肠杆菌科细菌是革兰氏阴性细菌，其表面分布多种抗原，如K抗原、H抗原、O抗原及肠杆菌共同抗原(Enterobacterial common antigen，ECA)。前3种抗原在细菌定位、化学本质、生物合成及功能等方面均有深入研究，但ECA的系统研究还不够全面。本文主要综述肠杆菌科细菌ECA的研究进展。

Kunin等在尿道感染研究中，用间接血凝法测定大肠埃希氏菌Escherichia coli抗体时发现各种大肠埃希氏菌O血清型之间有交叉反应；抗大肠埃希氏菌O14 (Escherichia coli O14，E. coli O14) 抗血清不仅能被包被任何一种大肠埃希氏菌O-抗原的红细胞吸收，还保留与相应包被E. coli O14 O-抗原的红细胞发生红细胞凝集的能力^[1-2]。因此，抗E. coli O14抗血清中有一种针对所有大肠埃希氏菌的共同抗体。除大肠埃希氏菌外，其他肠杆菌科细菌中也有这种交叉反应现象，但非肠杆菌科革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌中没有^[2]。目前认为这是肠杆菌科细菌的共同特性，引起交叉反应的抗原是肠杆菌共同抗原ECA。它是肠杆菌科细菌的一种表面抗原，几乎存在于所有肠杆菌科细菌，如克雷伯氏菌属Klebsiella、变形杆菌属Proteus、沙门菌属Salmonella、痢疾志贺氏菌属Shigella、耶尔森菌属Yersinia及沙雷氏菌属Serratia等^[3-6]，而非肠杆菌科一般没有，其中类志贺毗邻单胞菌Plesiomonas shigelloides除外^[7]。此外，ECA在肠杆菌科细菌中具有交叉反应的抗原特性，也可以成为鉴定肠杆菌科细菌的依据。

ECA是肠杆菌家族细菌表面第二类主要糖脂结构，由三糖重复单元聚合而成，呈链状结构表达于细胞外膜，或呈链状和环状结构表达于细胞周质。它在肠杆菌科细菌中具有多样性，表现为组成多糖聚合物的三糖重复单位数量不同，以及其在细胞内存在形式不同。ECA多样性可能是在宿主免疫系统和其他环境因素的长期选择压力下逐步形成的，对肠杆菌科细菌的存活具有重大意义。ECA是肠杆菌科细菌重要的毒力因子，比如在鼠伤寒沙门氏菌中，ECA突变株能显著降低细菌的毒力，并在宿主体内长时间停留，形成持续感染^[8-9]。研究表明，ECA参与肠杆菌科细菌一系列生物学过程，如强化细菌抗胆盐能力和参与细菌群集运动^[10-11]。此外，ECA具有一定的免疫原性，是一种重要的保护性抗原，其能诱导产生阻止和清除细菌入侵和感染的特异性抗体，因此可以作为疫苗研究的重要靶点。本文从ECA纯化、基因结构和合成、免疫特性、生物学功能及ECA作为免疫性抗原的应用前景等方面系统阐述ECA的研究进展。

为了更好地研究ECA的免疫和化学特性，需要对其分离纯化。ECA是多糖聚合物，与O-抗原多糖有一定相似性，在纯化方式上也可以借鉴O-抗原多糖。目前的分离纯化方法主要可以归结为两类：传统纯化法和经典纯化法。

传统纯化法主要是热酚-水法和乙醇分级分离法两种。最早是Kunin等利用热酚-水法提取大肠埃希氏菌ECA，并进行了免疫和化学特性分析^[2]。热酚-水法程序是将菌体悬浮于蒸馏水中，68 ℃保持15 min，后加入适量的90%苯酚搅拌15 min，待冷却到室温后离心(14 600×g，20 min)，取出水相透析，再把透析后的溶液在50 ℃条件下浓缩，最后用10倍体积的乙醇沉淀，沉淀用水溶解后经DEAE纤维层析，再用氯化钠梯度洗脱。而乙醇分级分离法是依据分子量大小差异而能互相分离原理，利用超速离心或葡聚糖凝胶层析分离^[12]。这两种方法虽能分离出ECA，但分离物中存有一定量的LPS，会影响ECA的化学分析。

