2021, Vol. 37中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 王彦珺, 李姝承, 关长阁, 何东, 廖锡豪, 王怡, 陈海红, 张翀, 邢新会
- Wang Yanjun, Shucheng Li, Changge Guan, He Dong, Liao Xihao, Wang Yi, Chen Haihong, Zhang Chong, Xing Xin-Hui
- 天然活性多肽的发掘策略和生产技术
- Functional discovery and production technology for natural bioactive peptides
- 生物工程学报, 2021, 37(6): 2166-2180
- Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(6): 2166-2180
- 10.13345/j.cjb.210047
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文章历史
- Received: January 16, 2021
- Accepted: April 6, 2021
- Published: April 14, 2021
引用本文
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2. 广东工业大学 轻工与化工学院，广东 广州 510006;
3. 清华大学 合成与系统生物学中心，北京 100084;
4. 清华大学 深圳国际研究生院 生物医药与健康工程研究院，广东 深圳 518055;
5. 深圳湾实验室医药健康技术与工程研究所，广东 深圳 518055
2. School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong, China;
3. Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China;
4. Institute of Biomedicine and Health Engineering, Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University, Shenzhen 518055, Guangdong, China;
5. Shenzhen Bay Laboratory Medical Health Technology and Engineering Institute, Shenzhen 518055, Guangdong, China
随着社会生产力的发展，人们的生活水平不断提升，健康意识不断增强，对健康产品的需求也在不断增长。目前，全球各类疾病患者占总人口数量的20%，亚健康人群占人口总数的75%以上，而健康人群总量不足5%的现状导致社会医疗支出负担持续加重，并成为日益严重的社会性问题[1]。因此，如何改善亚健康状态，并使健康状态得到持续维持，成为国家和社会关注的重点。而相较于传统的疾病治疗观念，预防疾病的发生即“治未病”，不失为一种更好的健康维持手段。因此学者们提出了“大健康”这一理念。在“大健康”理念下，健康产业呈现多元化发展态势[2]。
我国是农业大国，源于农业资源的天然蛋白质种类丰富，总量巨大。但目前天然蛋白质资源多用于生产动物饲料和食品蛋白质补充剂等附加值较低的产品，在蛋白质的精细加工与高值化综合利用方面还有很大的发展空间。天然生物活性多肽(Natural bioactive peptides)是一类源自天然蛋白质的生物资源，组成多肽的氨基酸数量一般在2–50个之间[3]。生物活性多肽在生命机体中可发挥重要的生理调节作用，如抗菌抑菌、降血糖、降血压、降胆固醇、抗氧化、抗肥胖、抗癌、免疫调节、与矿物元素结合等生理功能[4]。活性多肽分子量较小，种类丰富，在人体内以微量存在，具有细胞转运容易、吸收利用度高、半衰期短、毒性和免疫原性低、生物活性多样等特点，因此成为21世纪人类健康保健品的新宠儿。目前，天然活性多肽的研发技术和产业化应用发展迅速。根据Biopep数据库[5]中的数据，活性多肽数量已达4 000余种。然而目前，挖掘具有保健功能的活性多肽的技术仍然比较落后[6]，难以满足健康产业发展的需求。若能够发展高效的天然活性多肽创制技术，将大大提高蛋白质的高值化利用能力，极大地促进天然蛋白质资源精深加工的技术进步及产业链延伸。
