在制备转基因小鼠的过程中通常使用质粒DNA和慢病毒载体法来构建转基因载体，通过慢病毒载体制备转基因动物的过程可能会激活有害基因，存在安全问题。因此转座子系统作为一个新的转基因载体被研究者熟知。其中PiggyBac转座子^[1]以其独特的“剪切-粘贴”机制，在转座酶的作用下精准地把外源基因从原位置解离下来重新整合到新的染色体上。研究表明^[2]，PB转座子作为目前常用的哺乳动物基因工程的研究工具，在癌基因的发现、基因修饰及转基因动物制备等有重要意义。PB具有较高的转导效率和运载能力，这一特性使得PB能够实现转入基因的高效表达，达到制作转基因动物的目的。

多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs) 是一类双键(亦称烯键) 含量大于等于2且碳链长度多于18个碳原子的脂肪酸，参与人体多种生理反应，其中以ω-6系和ω-3系最为重要。常见的ω-6系脂肪酸有亚油酸(18:2n–6, LA) 和花生四烯酸(20:4n–6, ARA)，ω-3系有α-亚麻酸(18:3n-3, ALA)、二十碳五烯酸(20:5n–3, EPA) 和二十二碳六烯酸(22:6n–3, DHA) 等。多不饱和脂肪酸因其独特的生物学特性被广泛研究者关注并普遍应用于实际生活中，其中消费者普遍认同了ALA、ARA以及DHA的功能^[3-4]。然而有研究表明，过多地食用ω-6不饱和脂肪酸会引起肥胖、脂质代谢紊乱等一系列问题^[5-6]，其中ARA参与一些炎症机制的反应。随着研究的深入，有大量研究证实，ω-3系多不饱和脂肪酸在人体发挥着更加积极的作用，它不仅在促进大脑等组织器官的发育和功能维持等方面有着重要的作用^[7-8]，而且在预防和治疗心血管疾病(CVD)、脂代谢疾病、癌症预后及预防椎间盘突出等多种疾病方面也有着特殊的功效^[9-13]。膳食中合理添加ω-3多不饱和脂肪酸会使体重减轻，改善某些疾病的预后，癌症病人饮食添加ω-3 PUFAs会协同提高抗癌药物的疗效^[14]。然而人体不能自身合成只能从食物中摄取多不饱和脂肪酸，食物来源的ω-3 PUFAs又仅存在于藻类和深海鱼类中，导致现代人类ω-6 PUFAs与ω-3 PUFAs的摄入比严重不均衡，最终出现大量的肥胖和脂类代谢相关的疾病。如何平衡人体内ω-6 PUFAs与ω-3 PUFAs是研究者重点关注的问题。

2004年Kang等^[15]首次在线虫Caenorhabditis elegans体内发现的Δ15去饱和酶基因(该基因能表达ω-3脂肪酸去饱和酶的活性，哺乳动物体内不含有该基因) 通过显微注射法转入小鼠体内，可以将小鼠体内ω-6 PUFAs有效地转化为ω-3 PUFAs^[16]。因此Δ15 Des转基因小鼠是一个研究ω-3 PUFAs的生物学功能的重要型动物模型。刘晶等^[17]构建了基于乳腺特异性表达的转基因载体pBC1-Fat-1获得了转Δ15 Des的转基因小鼠，而刘晓蕾等^[18]采用构建pEF-Fat-1重组质粒的方法制备了表达Δ15 Des的转基因小鼠，但阳性率较低，注射的738只小鼠，存活42只且只有11只阳性小鼠，其中阳性小鼠只有4只是有基因活性的，基因活性只有36%。与前人的制备方法不同的是本研究利用PiggyBAc转座子构建的载体将来源于线虫的Δ15-脂肪酸去饱和酶基因导入受精卵，培育获得G0代小鼠，通过PCR筛选出F1代阳性小鼠后将小鼠多次回交、侧交，通过气相色谱和荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测Δ15 Des在小鼠体内的活性。最终在较短时间内繁育出稳定遗传的纯合子转基因小鼠。我们发现随着筛选次数的增加，Δ15 Des的活性也逐渐增加，即纯合子比杂合子表达更高的活性，进一步验证了PiggyBac转座子系统高效的转导效率和安全稳定性。

