2021, Vol. 37中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 倪秀梅, 方芳
- Ni Xiumei, Fang Fang
- 融合表达过氧化氢酶提高多铜氧化酶稳定性及降解生物胺能力
- Fusion expression with catalase improves the stability of multicopper oxidase and its efficiency in degrading biogenic amines
- 生物工程学报, 2021, 37(12): 4382-4394
- Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(12): 4382-4394
- 10.13345/j.cjb.200799
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文章历史
- Received: December 17, 2020
- Accepted: March 11, 2021
引用本文
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2. 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122
2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
生物胺(Biogenic amines，BAs) 是生物体内产生的一类低分子量含氮有机化合物的总称[1]。通过食物摄取过量生物胺则会引起头痛、胃和肠道不适以及假性过敏等不良反应，严重时可能危及生命[2-3]。因此，必须对食品中生物胺的含量采取有效措施进行减控。酶法降解生物胺是最具有应用前景的减控措施，无需调整和改变食品发酵工艺，且对食品营养和风味的影响也较小[4]。已经发现某些多铜氧化酶(Multicopper oxidase，MCO) 具有生物胺降解能力，它可以氧化生物胺生成对应的醛、氨和水[5-6]，这类酶广泛存在于动植物和微生物中[7-8]。例如，来源于嗜酸乳酸足球菌Pediococcus acidilactici CECT 5930和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum J16的多铜氧化酶具有降解酪胺的能力[5, 9]。L. plantarum CP3可以合成多铜氧化酶家族的漆酶，该菌株对鱼肉香肠中总生物胺的降解率为77%，对组胺的降解率达到92%[10]。弯曲乳杆菌Lactobacillus curvatus G-1的多铜氧化酶表现出较高的BAs降解活性，对常见的6种生物胺的降解率均超过40%[11]。来源于发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum的多铜氧化酶对生物胺的降解具有广谱性，可以降解组胺、酪胺等7种生物胺[12]。此外，为了改善多铜氧化酶降解食品中生物胺的应用特性，研究者通过酶分子改造提高了其催化效率和耐盐性等，从而提高了酶对生物胺的降解能力[13]。
MCO用于生物胺降解目前存在的主要问题是酶的催化效率低、稳定性较差和降解率低。这是因为：一方面，生物胺不是MCO的最适底物；另一方面，MCO在氧化生物胺时形成了具有氧化性的中间产物H2O2，H2O2可能会使MCO发生氧化损伤，从而影响MCO的稳定性和持续催化效率[14]。虽然生物胺不是MCO的最适底物，但是MCO是降解多种生物胺最有效的酶[15]。因此，减少酶在催化反应中的氧化损伤可能是有效提高MCO性能的一种措施。利用过氧化氢酶(Catalase，CAT) 来分解中间产物H2O2，可使H2O2快速被清除[16]。通过特定的连接方式将两种功能相似或互补的酶连接起来共同表达，是同时获得两种单功能酶各自功能较常用的一种手段，可以达到功能叠加的良好效果[17-21]。本研究将通过构建MCO与CAT的融合酶(MCO & CAT)，期望提高MCO的催化效率和稳定性，改善其对生物胺的降解能力，为改善多铜氧化酶的应用特性提供思路。
1 材料与方法 1.1 菌株与质粒本研究所用菌株和质粒见表 1，均为本实验室保藏或本研究构建。
| Names | Descriptions | Sources |
| Strains | ||
| Escherichia coli BL21(DE3) | Expression host | Lab stock |
| MCOF | E. coli BL21 harboring pET28a/MCOF | This work |
| CAT | E. coli BL21 harboring pET28a/CAT | This work |
| MCOF & CAT | E. coli BL21 harboring pET28a/MCOF & CAT | This work |
| MCOF-GGGGS-CAT | E. coli BL21 harboring pET28a/MCOF-GGGGS-CAT | This work |
| MCOF-(GGGGS)2-CAT | E. coli BL21 harboring pET28a/MCOF-(GGGGS)2-CAT | This work |
| MCOF-EAAAK-CAT | E. coli BL21 harboring pET28a/MCOF-EAAAK-CAT | This work |
| MCOF-(EAAAK)2-CAT | E. coli BL21 harboring pET28a/MCOF-(EAAAK)2-CAT | This work |
| CAT & MCOF | E. coli BL21 harboring pET28a/CAT & MCOF | This work |
| CAT-GGGGS-MCOF | E. coli BL21 harboring pET28a/CAT-GGGGS-MCOF | This work |
| CAT-(GGGGS)2-MCOF | E. coli BL21 harboring pET28a/CAT-(GGGGS)2-MCOF | This work |
| Plasmids | ||
| pET28a | Expression vector, kanR | Lab stock |
| pET28a/MCOF | Expression of Lactobacillus fermentum Y29 MCO | This work |
| pET28a/CAT | Expression of Bacillus subtilis WSHDZ-01 CAT | This work |
| pET28a/MCOF & CAT | Expression of MCOF & CAT | This work |
| pET28a/MCOF-GGGGS-CAT | Expression of MCOF-GGGGS-CAT | This work |
| pET28a/MCOF-(GGGGS)2-CAT | Expression of MCOF-(GGGGS)2-CAT | This work |
