艰难梭菌(Clostridium difficile) 是一种严格厌氧生长的革兰阳性梭状芽胞杆菌，为肠道中的常在菌群，属于条件致病菌^[1]。感染后可导致人和多种动物(猪、牛、禽等) 抗生素相关性腹泻(antibiotic associated diarrhea, AAD)或假膜性结肠炎(pseudomembranous colitis, PMC)的发生^[2]。艰难梭菌定殖于宿主的盲肠和结肠，其芽胞抵抗力强，在外界环境下可存活数月^[2-3]。动物源食品感染是艰难梭菌在人和动物之间传播的重要途径，对澳大利亚和荷兰分离的猪源和人源艰难梭菌进行基因组分析表明，艰难梭菌在人群和猪群之间广泛传播^[4]。有研究报道，在屠宰加工过程中，艰难梭菌的检出率高达9%，对人类健康带来威胁^[5-6]。艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI) 在澳大利亚(67%)^[7]、德国(73%)^[8]、斯洛文尼亚(50.9%)^[9]和捷克(56.7%)^[10]等猪肉生产国普遍存在。我国对于艰难梭菌的分型多采用多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)，是基于7个管家基因序列对所分离的菌株进行分型的方法，并且该方法具有国际数据库，利于数据的交流。2005年荷兰首次报道分离出人源ST11型艰难梭菌，随后3年内ST11型艰难梭菌感染率提升了10%，并且在欧洲、北美和中国台湾等地的家畜中均分离出ST11型艰难梭菌^[11]。通过对人源、猪源、鸭源的ST11型艰难梭菌进行全基因组测序分析，进一步证实了不同来源的ST11型艰难梭菌具有遗传相似性^[4]。中国作为猪肉生产和消费大国，对于猪群CDI的研究报道并不多，这对我国养猪业的安全生产和人民群众的健康留下隐患。因此，对于猪群中艰难梭菌的检测及调查研究亟待开展，为了能在养殖场进行大规模的艰难梭菌检测，提高检测结果的准确性，需要建立针对猪源艰难梭菌的检测方法。

艰难梭菌主要的致病因子是毒素A (TcdA)、毒素B (TcdB) 和二元毒素(CDT)。有研究表明，TcdB毒素的毒力是TcdA毒素的10倍，且临床上只产TcdB毒素的菌株可以引起AAD的暴发^{[2, 12]}。CDT毒素主要由高毒力菌株分泌，具有增强TcdA和TcdB毒素毒力的作用^[2]。研究发现，产CDT毒素的菌株可使TcdA毒素的表达量升高16倍，使TcdB毒素的表达量升高23倍^[13]。ST11型艰难梭菌能分泌TcdA、TcdB和CDT 3种毒素，且具有更强的传染性，是国际上流行最广泛、危害最大的亚型之一^[11]。目前，关于艰难梭菌亚单位疫苗的抗原和诊断抗原的研究主要集中在毒素蛋白的受体结合域(receptor binding domain, RBD)^[14]。Genth等^[15]将TcdB毒素的RBD蛋白进行重组表达，发现TcdB毒素和抗RBD的血清结合后能使肠上皮细胞免受细胞病变的影响，说明RBD蛋白具有作为候选亚单位疫苗和诊断抗原的潜力。因此，以RBD蛋白作为诊断抗原，制备针对RBD蛋白的单克隆抗体，对于建立可靠的血清学诊断方法具有重要意义。

目前，国内对于艰难梭菌的研究大多集中在医源性感染，对于养殖业艰难梭菌的研究报道极少，并且国内缺乏可用于兽医临床检测艰难梭菌的方法^[16]。细胞毒性检测(cytotoxicity assay, CTA) 和产毒菌株培养(toxinogenic bacterium culture, TC) 作为艰难梭菌检测的金标准，操作费时耗力，并且目前市场上CTA和TC的检测试剂盒大都用于人的临床样本检测，价格昂贵，不适合用于国内养殖业对艰难梭菌的大规模检测^[16-18]。因此，建立一种特异、敏感、经济、可用于兽医临床检测艰难梭菌的方法亟待解决。本研究以制备的猪源ST11型艰难梭菌TcdB毒素RBD蛋白的单克隆抗体为检测抗体、兔多克隆抗体为捕获抗体，建立了一种特异、敏感、可用于兽医临床检测ST11型艰难梭菌的双抗体夹心ELISA，以期为我国猪场高致病性的ST11型艰难梭菌的流行病学调查提供可靠的血清学检测方法。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、质粒及细胞