质粒piggyBac-CeN3 (实验室保存)、C57BL/6A小鼠、显微注射器、红花籽油、花生四烯酸、定制小鼠饲料(6% ARA)、DNA/RNA共提取试剂盒(天根生化科技(北京) 有限公司)、TB-Green (TaKaRa)、2*T3 super PCR Mix (TaKaRa公司)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝科技(北京) 有限公司)、Δ15 Des多克隆抗体(爱必信(上海) 生物科技有限公司定制)、HP5890气相色谱仪(昆山塞特科学仪器有限公司)。

将质粒piggyBac-CeN3与转座子载体piggyBac连接(具体操作见载体连接试剂盒说明书)，目的基因用EcoRⅠ/Bgl Ⅱ插入，元件顺序为CAG promoter-Kozak-CeN3-polyA。本实验所用动物为C57BL/6A小鼠，饲养条件：日平均温度22–26 ℃，湿度60%–80%，光照周期12 L︰12 D。选取4周龄左右的雌鼠作超排卵供体，腹腔注射5 IU孕马血精(PMS)。相隔48 h后，再注射5 IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)。待到公母鼠交配后，将去除颗粒细胞的胚胎转至M 16培养液，37 ℃、5% CO₂中培养。从受精母鼠胚胎输卵管中取得的原核期受精卵用固定吸量管固定，将纯化的载体和PiggyBac质粒混合注射入受精卵的原核中，注入时见原核膨大即为成功。最后将注射完成的胚胎重新送入母鼠输卵管中，若在输卵管内看到气泡则说明移植成功。繁育成功的小鼠14 d左右剪尾提取DNA，操作步骤参照组织基因组DNA提取试剂盒，DNA溶液储存于–20 ℃冰箱。配制25 μL的PCR体系，上下游引物各1 μL，目的基因检测引物见表 1 (其中引物BactinG-s和引物Bactin-a用于基因组内参基因的检测；引物Bactin-s和引物Bactin-a用于反转录产物内参基因的检测)。模板1 μL，2× super PCR Mix 10 μL，ddH₂O 12 μL。PCR条件为：预变性98 ℃ 30 s，变性98 ℃ 10 s，退火62 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 2 min，35个循环，目的片段为320 bp。取10 μL的PCR产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳。

PCR鉴定为阳性的首建鼠与野生型C57小鼠进行杂交得到F1子代小鼠，小鼠饲料为添加6%ARA的定制饲料，喂养8周以上。麻醉处死小鼠后取肝脏组织进行组织DNA提取，提取步骤、反应体系、引物序列和PCR反应条件同上。筛选出的阳性小鼠继续回交、与野生型小鼠侧交，直到后代小鼠PCR检测全部为阳性，判断该小鼠为纯合子。

小鼠麻醉处死后取适量肝脏、肌肉组织冻存–80 ℃用于后续试验(动物实验获得贵州医科大学实验动物伦理委员会批准，缩号：1900255)。我们取肝脏组织进行总RNA的提取，总RNA提取和reverse transcription PCR (RT-PCR) 实验操作步骤均按照天根生化科技(北京) 有限公司相关试剂说明书进行，提取的总RNA用NanoDrop^TM One/OneC超微量紫外分光光度计评估其质量和浓度，从260/280的吸光度比率来看，RNA的纯度均在1.90到2.00之间。将RNA溶液分装储存在–80 ℃备用。将总RNA中的mRNA反转录成为cDNA，定量到2 μg，每种反转录样品取1 μL用于QPCR检测。20 μL的qPCR体系为上下游引物各1 μL，TB Green 10 μL，模板1 μL，其余用DEPC水补齐。qPCR条件为：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40个循环，引物序列见表 1。目的片段为320 bp。统计学软件使用SPSS，以P < 0.05作为统计学差异显著性的判断标准，绘图采用GraphPad Prism软件。来观察Δ15 Des在小鼠体内的表达情况。