经典纯化法主要是丙酮-苦味酸-碳酸盐法和苯酚-水/苯酚-氯仿-石油醚结合法两种。丙酮-苦味酸-碳酸盐法程序是先用丙酮灭活细菌，室温蒸馏水提取，混合苦味酸至90%饱和，后加两倍体积的丙酮沉淀抗原物质。最后沉淀物溶于碳酸盐溶液中，经透析、浓缩，过葡聚糖凝胶柱，可分离出ECA组分，在此基础上可用凝胶电泳进一步纯化。而苯酚-水/苯酚-氯仿-石油醚结合法是对Kunin热酚-水法的优化，解决了ECA分离纯化不完全的问题^[12]。程序是将热酚-水法得到的洗脱液悬浮于苯酚-氯仿-石油醚中，经超声处理后离心，50 ℃下使氯仿和石油醚蒸发，后在苯酚中加蒸馏水，使苯酚中的LPS沉淀并离心去除，重复操作此步骤使LPS尽量去除。最后蒸馏水透析，冰干，悬浮于少量蒸馏水中，超速离心(105 000×g，4 h)，上清液即为纯化的ECA。这两种方法纯化得到的ECA有更高的纯度，为目前为止最常用的方法。

在测定纯化ECA纯度及浓度前，通常用DEAE-纤维素离子交换层析柱处理样品^[12]。有几种方法可以检测纯化的ECA的纯度，包括血凝实验^[13-14]、血凝抑制实验^[12-13]、免疫扩散沉淀实验^{[12, 15]}等。同时，也有方法对ECA进行定量分析，如ELISA检测^[14-15]。经典法纯化得到的产量较传统法相比少，通常为细菌干重的0.3%，但是纯度更高^[12]。经典法纯化获得的样品具有抗原所有血清学特性，包括红细胞包被能力、与抗血清的血凝作用、对红细胞凝集系统的抑制作用以及高滴度抗ECA血清琼脂凝胶沉淀等^{[12, 15]}。与之不同，传统法所获得的样品纯度不够，如能与抗O抗原抗体发生轻微凝集。最后，在分离纯化步骤上，经典法较传统法更烦琐。

ECA由寡糖重复单位组成，每个重复单位又由3个单糖组成，形成链状或环状结构。组成寡糖重复单位的3个单糖分别为N-乙酰基-D-甘露糖醛酸、N-乙酰基-D-葡萄糖胺以及4-乙酰氨基4, 6-二脱氧-D-半乳糖^{[12, 16]}。大部分细菌的ECA呈链状分布，只有少数几种细菌ECA是环状结构(ECA_CYC)^[6]，并且同一种细菌也可同时存在两种结构。链状与环状的寡糖重复单位数量不同，环状结构通常为4–6个寡糖重复单位^[17-19]，链状结构则更多^[17-19]。因此，ECA在肠杆菌细菌中具有一定的差异性(图 1)。这种差异性有可能是由细菌不断进化、适应环境导致的。图 1所示为2种不同结构的ECA化学结构。

图 1 ECA的化学结构 Fig. 1 Chemical structures of ECA. ManNAcA: N-acetyl-D-mannosaminuronic acid; GlcNAc: N-acetyl-D-glucosamine; Fuc4NAc: 4-acetamide-4, 6-dideoxy-D-galactose.