尽管活性多肽具有较高的医药健康功效和经济价值，但其现有的发掘和生产技术方法均存在一些问题，如多肽发掘方法周期长、研发成本高；而多肽生产方法如天然活性多肽提取和发酵制备方法受限于原料或菌群组成的不稳定性，造成产品的质控难度大。然而，目前尚缺乏系统总结天然活性多肽发掘和生产技术的综述性文章。因此，本文将从自上而下和自下而上两个角度，详细总结活性多肽的发掘和生产方法，分析两种方法的特点及不足，并提出将自上而下和自下而上两种方法结合的思路，为多肽发掘与生产提供了新策略，进而推动新型活性多肽的创制进程。
1 天然活性多肽的发掘活性多肽的功能是依靠其特定的序列和特殊的结构来实现的。因此，如何从复杂天然生物体系中筛选出具有特定生物学活性的多肽，是天然活性多肽创制和应用的关键技术。目前，活性多肽发现的方法主要包括直接从天然产物中提取鉴定、天然活性多肽改造以及多肽数据库与人工智能挖掘等。
1.1 天然活性多肽的功能序列发现 1.1.1 天然产物中直接鉴定活性多肽最直接的活性多肽挖掘方法是使用物理手段从天然生物资源及其酶解产物或发酵物中分离提取，然后进一步挖掘其所具有的生理活性功能；或从天然资源中筛选、分离具有特定功能的生物活性多肽。Ferreira等[7]于1965年从美洲矛头蝮Bothrops jararaca蛇毒中分离到了具有降血压作用的替普罗肽(pyroGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile- Pro-Pro)，而Danielle[8]等也于2004年采用两步液相色谱法及电喷雾串联质谱法从蛇毒中鉴定了5种新的缓激肽增强肽。DiBianco[9]发现替普罗肽末端7–9位的Ile-Pro-Pro序列能够抑制血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme，ACE) 的活性，减少血管紧张素Ⅱ的生成，避免过多的血管收缩从而达到降血压的效果。Takano[10-11]团队也根据此序列信息，从酸奶中分离到了有ACE抑制活性和体内降血压活性的Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro两种三肽序列，并解析了其作用机制。而饮料公司Calpis也将包含Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro两种三肽的乳酸菌饮品和保健品推向了市场，在受高血压困扰的中老年人中收获了广泛好评。
1.1.2 天然活性多肽改造对目前已知序列及功能的多肽进行改造，可获得功效更好的新型活性多肽。例如，人体中的胰高血糖素样肽(GLP-1)[12]具有促进胰岛素生成和分泌、延迟胃排空、降低食欲以及减少胰高血糖素分泌等作用，是控制血糖和治疗Ⅱ型糖尿病的重要生物活性肽。但这种多肽易被内源酶二肽基肽酶-4 (DPP-Ⅳ)[13]快速降解，在血液内的半衰期仅为10 min。研究者们通过对GLP-1的部分氨基酸替换，获得了半衰期更长的多肽产品，如艾塞那肽(Exenatide)[14]、利西拉肽(Lixisenatide)[15]和索马鲁肽(Semaglutid)[16]等，其中索马鲁肽的作用周期(半衰期) 可达1周，成为Ⅱ型糖尿病治疗的重要多肽药物。
1.1.3 多肽数据库与人工智能挖掘活性多肽基于已有的活性多肽序列与功能数据库，利用自然语言处理(Nature language processing，NLP) 和人工智能方法，生成有功能的未被识别到的多肽也是近年来发展起来的一种活性多肽挖掘新方法。在多肽的自然语言处理模型中，20种天然氨基酸残基就像26个英文字母，而每一条由不同氨基酸组成的多肽序列就是一个“单词”，其对某个疾病和特定受体的功能就是“词义”。Giguère等[17]使用机器学习方法，通过对Joo等[18]实验得到的抑菌多肽结构功能库中的序列生成NLP模型进行语义分析，得到了数条自然界未被识别的且具有较高活性的抑菌多肽。Fang等[19]同样基于NLP模型，使用深度学习算法，从Agrawal[20]的数据库中选取训练集，最终筛选出了具有抗真菌功能的活性多肽。这些研究结果显示人工智能在活性多肽挖掘中的应用潜力，但该领域的研究仍处于初步发展阶段。
1.2 活性多肽功能评价方法活性多肽功能主要是通过体内和体外实验进行评价的。任美娟[21]通过体外的抗氧化表征实验发现杏鲍菇多肽口服液具有抗氧化功能。孙金沅等[22]通过体外表征发现白酒酒醅中两种多肽具有抗氧化和降血压功能。李继海[23]通过小鼠实验模型发现梅花鹿茸来源的活性多肽能够提高机体的细胞免疫和机体免疫功能。戴媛[24]通过大鼠实验发现大豆多肽TTYY使抗氧化酶活性和GSH含量升高，且处理剂量不同改变的效果不同，400 mg TTYY/kg体重的处理剂量效果最佳，说明TTYY减轻了脂质和蛋白质的氧化损伤，提高了抗氧化酶活性和抗氧化物质含量，增强了大鼠机体的抗氧化能力。然而，多肽的功能评价通常是活性多肽研发的决速环节，其周期长、成本高、通量低，且细胞和动物模型结果难以用于预测对于人体的作用，未来需要发展更高效和更具有针对性的功能评价方法。比如Xing等[25]综述了微流控人源类器官系统能够更好地模拟人体真实器官功能，作为新型高通量筛选和表征模型可以提高活性多肽功能挖掘的效率和可靠性。