提取肝脏组织，总蛋白提取用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，具体方法参照试剂盒说明书。100 ℃水浴5 min进行蛋白变性后，–20 ℃冰箱备用。配制12%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳：80 V，30 min，120 V，90 min。转膜使用0.45 μm的PVDF膜，转膜条件(湿转)：250 mA恒流转膜2 h (冰浴)。转好的膜在TBST中快速洗脱2次，每次5 min；加5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，洗脱3次，每次10 min；1%的脱脂奶粉按照1︰1 000配制一抗，4 ℃孵育过夜；回收一抗，用TBST快速洗膜3次，每次10 min；按照1︰5 000的比例配制HRP标记的二抗，室温下孵育40 min；用TBST快速洗膜3次，每次10 min；配制ECL发光液进行曝光。选择合适的图片保存用Photoshop整理去色，Image J软件处理系统测定目标带的光密度值。

取黄豆大小的肝脏组织置于反应瓶，充分研磨后加入1 mL 14%三氟化硼/甲醇试剂(含0.005% BHT抗氧化剂) 充分混匀，100 ℃加热1 h；冷却后加1 mL ddH₂O和1 mL正己烷，剧烈混匀；将上述液体转移至5 mL玻璃离心管，3 000 r/min离心5 min；吸取上清保存于–20 ℃用于后续试验。GC检测之前对样品进行吹氮气浓缩。使用HP5890气相色谱仪进行检测。图像采集处理：采用N2000色谱数据工作站采集图谱，并处理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用多不饱和脂肪酸标准品来进行鉴定。采用面积归一法求每个峰的面积，最后得出样品中各种脂肪酸的含量。

含有Δ15 Des编码基因的PiggyBac-CeN3载体(图 1) 被注射到200枚原核期小鼠受精卵，注射卵移植到代孕母鼠，出生37只F0代幼崽(编号1#–37#)，37只小鼠存活，其中13只经PCR鉴定为整合阳性小鼠。13只整合鼠中雄性小鼠有6只(4#、7#、13#、15#、16#和21#)，雌性小鼠有7只(1#、3#、11#、12#、14#、17#和23#)。PCR鉴定结果如图 2所示。对整合小鼠DNA的PCR扩增产物进行产物测序，部分测序结果如图 3所示，通过数据库比对，测序结果与原基因组序列相一致。

图 1 PiggyBac-CeN3元件顺序图谱 Fig. 1 Schematic diagram of the PiggyBac-CeN3 element, shown in an original order of 5′→3′.

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图 2 转基因小鼠的PCR鉴定 Fig. 2 PCR identification of transgenic mice. The upper part shows the internal reference, the middle part shows the first pair of primers (TgN3-F1/TgN3-R1), and the lower part shows the detection results of the second pair of primers (TgN3-F2/TgN3-R2).

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图 3 PiggyBac-CeN3重组载体部分测序峰图 Fig. 3 Partial sequencing peak diagram of the PiggyBac-CeN3 recombinant vector.

