC对PEA的水解。

3 结论

生物酶法在胶黏物控制中的应用越来越受到国内外造纸行业的重视，而角质酶对酯键的高效催化能力使其在胶黏物控制方向具有很大的潜力。本实验将HiC的基因与TA2的基因通过MEGAWHOP技术拼接在表达载体pPIC9K上，并转化进毕赤酵母KM71中进行发酵表达，最终得到了融合蛋白HiC-TA2。HiC-TA2的最适温度、温度稳定性和最适pH与HiC相似，pH稳定性略有提高。HiC-TA2对PEA浊液的降解效率是HiC的1.5倍，反应体系的粒径减小值是HiC的6.8倍，产物乙醇的生成量是HiC的1.4倍。本研究表明TA2有助于提高HiC对PEA的水解效率，对于生物法降解再生纸胶黏物的研究具有重要的理论和实践意义。