1.3 活性多肽的构效关系活性多肽与其靶蛋白的构效关系研究对于挖掘更多的活性多肽以及理解活性多肽结构与功能之间的关系具有重要意义。Nongonierma和FitzGerald[26]开发了一种结合蛋白质覆盖率和效能指数的计算方法，并应用了肽段比对策略来研究序列与功能之间的关系。此外，分子对接[27]模拟方法也已被用于阐明实验或预测的多肽序列与生物活性靶标蛋白质的相互作用。Nongonierma等[28]还发现，对接三肽分子与DPP-Ⅳ活性位点获得的Vina分数(预测的亲和力) 与其体外DPP-Ⅳ抑制特性之间并没有直接相关性，因此建议研究者应建立结构-功能关系的多维度模型，而不是直接使用对接的亲和力高低来选择目标活性多肽。Zhou等[29]使用定量构效关系(Quantitative structure-activity relationship，QSAR)分析方法，并结合量子力学/分子力学分析方法，解析了多肽与ACE酶的复合物所涉及的结构基础和高能谱，以及模型化ACE与多肽之间的相互作用谱。Acharya等[30]指出，活性多肽与其靶蛋白结合过程中的动态构象变化对对接计算结果也有影响，并提倡建立记录这些变化的4D结构数据库，以更好地反映多肽的构效关系。张贵川[31]利用经典的z-scales氨基酸描述子，对140种抑制ACE的三肽进行了描述，得到关于IC50的回归方程从而建立了所有三肽序列对于ACE抑制活性的模型。表 1列举了部分慢性病相关蛋白与活性多肽序列的构效关系，并针对这些蛋白总结出活性多肽的序列规律。
| Chronic disease | Target protein | Bioactive peptides | IC50/(μmol/L) | Patterns |
| Hypertension | ACE1 | VPP[10-11] LRL[31] |
9.00 3.42 |
If the volume of the third amino acid at C-terminal is small, it will have strong hydrophobicity and high activity |
| Hyperglycemia/Diabetes | DPP-Ⅳ | IPI[32] VPI[33] |
3.00 20.20 |
For tripeptides, the polypeptide with proline as the second amino acid have higher activity[34] |
| Hypeluricemia/Gout | XOD | WV[35] WDQW[36] |
1 300.00 950.00 |
For dipeptides or tripeptides, the peptides containing phenylalanine and tryptophan have higher activity[37] |
随着天然活性多肽被大量发掘，已有很多功效与作用机理明确的活性多肽被推入市场。根据日本健康营养协会[38]的统计，日本健康食品的总市值已达到80亿美元。其中多肽类的来源、主要功能序列、制备方法、功能活性以及市场情况如表 2所示。
| Origin | Sequence | Method | Function | Market situation |
| Milk | VPP, IPP[41] | Fermentation | Antihypertensive, ACE inhibitors | Listed by Calpis, a Japanese beverage company |
| Milk | NIPPLTQTPVVV[42], PPFLQPE | Fermentation | Improve amnesia, increase the memory of the elderly | Listed by Calpis, a Japanese beverage company |
| Rice | SEEGYYGEQQQQPGMTR[43] | Enzymatic hydrolysis | Gain muscle after a workout and reduce muscle damage | Developed by BASF Chemical |