猪源艰难梭菌ST11型C1、C2、P1分离株，ST3型P2分离株，ST35型LW3、LW6分离株，ST109型Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10分离株，由本实验室分离并保存^[19]；pET-32a(+) 质粒由本实验室保存并提供；SP2/0骨髓瘤细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；大肠杆菌BL21(DE3)、DH5α购自北京博迈德基因技术有限公司。

1.1.2 试验动物

6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠、2 kg SPF级雌性新西兰兔，均购自成都达硕实验动物有限公司(实验动物许可证号SCXK(川2020-030))，所有动物实验方案均经四川农业大学实验动物伦理与福利委员会审核通过。

1.1.3 主要试剂

DMEM培养基、50×HAT、100×HT购自Gibco公司，羊抗小鼠IgG/HRP、小鼠抗组氨酸标签单克隆抗体购自博士德生物工程有限公司，小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装试剂盒购自洛阳佰泰科生物技术公司，PrimeSTAR^®Max DNA Polymerase购自宝生物工程(大连) 有限公司，MONTANIDE GEL 02 PR佐剂购自Seppic公司，弗氏不完全佐剂购自Sigma公司，细菌基因组提取试剂盒购自天根生物科技(北京) 有限公司，5 mL镍柱购自成都百乐科技有限公司，谷氨酸脱氢酶蛋白(GDH) 由本实验室保存并提供。

1.2 方法 1.2.1 rbd基因片段的扩增及重组质粒的构建

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取艰难梭菌C1分离株的基因组DNA，保存于−20 ℃备用。参照艰难梭菌TcdB毒素rbd基因(NMDC number：NMDCN0000LT8) 序列设计扩增引物，引物信息如表 1所示。PCR扩增反应体系为(25 µL)：艰难梭菌C1基因组DNA 1 µL，PrimeSTAR^®Max DNA Polymerase 12.5 µL，上下游引物各1 µL，用ddH₂O补齐。PCR反应条件：98 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，34个循环；72 ℃延伸5 min。随后对PCR产物进行纯化，与双酶切(BamH I和Sac I)的pET-32a(+) 载体进行连接，构建重组质粒pET-32a(+)-RBD。最后经PCR、双酶切和测序鉴定重组质粒是否构建成功。

1.2.2 RBD融合蛋白诱导表达、纯化与鉴定

将重组质粒pET-32a(+)-RBD转入大肠杆菌BL21(DE3) 中，培养至OD₆₀₀为0.8时，加入1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，25 ℃、180 r/min诱导12 h。诱导后的重组大肠杆菌超声破碎后，用镍柱对上清进行纯化，采用SDS-PAGE分析RBD蛋白的纯化情况。纯化后的RBD蛋白用磷酸盐缓冲液(PBS) 透析3次，用30 kDa超滤管对蛋白进行浓缩并测定浓度，后将浓缩的RBD蛋白分装，−80 ℃保存备用。

1.2.3 小鼠免疫

将RBD蛋白与MONTANIDE GEL 02 PR佐剂按体积比10︰1混匀，对6周龄BALB/c雌鼠进行背部皮下多点注射免疫，免疫剂量为100 µg/只，每次免疫间隔14 d，三免后7 d采集小鼠血清测定抗体效价。细胞融合前3 d，用RBD蛋白进行加强免疫，免疫剂量为100 µg/只，3 d后取血清抗体效价最高的小鼠脾脏细胞进行细胞融合。

1.2.4 细胞融合与阳性杂交瘤细胞筛选

将生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞进行融合，同时制备饲养层细胞。融合细胞用含10%胎牛血清的HAT选择培养基进行培养。以RBD蛋白为正向筛选抗原、GDH蛋白为负向筛选抗原，采用间接ELISA对融合后杂交瘤细胞进行初步筛选及亚克隆。筛选出OD₄₅₀值最大的阳性孔细胞，予以4–6次的有限稀释克隆培养，直至筛选出阳性率100%的杂交瘤细胞，然后通过姬姆萨染色鉴定杂交瘤细胞染色体数目。将阳性杂交瘤细胞连续培养90 d后测定细胞培养上清的抗体效价；同时将冻存的杂交瘤细胞在第90天和第180天时复苏，测定细胞培养上清的抗体效价，检测杂交瘤细胞分泌的特异性单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)的稳定性。