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O-抗原多糖由寡糖重复单位组成，每个重复单位通常由2到8个单糖组成。研究证实，多基因协调调控O-抗原多糖的合成，这些基因成簇存在，形成O-抗原基因簇，一般位于基因组的galF和gnd基因位点之间^[20]。近年来研究表明，ECA生物合成也是多基因协调作用的结果，这些基因也成簇存在，通常位于wecA和wecG基因位点之间^[21]。有两套基因分别合成O-抗原和ECA，且两套基因中有功能可以互换的基因，如合成O-抗原中的Rhamnose (Rha) 及合成ECA中的Fuc4NAc都需要RmlA、RmlB两种酶，编码这两种酶的基因都存在于O-抗原基因簇和ECA基因簇中^{[8, 22]}。但也有研究表明，删除O-抗原基因簇或ECA基因簇中的某个基因不影响另一抗原合成，如在沙门菌中敲除wecA基因，沙门菌的O-抗原合成不受影响^[9]。ECA合成基因簇一般由3类基因组成：单糖合成基因、糖基转移酶基因以及三糖单位处理基因(图 2)。单糖合成基因负责合成ECA中的单糖，如甘露糖。糖基转移酶基因负责将合成的单糖转移到细菌内膜胞质侧的脂质载体十一异戊烯醇一磷酸(Undecaprenyl-phosphate，Und-P) 上，如起始的第一个单糖通过糖基转移酶WecA将GlcNAc转移并链接到Und-P，形成Und-PP-GlcNAc (LipidⅠ)^[23]；而后三糖重复单位内其他单糖N-乙酰基-D-甘露糖醛酸、4-乙酰氨基4, 6-二脱氧-D-半乳糖陆续被相应的糖基转移酶WecG和WecF转移并链接，最后在内膜的胞质侧合成三糖重复单位Und-PP-GlcNAc-ManNAcA-Fuc4Nac (Lipid Ⅲ)^[24]。三糖单位处理基因负责合成ECA转运酶和聚合酶，完成ECA的加工和转运。与大多数肠道细菌O-抗原合成转运途径相似，ECA合成转运也是通过Wzx/Wzy途径。在该途径中，完整的三糖重复单位被翻转酶WzxE从内膜胞质侧翻转到内膜周质侧^[25]，在内膜周质侧被聚合酶WzyE聚合成多糖。聚合过程WzzE对多糖链长有一定的调控，一般聚合为14个重复单位^[26]。聚合后多糖链从脂质载体被转移到尚未识别的受体以磷酸二酯键与磷酸甘油酯连接^[27]；或多糖链被寡糖基转移酶WaaL转运到LPS的核心低聚糖区^[28]；形成完整的ECA分子，最后完整的ECA被转移到外膜(图 3)。但是目前对聚合后多糖链连接到磷酸甘油酯以及ECA被运送到外膜过程中涉及的基因和机制缺乏认知^[29-30]。图 3所示为链状结构ECA组装的生物合成途径。与此相似，环状结构ECA三糖重复单元生物合成过程与链状结构相同^[31]，但是对后续环化的机理或催化该过程需要的酶则缺乏认识。

图 2 ECA合成基因簇 Fig. 2 The gene clusters for the biosynthesis of ECA. Open arrows represent the location and orientation of putative genes.

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图 3 ECA组装的生物合成途径[31] Fig. 3 Biosynthetic pathway for the assembly of ECA[31]. Enzyme reactions and genetic loci involved in ECA biosynthesis. The structural genes of enzymes that catalyze individual reactions are expressed in italics; Abbreviation: Und-P: undecyl monophosphate; Und-PP: undecyl triphosphate; TTP: thymidine triphosphate; PPi: inorganic pyrophosphate; KG: ketoglutarate; Acetyl-CoA: acetyl coenzyme A; CoASH: coenzyme A; Amino sugar alone is abbreviated as described above.