| Pea | HGPVEMPYTLLYPSSK[44] | Enzymatic hydrolysis | Protect skin and slow down skin aging | Developed by artificial intelligence peptide technology company Nuritas |
现有的活性多肽的生产方法可以分为自上而下与自下而上两大类。自上而下指从动植物蛋白原料出发进行加工、分离、纯化进而得到活性多肽的过程，主要包括直接提取法、酶解法、微生物发酵法等；自下而上指从小分子的氨基酸出发合成特定多肽序列的过程，主要包括化学合成法、化学-酶耦合法、基因工程表达和无细胞合成等。活性多肽的生产方法、筛选和实际应用的关系如图 1所示。
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| 图 1 活性多肽的发掘和生产方法 Fig. 1 Scheme of functional discovery and production technology for bioactive peptides. |
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直接提取法可基于肽的分子量、电学性质等物理特性，实现从生物质中分离目标活性多肽的目的。例如曹伯良[39]开发了利用超滤、纳滤等方式从养殖水中直接提取生物活性多肽的装置；Preecharram等[40]利用阴离子交换、凝胶过滤和反相高效液相色谱法处理得到了暹罗鳄鱼血清中的6种抗菌肽(Hp14、Hp15、Hp17、Hp31、Hp36和Hp51)。直接提取法分离过程取决于天然原料的多肽种类和含量，影响因素多，技术经济性不高。因此，从天然资源直接提取活性多肽的方法适于新功能的发现，但一般难以用于工业化生产。
2.1.2 蛋白原料的蛋白酶解法酶解法是利用蛋白酶水解蛋白原料得到目标活性多肽的方法。蛋白酶作为天然生物催化剂，不仅能够水解氨基酸之间的肽键，还可以催化其他类型的反应，如外消旋醇和羧酸拆分中的酯化和酯交换反应，以及中、前手性二醇的立体选择性酰化反应。蛋白酶能够特异地降解蛋白底物，从而生成活性多肽[45]。
目前报道的应用于多肽制备的食品工业用蛋白酶包括碱性蛋白酶(Alcalase)、中性蛋白酶(Neutrase)、木瓜蛋白酶(Papain)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、复合蛋白酶(Protamex)、胃蛋白酶(Flavourzyme)、胰蛋白酶(Trypsin)、枯草芽孢杆菌分离蛋白酶(Bacillus subtilis isolated enzymes)、嗜热菌蛋白酶(Thermolysin) 等[46-55]。目前，用于食品或功能食品的活性多肽制备必须使用这些食品级蛋白酶。
Arrutia等[56]使用胰蛋白酶水解牛血清白蛋白(BSA) 产生的多肽产物混合物具有ACE抑制作用、DPP-Ⅳ (二肽基肽酶-4) 抑制作用和抗氧化作用。Chang[57]等在胃蛋白酶-胰酶酶解油棕榈仁得到的水解液(Oil palm kernel hydrolysate, OPKH) 中提取多肽，通过超滤、反相HPLC、半制备HPLC等方法纯化OPKH，再采用液相色谱-电喷雾电离/多级质谱(LC-ESI-Q-TOF- MS/MS) 和从头测序相结合的方法鉴定出3个抗氧化肽VVGGDGDV、VPVTST和LTTLDSE。Lajmi等[58]采用胰蛋白酶对星鲨属鱼类Mustelus mustelus 的胶原蛋白进行水解，得到具有血管紧张素转换酶(ACE) 或脯氨酰内肽酶(PEP) 抑制活性的蛋白水解物，且用海藻酸钠-乳清蛋白分离微球包裹水解产物可提高ACE抑制活性(IC50=0.24 mg/mL)。Mudgil等[59]和Nongonierma等[60-61]以骆驼奶为原料，通过碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶得到同时具有α-淀粉酶(α-amylase)、胰脂肪酶(pancreatic lipase)和DPP-Ⅳ抑制作用的降食欲蛋白水解物，并从中筛选出VPV、VPF、LPVPQ和YPI等抗模拟消化(Simulated gastric and intestinal digestion, SGID) 的活性多肽。
蛋白酶解法生产活性多肽具有高效性、环境友好等优点，然而这一方法最大的挑战是蛋白酶的选择。同种原料选择不同的酶进行酶解得到肽谱以及多肽相对含量差别很大。同时由于食品级蛋白酶的纯度以及分子特性等产品信息有限，用于天然活性多肽的制备与生产常需要反复试错，耗物耗时耗力，对原料质量要求高，质控难度大。而基于数据库中的蛋白序列，引入生物信息学方法或者软件应用等工具对蛋白酶切位点进行预测能够辅助酶的选择，对于未来特异性蛋白酶的分子设计具有重要参考价值。例如，Yu等[62]以虾夷盘扇贝Mizuhopecten yessoensis提取出的肌球蛋白(Myosin) 为原料，通过PeptideCutter[63]对水解多肽组成进行了预测, 并筛选出了其中具有抑制ACE活性的7种三肽。