1.2.5 单克隆抗体亚类鉴定

取阳性杂交瘤细胞培养上清，使用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装试剂盒对单克隆抗体进行亚类鉴定。

1.2.6 腹水制备与纯化

对6周龄BALB/c雌鼠腹腔注射200 µL弗氏不完全佐剂，使其致敏，7 d后给予小鼠腹腔注射10⁶个/500 µL的阳性杂交瘤细胞，待小鼠腹腔明显肿胀后采集腹水。收集的腹水采用硫酸铵盐析进行初提^[16]，后用Protein G亲和层析进一步纯化IgG抗体，并用SDS-PAGE分析纯化效果。

1.2.7 单克隆抗体相对亲和力与特异性检测

利用间接ELISA测定阳性杂交瘤细胞的培养上清及经亲和层析纯化后腹水的抗体效价，检测单克隆抗体的相对亲和力。用Western blotting方法对猪源ST11、ST3、ST35、ST109型艰难梭菌培养上清以及RBD和GDH蛋白对单克隆抗体进行特异性检测。

1.2.8 兔抗RBD蛋白多克隆抗体制备

将RBD蛋白与MONTANIDE GEL 02 PR佐剂按体积比10︰1混匀，对新西兰兔的颈背部进行皮下多点注射免疫，免疫剂量为1 mg/只，每次免疫间隔14 d，每次免疫7 d后进行耳缘静脉采血，收集血清测定抗体效价。三免后对新西兰兔进行心脏采血，分离血清，采用硫酸铵盐析进行纯化^[16]，−80 ℃分装保存，即得到兔抗RBD蛋白多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb)。

1.2.9 双抗体夹心ELISA的最佳反应条件确定

以兔抗RBD蛋白多克隆抗体(pAb) 为捕获抗体、小鼠抗RBD蛋白单克隆抗体(mAb) 为检测抗体，运用棋盘法对双抗体夹心ELISA反应条件进行确定，当样品孔与阴性孔的OD₄₅₀比值(P/N) 最大时，确定为最佳反应条件。将捕获抗体和检测抗体按1︰1 600–1︰12 800的浓度进行2倍梯度稀释，确定捕获抗体和检测抗体的最佳配对使用浓度。兔抗RBD蛋白多克隆抗体在酶标板上按每孔1 µg/100 µL的浓度进行包被，设置0.01、0.05、0.1 mmol/L抗原包被液浓度梯度及37 ℃孵育2 h、37 ℃孵育1 h后在4 ℃孵育12 h、4 ℃孵育12 h的包被条件，确定捕获抗体最佳孵育时间；同时将检测抗体在37 ℃孵育0.5、1、1.5、2 h，确定检测抗体最佳孵育时间。将待检样品在37 ℃孵育0.5、1、1.5 h，确定待检样品的最佳孵育时间。随后设置浓度为1.5%、3%、5%的脱脂奶粉(封闭液)，在37 ℃孵育0.5、1、2 h，确定最佳封闭条件。将羊抗小鼠IgG/HRP (酶标二抗)按1︰2 000–1︰10 000的浓度进行梯度稀释，在37 ℃条件下作用0.5、1、1.5 h，确定酶标二抗的最佳使用条件。最后对TMB显色液作用时间进行确定，设置10、15、20 min时间梯度，确定TMB的最佳显色时间。

1.2.10 双抗体夹心ELISA的临界值确定

收集13份未感染艰难梭菌的仔猪粪便，用磷酸盐缓冲液(PBS) 稀释10倍后取上清，用建立的双抗体夹心ELISA进行临界值的确定。测定OD₄₅₀的吸光度，计算吸光度的平均值(x)与标准差(s)，当OD₄₅₀≥x+3时，s判定为阳性；OD₄₅₀ ≤x+2时，s判定为阴性。介于二者之间为可疑样本需重测。

1.2.11 双抗体夹心ELISA的特异性试验

用建立的双抗体夹心ELISA检测临床分离的艰难梭菌ST11型C1、C2、P1分离株及其他ST型的13株艰难梭菌培养上清、RBD和GDH蛋白，确定双抗体夹心ELISA的特异性。

1.2.12 双抗体夹心ELISA的敏感性试验

以不同浓度(2.21–4 520 ng/mL) 的RBD蛋白为抗原，用建立的双抗体夹心ELISA对RBD蛋白浓度底限进行检测，检测建立方法的敏感性。

1.2.13 统计学分析

使用统计软件SPSS 27.0对数据进行统计学分析，组间两两比较采用t检验分析差异显著性，P < 0.05为差异有统计学意义。采用Graphpad Prism 9.1作图。