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研究表明，ECA的免疫原性与其在细菌中的存在形式有关，不同存在形式的ECA之间免疫原性差异明显。ECA在细胞内有链状和环状(ECA_CYC) 2种结构，且每种结构在细菌中存在的形式不同。其中链状结构在细胞内有3种形式：游离态、LPS共价结合态(ECA_LPS)、甘油磷脂共价结合态(ECA_PG)；而环状结构只有游离态^[32]。游离态存在的ECA不与任何其他组分联系，只游离于细菌周质空间。LPS是革兰氏阴性菌的主要表面抗原，也是重要的毒力因子。它由3部分组成：O特异性多糖(光滑型菌)、核心低聚糖、类脂A (Lipid A)^[33]。ECA_LPS形式特点是LPS中原O抗原占据的核心位置被ECA的1–4个三糖重复单位取代，共价结合于核心低聚糖类脂A^[34]。ECA_PG是大多数细菌的存在形式，其多糖链与磷脂酰甘油共价结合，定位在细菌表面。

虽然肠杆菌科细菌几乎都有ECA，但只有少数细菌能产生ECA抗体，如E. coli O14、O56、O124和O144^[35]。此外，一些细菌的R突变株也有免疫原性，如大肠杆菌和志贺氏菌的R1和R4核心型突变株^{[28, 36-37]}。但是大肠杆菌R2、R3核心型突变株、沙门氏菌Ra核心型突变株及光滑型菌株(S) 无免疫原性。分析发现，有免疫原性菌株均存在ECA_LPS形式，如E. coli O14和一些R型突变株。E. coli O14菌体存在2种形式ECA，ECA_LPS和ECA_PG，但前者数量上占优势。R型突变株是一种粗糙型细菌，特点是细菌外膜LPS无O抗原多糖。其中R1、R4型原O抗原多糖被ECA共价取代，形成ECA_LPS形式，具有免疫原性，而其他R型突变则无。研究证实，在ECA三种存在形式中只有ECA_LPS具有很好的免疫原性，并能产生ECA特异性抗体。非ECA_LPS形式ECA类似一种半抗原，单独不能诱发免疫反应。因此，人们通过化学方法将ECA与载体蛋白共价结合，制备多糖-蛋白结合物。研究证实，通过化学方法将纯化后的ECA与碱性疏水性蛋白或细胞壁蛋白连接而制备的多糖-蛋白结合物，能激发兔子产生特异性抗体，证明其有良好的免疫原性^[38]。

ECA的发现提出了一种可能——用单一抗原免疫进而起到抵抗不同类型肠杆菌细菌感染的作用。一直以来，关于肠杆菌科的疫苗研制都比较艰难，主要原因是多血清型间的交叉保护效果不好，而ECA对于肠杆菌的疫苗研究具有一定的意义。

研究表明，抗ECA的兔抗体能促进多形核白细胞对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的吞噬作用，而对铜绿假单胞菌无明显作用^[39]。用加热灭活的鼠伤寒沙门氏菌上清液和乙醇可溶性ECA接种家兔，对引起实验性肾盂肾炎的奇异变形杆菌有免疫保护作用，对铜绿假单胞菌无保护作用^[40]。所以这种作用被认为是特异性的，因为铜绿假单胞菌不是肠杆菌科家族的一员，缺乏ECA。同时，将从大肠杆菌0111分离的乙醇可溶性组分ECA用于人体静脉免疫，结果表明抗ECA抗体滴度介于160和1 280之间，且免疫组的血清较未免疫组有更高的调理活性^[41-42]。因此，ECA抗体可能对含ECA的细菌感染具有保护作用。此外，一些实验结果也证实了ECA的免疫原性和ECA抗体明显的保护能力。将腹腔注射过从大肠杆菌0111分离的ECA或者E. coli O14的小鼠，用鼠伤寒沙门氏菌攻毒，显示了短暂但有统计学意义的明显保护作用^[43-45]。相似的实验还有用包裹ECA的马红细胞对小鼠进行预处理以及用家兔ECA抗血清进行被动免疫，均可以观察到鼠伤寒沙门氏菌感染后的寿命有所延长^{[44, 46]}。这些实验结果在一定程度上肯定了ECA在免疫保护方面的能力，对于肠杆菌的疫苗开发具有一定的意义。