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13只F0代小鼠分别与野生型小鼠杂交，后代通过PCR检测鉴定转基因小鼠(杂合子)，进一步通过杂合子转基因小鼠间交配、繁殖获得纯合子小鼠。在繁殖过程，取各品系PCR阳性后代小鼠(例如F0代的4#小鼠F1代称为N3-4品系) 的肝脏组织提取RNA，逆转录得到cDNA，对进一步得到的cDNA进行PCR和凝胶电泳检测，13只F0代小鼠中8只有Δ15 Des基因转录产物的表达，结果如图 4所示，阳性表达率高达61.5%，占存活小鼠的21.62%。进一步利用气相色谱分析小鼠肝脏中EPA的含量确定转基因小鼠Δ15 Des活性。通过GC分析后最终确定13只F0代小鼠中4#、7#、11#、12#、13#、14#、16#和21#的后代PCR阳性小鼠具有Δ15 Des活性，能够将ω-6多不饱和脂肪酸转化为ω-3多不饱和脂肪酸；而1#、3#、15#、17#和23#的后代PCR阳性小鼠未检测到Δ15 Des活性，不能将ω-6多不饱和脂肪酸转化为ω-3多不饱和脂肪酸。其中GC结果如图 5所示，图 5A和图 5B为我们选取的GC结果典型图谱，其中图 5A为野生型小鼠(WT)，图 5B为4#小鼠(转基因小鼠)，对比图 5A和图 5B发现，WT小鼠肝脏组织中没有ω-6多不饱和脂肪酸的转化，转基因小鼠体内的ARA (20:4n–6) 转化为EPA (22:5n–3)，且EPA进一步转化为DHA (22:6n–3)。图 5C–J为转基因后不同品系小鼠肝脏组织中ARA转化为EPA等重要脂肪酸含量变化部分，从图中可以看出每个品系的小鼠转化能力有所不同，其中除了图 5A为WT小鼠，图 5C为代表阴性小鼠的3#小鼠以外，其余全部为GC阳性小鼠。

图 4 转基因小鼠的RT-PCR鉴定 Fig. 4 Identification of transgenic mice by RT-PCR.

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图 5 各品系转基因小鼠肝脏GC鉴定结果 Fig. 5 GC identification results of transgenic mice of various strains. (A) WT mice. (B) 4# mouse. (C) 3# mouse. (D) 7# mouse. (E) 11# mouse. (F) 12# mouse. (G) 13# mouse. (H) 14# mouse. (I) 16# mouse. (J) 21# mouse. A and B are typical maps of mouse GC, while C–J only show significant changes of important fatty acids after transgenic operation. Except that A is wild type mouse and C is 3# mouse representing negative mouse, all the other mice are GC positive mice.

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通过筛选出的纯合子小鼠与野生型小鼠侧交对后代进行PCR检测，图 6为N3-16品系小鼠的PCR电泳图，后代PCR结果全部为阳性。随机选取8周左右的WT小鼠(对照组)、杂合子小鼠(HE组)、纯合子小鼠(HO组) 各5只，共15只，通过qPCR和WB分析小鼠体内Δ15 Des的表达水平。qPCR结果显示如图 7所示，与对照组相比，HE组和HO组的Δ15 Des表达水平均上调，HO组与HE组相比，Δ15 Des表达水平更高。WB结果显示如图 8所示，β-actin和Δ15 Des目的蛋白的分子量分别为57 kDa和37 kDa，1、2、3号条带分别为WT、HE、HO小鼠，其中WT没有条带，即没有Δ15 Des的表达，HE和HO均有条带，且HO的光密度值更大，与qPCR结果相一致。进一步通过GC分析WT、HE、HO组小鼠体内脂肪酸的变化，结果如图 9所示，色谱图中横坐标为各个脂肪酸出现的保留时间，根据保留时间将不同脂肪酸区分开来，与标准样品比对分析判定各个峰值所代表的是哪种脂肪酸。计算峰高×峰面积，进而得出每1种脂肪酸的百分含量，结果如表 2所示。图 9为WT组、HE组和HO组小鼠肝脏GC图，对比分析，WT组几乎没有EPA的转化，HE组和HO组存在从ARA到EPA的转化，且HO组转化得更完全，体内几乎没有ARA。去除饲料中ω-3 PUFAs的影响，根据表 2计算每组小鼠EPA/ARA的比值，WT组为0%，HE组为14%，HO组为25%，HO组比HE组的EPA转化率高11%，且EPA转化为更长链的DHA，因此我们得出结论Δ15 Des能将小鼠体内ARA转化为EPA进而转化为DHA，并且纯合的小鼠比杂合小鼠转化效率更高。

图 6 纯合子转基因小鼠侧交后代的PCR鉴定 Fig. 6 PCR identification of lateral cross progeny of homozygous transgenic mice. There are 4 offspring in lanes 1–4 respectively.