2 结果与分析 2.1 rbd基因重组质粒的鉴定

重组质粒pET-32a(+)-RBD经PCR及双酶切鉴定，得到大小为1 848 bp的条带(图 1)，测序结果证明重组质粒pET-32a(+)-RBD构建成功。

2.2 RBD融合蛋白的鉴定

转入重组质粒pET-32a(+)-RBD的BL21(DE3)在诱导表达、纯化后，用SDS-PAGE分析，诱导表达和纯化后都有明显的RBD蛋白条带，大小为97 kDa，与预期结果相符(图 2)。

2.3 单克隆抗体的纯度和亚类鉴定

三免后所有小鼠血清的抗体效价均在1︰50 000以上，达到进行细胞融合标准，加强免疫3 d后进行细胞融合。通过4轮有限稀释筛选，得到1株能够稳定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，命名为AE2D3。用RBD蛋白、GDH蛋白检测AE2D3培养上清抗体的效价，AE2D3可以分泌针对RBD的特异性单克隆抗体(****，P < 0.000 1) (图 3A)。然后通过姬姆萨染色对阳性杂交瘤细胞染色体数目进行鉴定，结果显示，AE2D3染色体数目为109条，SP2/0骨髓瘤细胞染色体数目为68条，证实AE2D3为杂交瘤细胞。连续培养90 d的AE2E3细胞培养上清和复苏冻存了90 d、180 d的AE2E3细胞培养上清中单克隆抗体效价均达1︰500 000，表明无论是连续传代还是长时间冻存后复苏，AE2D3都能够稳定地分泌特异性抗体。SDS-PAGE分析显示，收集的腹水经纯化后得到纯度95%以上的IgG抗体，仅存在重链(约50 kDa) 和轻链(约25 kDa) 2个条带(图 3B)。使用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装试剂盒对单克隆抗体亚类进行鉴定，结果显示，AE2D3分泌的特异性抗体重链为IgG2b型，轻链为κ型。

2.4 单克隆抗体的亲和力与特异性

对AE2D3杂交瘤细胞培养上清和纯化后的腹水抗体效价进行测定，腹水中抗体效价明显高于细胞培养上清的(图 4A)。因此，双抗体夹心ELISA检测方法的建立将使用纯化后的腹水作为检测抗体。Western blotting结果显示，单克隆抗体能与RBD结合，与GDH蛋白不结合(图 4B)；同时，单克隆抗体与艰难梭菌ST11型的C1、C2、P1菌株培养上清结合，与ST3型P2菌株、ST35型LW3和LW6菌株、ST109型Y1和Y2菌株的培养上清不结合(图 4C)。表明制备的单克隆抗体具有较好的特异性和反应原性。

2.5 双抗体夹心ELISA的最佳反应条件

三免后新西兰兔血清中RBD蛋白的抗体效价达1︰100 000，可作为兔抗RBD蛋白多克隆抗体使用。运用棋盘法确定双抗体夹心ELISA各个环节的最佳反应条件。捕获抗体稀释度1︰1 600、检测抗体稀释度1︰3 200为二者最佳配对的使用浓度(表 2)；捕获抗体用0.05 mmol/L抗原包被液包被后在37 ℃孵育1 h后4 ℃孵育12 h为最佳包被条件(表 3)；检测抗体和待检样品分别在37 ℃孵育1 h为最佳孵育条件；浓度为3%的脱脂牛奶在37 ℃孵育1 h为最佳封闭条件；稀释度为1︰5 000的羊抗小鼠IgG/HRP (酶标二抗) 在37 ℃反应1 h为最佳反应条件；TMB显色液在常温下、避光显色10 min为最佳反应条件。

2.6 双抗体夹心ELISA的临界值

用建立的双抗体夹心ELISA检测13份未感染艰难梭菌的仔猪粪便，测得阴性样品OD₄₅₀平均值x为0.09，标准差s为0.031，即OD₄₅₀ ≥0.183 (x+3 s) 时判定为阳性，OD₄₅₀≤0.152 (x+2 s) 判定为阴性；介于两者之间为可疑，则重测，当OD₄₅₀仍然大于0.152则判定为阳性，反之判定为阴性。