近年来，对ECA免疫抑制效应也有初步了解。就目前研究而言，对ECA免疫原性有抑制作用的物质可以总结为3类：与ECA发生凝聚反应的LPS、能与ECA复合的膜活性物质及其他有机酸类物质。实验表明，无免疫原性菌株在85%乙醇溶液中溶解部分(ECA) 具有免疫原性，能引发机体产生特异性抗体，而可溶于水部分(LPS) 无免疫原性；若将两者混合，免疫原性显著下降^[47]。若将两者分开，免疫原性又恢复。此外，一些膜活性化合物，如心磷脂、去污剂、甲基软脂酸及神经节苷脂等对ECA免疫原性也有一定的抑制作用，如每毫升含54–540 µg的心磷脂与ECA混合，能显著影响ECA的初次应答。最后，还有证据显示酸处理后的ECA免疫原性降低，如用乙酸处理R1、R4型突变体(R1、R4型均有免疫原性)，R1型ECA免疫原性几乎完全丧失，R4型部分丧失。分析认为在无免疫原性菌株中，ECA与LPS相互作用，发生凝聚反应，使ECA丧失免疫原性。而膜活性物质，如心磷脂，显示与双亲性物质ECA融合特性，两者复合会形成小的凝聚体，改变ECA分子大小，进而影响其免疫原性^[3]。至于酸性物质对ECA免疫原性的影响，可能与ECA本身的化学组成有关。

综上，免疫抑制作用的产生，绝大部分与ECA发生凝聚有关；在某些情况下，凝聚形式的产生可能起决定性作用。另外，影响其本身化学组分稳定的物质对免疫原性也有一定影响。

ECA是肠杆菌家族重要的一类表面抗原，其在细菌毒力^[48]、抗胆酸胆盐^{[10, 49]}、肠道定殖及体内存活，如泳动能力^[50]、维持外膜渗透屏障^[32]等诸多生物学过程中发挥显著作用。研究表明，野生鼠伤寒沙门菌在小鼠腹腔感染中比ECA突变体更具毒性^[48]；沙雷氏菌ΔwecA突变体和野生株引起脓疱所需的剂量，前者是后者2.5倍，证明其是细菌毒力因子^[51]。缺乏ECA的泌尿系大肠杆菌在小鼠泌尿道感染的能力减弱等^[52]；在鼠伤寒沙门氏菌中，ECA突变株能够有效减毒并长时间停留在宿主体内，形成持续感染^[8-9]，这与笔者的实验数据吻合^[8]；通过比较口服和腹腔注射Δwec突变株的毒力特性，发现口服较腹腔注射减毒更多^[10]，分析ECA可能与粘膜相关免疫有关。有人比较沙门菌ECA突变株和野生株抗胆盐能力，结果表明前者较后者敏感，且发现ΔwecD突变株较ΔwecA突变株更敏感^[10]。另外，分泌志贺毒素的E. coli O157:H7在有机酸条件下生长需要ECA的充分表达，这可能是该食源性致病菌的重要致病机制^[53]。群集运动与单个细胞运动不同，不仅要形态变化，还需细胞外物质(润湿剂)，如表面活性剂或脂多糖，以增加表面湿度，从而促进移动^[11]。有证据支持ECA对细菌群集的促进，如Inoue等发现ECA增强了大肠杆菌K-12的群集效应，其原因可能是ECA在大肠杆菌中发挥润湿剂的作用^[50]。此外，ECA与细菌鞭毛合成联系紧密^[54]。Castelli等发现沙雷氏菌Δwec突变株鞭毛合成受阻；可能的机制是Δwec突变株磷脂酶(PhIA)的分泌或者表达受到抑制^[55]，导致鞭毛组装阶段阻断，进而鞭毛合成受阻^[56]。还有，Mitchell等发现ECA_CYC在维持外膜渗透屏障中也有积极作用，其活性由YhdP蛋白调控^[32]。因此，ECA的有无对细菌的生物学特性有重要影响，可见其在细菌完成生活史的过程中具有无可替代的作用。