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图 7 qPCR检测Δ15 Des在小鼠肝脏组织中的转录表达*：P < 0.05，**：P < 0.01 Fig. 7 Detection of transcription and expression of Δ15 Des in mouse liver by qPCR. The abscissa is the group, and the ordinate is the standardized value (*: P < 0.05, **: P < 0.01).

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图 8 小鼠肝脏组织Western blotting图 Fig. 8 Western blotting analysis of mouse liver tissue. 1: WT; 2: HE; 3: HO.

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图 9 小鼠肝脏组织中多不饱和脂肪酸检测色谱图 Fig. 9 Chromatogram of polyunsaturated fatty acids in liver tissue. (A) WT. (B) HE. (C) HO.

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转基因动物的制备泛指用特定的途径和方法将外源基因直接导入动物体内并稳定遗传给后代的技术，目前转基因动物在研究人类基因结构和功能之间的关系、细胞生长和发育的潜力、基因编辑、生物反应器的载体等方面具有重要的意义和作用^[19-21]。研究工作人员分析发现，目前对于一些传统转基因研究方法还存在一些困难，比如利用质粒的随机整合获得转基因动物在其基因传代途中可能会出现多种遗传信号丢失、位置突变效应等，这会直接导致外源基因的表达效率大大减弱。慢病毒载体制备法过程操作烦琐，同时安全问题值得人们警觉^[22]。新型的PiggyBac转座子系统是指在原核和真核生物基因组上可以进行位置转换的DNA片段。相较于传统转座子系统，有多种优点，例如：更高的整合效率、更高的目的基因表达概率、更大的目的片段的插入、更“精确”拷贝数的插入，以及可自由移除插入片段，已广泛应用于转基因及功能基因研究中。

哺乳动物体内通过延长酶和去饱和酶将短链脂肪酸转化为更长链的脂肪酸^[23]，然而缺乏将ω-6 PUFAs转化为ω-3 PUFAs的酶，来源于线虫的Δ15 Des能表达ω-3脂肪酸去饱和酶的活性^[13]，将ω-6 PUFAs转化为ω-3 PUFAs。因此，本研究所构建的Δ15 Des转基因小鼠模型自身可以将体内ω-6 PUFAs转化为ω-3 PUFAs，从而使动物的组织和器官中富含ω-3 PUFAs。Δ15 Des转基因小鼠模型可以减少因长期喂养不同饲料所带来的麻烦，节省时间与经费，为研究PUFAs的功能和代谢提供了一种良好的动物模型。我们检测新生小鼠和衰老小鼠发现，Δ15 Des的基因表达持续发生在整个小鼠的生命周期。

本研究是采用显微注射法将PiggyBac转座子构建的Δ15 Des载体直接注入小鼠受精卵的原核内，并且导入代孕母鼠体内，最终产下Δ15 Des转基因小鼠。我们共注射了200只小鼠，最终获得37只阳性小鼠，在37只存活小鼠中，其中13只经PCR鉴定为阳性转基因小鼠，阳性率为35.1%。在13只阳性小鼠中，有8只小鼠有转基因活性，基因活性率高达61.53%。通过阳性小鼠回交、侧交，多次传代筛选出杂合和纯合的转基因小鼠，发现杂合子和纯合子Δ15 Des表达均上调，纯合子与杂合子相比，Δ15 Des表达水平高11%。与质粒构建的载体在阳性率和基因活性方面都有极大的提高，并且转Δ15Des基因后对小鼠的表型和行为学并无明显改变，因此我们得出结论：与一般转基因载体相比，PB转座子具有周期短、安全、高效、负载容量大的特点，我们利用PB所构建的Δ15 Des转基因小鼠在杂合和纯合时表现不同的性状，纯合子表现出更高的基因活性。因此PiggyBac转座子系统是一个良好的构建转基因动物模型的方法，Δ15 Des转基因小鼠也在研究PUFAs与疾病的关系中发挥重要作用。