2.1.3 微生物发酵法微生物发酵法是生产食品级蛋白水解物和活性多肽的有效途径之一[4]。常见天然原料主要有牛奶蛋白、奶酪、蛋清、鱼类、藻类、豆类(黄豆、绿豆)、谷类(小麦、大米、燕麦) 等[64-66]，此外，藜麦、鹰嘴豆、葡萄等[67-68]也曾被使用。目前，欧美地区从乳制品中发酵生产生物活性多肽的方法与工艺最为成熟，亚非地区则更多使用豆类作为发酵原料。在发酵过程中常用的微生物主要有乳酸菌Lactococcus、乳杆菌Lactobacillus、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus、酵母菌Saccharomyces、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis[69-71]等。Daliri等[72]利用戊糖小球菌Pediococcus pentosaceus SDL1409在37 ℃条件下将大豆发酵48 h，发酵液对ACE的半抑制浓度IC50值为(0.123±0.02) mg/mL。采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱法对小分子多肽进行鉴定，依据丰度和结构特征，筛选出4个高效抑制ACE的活性多肽(EDEVSFSP、SRPFNL、RSPFNL、ENPFNL)。Moslehishad等[73]利用鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus PTCC1637从骆驼乳中提取的3–5 kDa肽段对ACE半抑制浓度IC50值为(1.45±0.02) mg/mL。Rizzello等[70]利用植物乳杆菌Lactobacillus plantarum T0A10发酵藜麦面团，并利用反相高效液相色谱法分离水/盐溶性提取物(WSE) 中的蛋白，并体外测定分离获得的32个组分对1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)和2, 2ʹ-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]，ABTS) 自由基的抑制作用及抑制亚油酸自氧化的能力。通过纳米液相色谱-电喷雾电离-质谱连用鉴定出5个抗氧化功效较强的由5–9个氨基酸残基组成的多肽(IVLVQEG、TLFRPEN、VGFGI、FTLIIN和LENSGDKKY)。Takano团队[74-75]发现酸奶能够降低自发性高血压大鼠的血压，根据替普罗肽末端7–9位的Ile-Pro-Pro序列能够抑制ACE的活性，从瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus或德氏乳杆菌亚种Lactobacillus delbrueckii subsp. 发酵的酸奶中分离得到了具有ACE抑制活性和体内降压活性的Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro两种三肽序列。He等[76]利用葡聚糖硫酸钠盐(DSS)造模的溃疡性结肠炎小鼠模型，利用4种食品级乳酸菌Lactobacillus sp.混合发酵小麦胚芽和苹果，并从其发酵液的醇溶组分中发现了可有效预防溃疡性结肠炎的活性多肽组分。
对于工业生产规模，利用微生物发酵生产天然活性多肽在技术经济性上具有竞争优势，但微生物分泌的其他蛋白和多糖等生物大分子会影响产品纯度，后续分离纯化过程相对复杂。此外，如何利用非转基因技术选育高活性发酵微生物也是提高活性多肽生产效率的重要环节。因此，在实际生产中需要不断地选育安全性高、转化能力强的菌株。
2.2 自下而上的活性多肽生产方法多肽合成方法一般是以氨基酸为原料，通过化学合成或生物合成方法将氨基酸按照特定序列组合成为目标活性多肽。但这种活性多肽生产方法的前提是需要根据多肽结构与功能关系的数据库，获得活性多肽序列。
2.2.1 活性多肽的化学合成和酶催化合成1901年Fischer等[77]通过将2, 5-二酮哌嗪(甘氨酸酐) 与盐酸一起煮沸，成功制备了双甘肽(Gly-Gly，Glycylglycine)，这也是最早被人类合成出的多肽。此外，Fischer等还创造性研究出在液相中合成多肽的方法被称为液相合成法，这种方法在合成片段较短且量大的目标多肽时更有优势，且纯度较高。