一般情况下，在正常或由肠杆菌科细菌引起急性感染的人群中，血清ECA抗体滴度较低^[2]，如因肠杆菌科引起的急性尿路感染、大肠杆菌或沙门氏菌引起的肠炎等。有研究表明，反复静脉注射肠杆菌光滑型野生菌株到家兔体内，只产生很低的ECA抗体滴度，而注射粗糙型(R型) 突变株能产生较高的抗体滴度^[42]。由于肠杆菌感染通常是由光滑菌株引起的，这也就解释了为什么在这类患者的血清中仅出现低滴度的ECA抗体。与之相反，在志贺氏菌病、腹膜炎和慢性尿道感染人群中却又有较高的滴度^[57-61]。研究发现，光滑型志贺氏菌(S型) 正常状态下易转化为粗糙型(R型)；而R型志贺氏菌具有免疫原性，能产生高滴度的ECA抗体，这或许是志贺氏菌病患者血清中出现高滴度抗体的原因。此外，腹膜炎患者体内也可产生高滴度抗体，且体内ECA抗体能持续两年以上^[61]，原因或许也是出现R型突变。还有，在慢性肾盂肾炎病人体内也发现ECA抗体滴度持续显著增高。日本学者Saito I提出，检测ECA抗体水平，对这类疾病的诊断有一定参考价值^[62]。同时也有研究者认为，即使是在低ECA抗体滴度的情况下，对ECA抗体的检测也可能比对O抗体检测能更好地反映尿路大肠杆菌感染的血清学参数^[63]。大多数肠杆菌科细菌是重要的致病菌，尤其是易对器官及腹腔造成感染，因此，肠杆菌共同抗原ECA有可能发展成为此菌科疾病诊断的一种特有抗原。

ECA是肠杆菌科细菌细胞膜的重要组成成分，研究其基因结构与功能对剖析肠杆菌科细菌的致病机理有重要意义。摸索优化ECA纯化方法，对研究其化学组成与特性有推动作用。一些化学特性已被阐明，如ECA呈负电荷(pH 6)^[3]、具有热稳定性(120 ℃)^[1]、耐胰蛋白酶或链霉蛋白酶及抗原性耐碱。分析ECA的分子基础、化学成分及生物合成过程，有利于揭示细菌体内不同形式ECA的产生机制，也有利于通过分子生物学方法改变其寡糖聚合度，掌握ECA结构与其免疫原性之间的关系。随着研究的深入，ECA生物合成过程虽被发现，但聚合后多糖如何链接到磷酸甘油酯、ECA如何被运送到外膜及环状ECA如何环化等仍未研究清楚。近年来，随着测序技术的发展，ECA抗原基因簇已被揭示，这对研究细菌基因与毒力之间的关系有重要意义。虽然现在已发现基因突变株影响细菌毒力，但仍局限于个别细菌或者个别基因，还需要对更多细菌及基因进行广泛而深入的研究。此外，对生物学功能的研究能很好剖析细菌生长、运动及感染途径等之间的联系，从而对ECA毒力有客观全面的认识。另外，鉴于ECA的免疫原性，如何精准改造ECA基因使得细菌减毒的同时又保持其免疫原性；鉴于ECA是肠杆菌共同抗原特性，如何发挥抗ECA抗体在细菌分型及疾病检测中的作用应成为未来的重要研究内容。

预防性疫苗是控制疾病最有效的手段。某些肠杆菌科细菌严重危害人类及动物的健康，凸显了疫苗开发与疾病诊断的急迫性。安全有效是筛选疫苗候选株首要考虑的，笔者的研究表明，基于阿拉伯糖调控rfbB基因表达的突变株是很好的尝试^[8]。此外，多糖-蛋白结合疫苗也是一种可选的方向，如共价结合ECA与碱性疏水性蛋白能激发免疫保护反应。虽然载体蛋白能提高ECA免疫原性，但可能会引起超负荷或免疫抑制。因此筛选安全有效的载体蛋白也是疫苗多糖-蛋白结合疫苗研发关键。考虑ECA抗体水平的差异，尤其集中在几种疾病中。因此，利用ECA抗体水平差异的特点，开发用于检测这几种疾病的有效试剂盒也是可行的。