2.7 双抗体夹心ELISA的特异性

用建立的双抗体夹心ELISA检测3株ST11型、13株其他ST型艰难梭菌培养上清。运用本方法检测非ST11型艰难梭菌培养上清与GDH蛋白的OD₄₅₀小于0.152呈阴性结果；检测RBD蛋白与ST11型艰难梭菌培养上清OD₄₅₀大于0.183呈阳性结果(图 5)，表明建立的双抗体夹心ELISA无交叉反应。

2.8 双抗体夹心ELISA的敏感性

用建立的双抗体夹心ELISA对RBD蛋白最低检测浓度进行测定，最低检测浓度为8.83 ng/mL (图 6)，说明建立的双抗体夹心ELISA敏感。

3 讨论

艰难梭菌作为一种人兽共患条件致病菌，自1935年在婴儿肠道首次发现以来，已在多种动物(猪、牛、鸡、鸭等) 体内分离出来，目前CDI已成为国际上一个重要的公共卫生问题^[19-21]。ST11型艰难梭菌是1种高致病性、高传播风险的菌株，在欧洲、澳大利亚的人群和猪群之间曾暴发流行^[7-8]。对我国四川地区猪源艰难梭菌进行流行病学调查时，发现了仔猪感染ST11型艰难梭菌^[19]，表明四川地区猪群存在CDI且有向人群流行的风险。在国际上还未研究出针对艰难梭菌的有效疫苗之前，操作便捷和经济实惠的血清学诊断技术更适合动物间大规模的流行病学调查^[22-23]。我国对于人源艰难梭菌的检测方法成熟，但针对猪源艰难梭菌检测方法仍缺乏。主要原因在于目前艰难梭菌的检测操作复杂，不适合在猪群中进行大规模的艰难梭菌检测，这给我国猪群艰难梭菌的防控带来挑战^{[1, 22]}。

可靠的血清学诊断方法的建立与所选抗原的抗原性密切相关。有研究显示，TcdB毒素和抗TcdB毒素RBD蛋白的血清结合，能使细胞免受细胞病变的影响，说明TcdB毒素的RBD蛋白具有良好的抗原性，可作为血清学诊断方法的候选抗原^[15]。细胞毒性检测(CTA) 和产毒菌株培养(TC) 作为艰难梭菌检测的金标准^[18]，具有非常高的敏感性，但检测时间长、成本高的缺点成为了其应用于临床样本快速检测的阻碍；同时，由于艰难梭菌属于条件致病菌，当其未成为肠道中优势菌群时，采用CTA和TC检测可能会被误诊^{[22, 24-25]}。谷氨酸脱氢酶(GDH) 是艰难梭菌共有的一种抗原，可以长期稳定地存在，但GDH的检测不能鉴定艰难梭菌是否产毒，只能鉴定艰难梭菌的存在，因此不能判断患者是否感染艰难梭菌^[26]。分子诊断的检测方法是针对基因层面的检测，不能确定毒素基因的转录水平，因此不能直接用于分辨CDI患者与携带者^[24]。酶联免疫试验(EIA) 操作便捷、检测速度快，临床上较为普及^{[22, 27]}；但以往的EIA检测普遍使用多克隆抗体为检测抗体进行检测，敏感性较低，易出现假阳性，对某些菌株敏感性只有16%^[27]；此外，Planche等评估了6种EIA检测方法，发现大部分EIA方法的特异性强，但敏感性低^[28]；陈伟用人源艰难梭菌TcdB毒素受体结合域的单克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA，但方法不够敏感，不适合开展艰难梭菌的大规模检测^[16]。

为提高血清学方法中检测抗体的敏感性，本研究以制备的猪源ST11型艰难梭菌TcdB毒素RBD蛋白的单克隆抗体为检测抗体、兔多克隆抗体为捕获抗体，建立了特异、敏感、操作便捷的双抗体夹心ELISA，为检测高致病性的ST11型艰难梭菌提供一个可靠的血清学诊断方法。

4 结论

本研究利用原核表达技术成功表达并纯化ST11型艰难梭菌TcdB毒素的RBD蛋白，采用杂交瘤技术成功筛选出1株针对RBD蛋白特异、敏感、且稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞AE2D3。建立了一种可用于兽医临床大规模检测猪源ST11型艰难梭菌的双抗体夹心ELISA，为猪场高致病性、高传播风险的ST11型艰难梭菌流行病学调查提供可靠的血清学检测方法。