1963年，Merrifield[78]首先提出并建立了固相合成的方法，高效地合成了四肽(Leu-Ala-Gly- Val)。其基本原理是，将氨基酸的C端固定在树脂上，之后依次缩合氨基酸延长肽链。这一方法大大提高了合成长链多肽的效率，相比液相方法，固相合成在分离目标多肽和副产物上更简便。1966年Kung等[79]成功实现结晶牛胰岛素合成也是基于固相合成方法。固相合成技术目前已经广泛应用于各种长度的多肽生产中，当需要合成中长肽或较小分子量蛋白时，一般优先选择该方法。
在发明多肽的固相合成法之后，为了提高合成的效率，Kullman[80]又提出了使用蛋白酶合成活性多肽的新思路，并于1979年率先使用木瓜蛋白酶(Papain) 和嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)等提纯酶的催化合成技术，成功合成了亮脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) 和甲硫脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met)。相比于完全使用化学合成法，酶法合成多肽最突出的优点是用酶催化反应时对氨基酸选择的特异性[45]，同时也因此降低了化学合成法对氨基酸残基侧链保护的要求。但是高纯度高活性的特异性蛋白酶提纯过程较为烦琐，价格也较为昂贵。因此目前使用酶合成方法还未成为多肽合成的主流方法。
2.2.2 活性多肽的基因工程表达随着重组蛋白表达技术和基因工程技术的不断发展，越来越多的研究开始利用重组表达技术，以原核和真核宿主细胞来生产目标活性多肽[81]。然而，如果目标产物为短肽，则很容易被微生物胞内的蛋白酶降解，从而降低重组表达生产多肽的效率[82]。
以原核表达体系为例，在大肠杆菌中，可以使用两种方法解决目标多肽降解问题：1) 使用蛋白酶缺陷菌株；2) 以不溶性包涵体或串联体形式表达多肽。Prak等[83]在使用大肠杆菌体系表达降胆固醇水平的五肽IIAEK时，利用了大豆球蛋白原的序列并串联多个目标IIAEK序列，最终成功生成了纯净的外泌包涵体蛋白。该包涵体可以在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下分解形成目标五肽序列。
在真核表达体系中，常用酵母体系进行多肽的表达。Guo等[84]将抗菌多肽天蚕素D基因整合到毕赤酵母Pichia pastoris基因组上，通过Tricine-SDS-PAGE技术证明天蚕素D被表达和分泌，并且分泌的天蚕素D对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有良好的抗菌效果。Meng等[85]利用Pichia pastoris成功表达了多肽Mytichitin-A，且产量达到了45.5 μg/mL，该多肽可以高效地抑制革兰氏阳性菌而不能抑制革兰氏阴性菌的生长。Zhang等[86]利用Pichia pastoris表达了凝集素多肽，产量达到了748.63 μg/mL，且表达的凝集素对革兰氏阳性菌有很高的抑制效果。吕星星等[87]利用Pichia pastoris表达了鳜鱼β-防御素，抑菌实验表明表达的鳜鱼β-防御素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和副溶血性弧菌的抑制率分别为94.34%、86.97%和85.92%。
使用基因重组技术表达活性多肽，相比化学合成多肽而言目标产物的产率比较低，因此表达体系的选择和设计尤其重要[82]。在多肽的重组表达过程中，还会因为表达体系自身的缺陷产生缺失或无效的多肽片段[88]，甚至宿主细胞自身代谢分泌的多肽时常也会出现，导致分离纯化过程复杂。而使用无生长代谢影响的无细胞表达体系，则能够克服上述缺点[89]。
2.2.3 活性多肽的无细胞系统表达无细胞系统(Cell-free system) 是指利用有完整蛋白合成能力的细胞抽取物，而非活体细胞来表达蛋白质的系统。这样的表达系统相比于活细胞而言，蛋白产物纯度更高、更易于分离，且能够合成对细胞有毒性的多肽，还可以采用非天然氨基酸合成非天然活性多肽[90]。此外，因反应体系为溶液体系，更容易控制。
萤火虫抗菌肽(Pyrrhocoricin)[91]是从萤火虫体内提取的长度为20个氨基酸的抑菌肽，其功能是高效地杀伤革兰氏阴性菌，大肠杆菌作为革兰氏阴性菌无法表达该多肽。而Taniguchi等[92]利用大肠杆菌的无细胞表达体系表达了该多肽。该研究发现，生成的重组抗菌肽并不随反应时间增长而使无细胞表达体系的活性下降，同时还与自然界提取的天然萤火虫抗菌肽有相同构象，完全等效地抑制革兰氏阴性菌的生长。
综上所述，无细胞系统表达对于具有细胞毒性或是本身易被分解的目标多肽生产是一个极具潜力的多肽表达系统。
2.3 两类活性多肽挖掘和生产方法存在的问题以天然的生物质资源为原料，通过直接提取、酶解和微生物发酵制备多肽的自上而下方法是从自然界发现新的功能性多肽的重要途径，对于丰富和发展活性多肽库发挥了巨大作用，至今仍然被广泛采用。但其缺点在于蛋白酶的选择或发酵的菌种均需要反复试错，活性多肽分离纯化、功能发现和评价过程复杂，不确定性大且成本较高。并且，对于没有参考基因组和蛋白组的大量物种，发现和制备功能性多肽的研发过程具有更大的不确定性。
另一方面，自下而上的多肽合成方法能够精确地合成具有特定功能的多肽。但其前提是要预先明确多肽序列和功能活性之间的关系。而目前已知结构的多肽库种类仍然有限，所以可供选择合成的多肽种类也很有限。另外，人工合成多肽一般适合于多肽药物开发，难以直接用于功能食品和保健食品。
3 小结与展望天然活性多肽成为生物医药与健康产业发展的重要物质体系，具有巨大的发展潜力。目前，已经报道的具有功能活性的多肽仅有4 000种左右，但远低于自然界存在的蛋白资源可能发掘的种类，因此利用自然界大量未被利用的物种蛋白资源发掘和生产新的天然活性多肽仍然是推动多肽技术发展有效的途径。自上而下发掘和生产活性多肽方法是活性多肽新功能发现和功能食品产业发展的重要路径，但如上所述，研发过程复杂、不确定性大、成本较高，且对于没有参考基因组和蛋白组的大量物种，发现和制备功能性多肽的研发过程具有更大的不确定性。而自下而上合成多肽方法的优势是基于已知的多肽构效关系，可以对目标多肽进行精准设计和人工合成，但其合成的多肽难以用于食品工业：液相或固相合成中引入了二甲基甲酰胺(DMF) 和二氯甲烷(DCM) 等有机溶剂和萃取剂，即使低于检测限仍然无法保证最终产品经服用后对人体无毒无害；而发酵生产用的菌种或无细胞体系同样因为代谢毒素的种类繁杂难以分离，暂时未被食品工业认可和接受。因此，今后需要利用天然资源发展快速发掘和生产活性多肽的系统工程技术，即食品和健康行业生产的活性多肽产品在很长一段时间内都要以自上而下的合成为主。
如图 2所示，人们可以将自上而下和自下而上的两种合成方法有机结合起来，加速活性多肽的发掘和生产研发进程。从自下而上的角度，对于许多没有明确其基因组和蛋白组的物种及其蛋白资源，可以利用蛋白测序和蛋白组学技术，获取天然蛋白序列，结合多肽构效关系数据库，利用机器学习等方法预测可能具有活性的多肽序列，直接通过合成方法进行制备，经活性检测确认后获得目标活性多肽；再从自上而下的角度，确定目标活性多肽在其源蛋白序列上切割下来所需的酶切位点，进而利用生物信息学方法选择相应的酶对该酶切位点进行切割，实现目标活性多肽的酶解制备。理论上，酶解制备的活性多肽与合成制备的活性多肽在活性上应无明显差别。相比于单一使用自下而上的方法，上下结合法更适用于合成肽无法直接应用的场景，例如功能食品的开发；相比于自上而下的方法，上下结合法免除了传统活性多肽筛选的分离纯化、活性检验等操作重复进行的巨大工作量，在确定了目标活性多肽序列的先验条件下进行蛋白序列的精准切割，因而大大缩短了筛选时间，达到了快速制备与验证目标活性多肽的效果。
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| 图 2 功能性多肽的系统创制技术 Fig. 2 Creation technology of functional peptides. |
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尽管目前已经有许多研究多肽构效关系的方法，但多肽的发掘及其作用机理阐释的难点仍在于构效关系难以明确，限制了活性多肽的发展。随着计算机分子图形学、分子动力学、量子化学、医学等学科的进步，针对多种信号通路及较为复杂的多肽-靶蛋白结合构效关系开展研究也逐渐成为可能。未来，这些构效关系研究方法和装备的创新将为图 2所示的功能性多肽创制技术发展提供重要的支撑。
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Vos T, Barber RM, Bell B, et al. Global burden of disease study 2013 collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 301 acute and chronic diseases and injuries in 188 countries, 1990-2013: a systematic analysis for the global burden of disease study 2013. Lancet, 2015, 386(9995): 743-800.
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