| pET28a/MCOF-EAAAK-CAT | Expression of MCOF-EAAAK-CAT | This work |
| pET28a/MCOF-(EAAAK)2-CAT | Expression of MCOF-(EAAAK)2-CAT | This work |
| pET28a/CAT & MCOF | Expression of CAT & MCOF | This work |
| pET28a/CAT-GGGGS-MCOF | Expression of CAT-GGGGS-MCOF | This work |
| pET28a/CAT-(GGGGS)2-MCOF | Expression of CAT-(GGGGS)2-MCOF | This work |
试剂：LB液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。LB固体培养基加15%琼脂粉；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)；质粒提取试剂盒(生工生物工程(上海) 股份有限公司)；PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa)；生物胺标准品(Sigma)；其他试剂为分析纯试剂。
仪器：Gel Doc凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；超声波细胞破碎仪(SM-150 D)；安捷伦1260高效液相色谱(HPLC) (美国安捷伦公司)；AKTA蛋白纯化仪(美国GE公司)。
1.3 过氧化氢对多铜氧化酶稳定性的影响将2 000 U/L的多铜氧化酶纯酶或等量的多铜氧化酶与过氧化氢酶纯酶(1 000 U/L) 混合液置于含有不同浓度H2O2 (0–30 mmol/L) 的磷酸盐缓冲液中，4 ℃放置2 h后测定其残余酶活力并计算酶活的相对值。
1.4 多铜氧化酶和过氧化氢酶融合酶的构建多铜氧化酶MCOF及其融合酶构建方法如图 1所示。以编码多铜氧化酶(MCOF，来源于发酵乳杆菌Y29，基因长度为1 539 bp)[22]和过氧化氢酶(CAT，来源于枯草芽孢杆菌WSHDZ-01，基因长度为1 452 bp)[23]的基因为模板，通过扩增将两个基因以顺序直接融合或在基因间分别插入不同的接头：GGGGS、(GGGGS)2、EAAAK、(EAAAK)2。扩增条件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。本研究所用引物如表 2所示。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行验证，并用柱回收试剂盒(Thermo Fisher) 纯化回收。将获得的片段与线性化载体pET28a按照Gibson组装方法进行连接[24]，转入大肠杆菌E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中。将成功构建并测序正确的转化子用于后续研究。
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| 图 1 多铜氧化酶与过氧化氢酶融合表达的构建策略 Fig. 1 Strategies for fusion expression of multicopper oxidase and catalase. |
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| Names | Primer sequences (5′–3′) | Applications |
| P-L | CAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAG | Amplification of pET28a |
| P-R | GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAA | |
| MCOF-L | AACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAATGAACCAGTTTTCGATTC | Amplification of MCOF |
| MCOF-R | CTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGTGGTGGTGGTGATGATGCATGTGCATCCCCATCTTC | |
| CAT-L | AACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAGTTCAAATAAACTGACAACA | Amplification of CAT |
| CAT-R | CTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGTGGTGGTGGTGATGATGAGAATCTTTTTTAATCGGC | |
| PFA1-L | CAAGAAGATGGGGATGCACATGATGAGTTCAAATAAACTGACAACTA | MCOF & CAT: MCOF-L/PFA1-R, PFA1-L/CAT-R |
| PFA1-R | TAGTTGTCAGTTTATTTGAACTCATCATGTGCATCCCCATCTTCTTG | |
| PFA2-L | CAAGAAGATGGGGATGCACATGGGTGGCGGTGGCTCTATGAGTTCAAATAAACTGACAACTA | MCOF-GGGGS-CAT: MCOF-L/PFA2-R, PFA2-L/CAT-R |
| PFA2-R | TAGTTGTCAGTTTATTTGAACTCATAGAGCCACCGCCACCCATGTGCATCCCCATCTTCTTG | |
| PFA3-L | CAAGAAGATGGGGATGCACATGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGATGAGTTCAAATAAACTGACAACTA | MCOF-(GGGGS)2-CAT: MCOF-L/PFA3-R, PFA3-L/CAT-R |
| PFA3-R | TAGTTGTCAGTTTATTTGAACTCATCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCATGTGCATCCCCATCTTCTTG | |
| PFA4-L | CAAGAAGATGGGGATGCACATGGAAGCTGCGGCAAAAATGAGTTCAAATAAACTGACAACTA | MCOF-EAAAK-CAT: MCOF-L/PFA4-R, PFA4-L/CAT-R |
| PFA4-R | TAGTTGTCAGTTTATTTGAACTCATTTTTGCCGCAGCTTCCATGTGCATCCCCATCTTCTTG | |
| PFA5-L | CAAGAAGATGGGGATGCACATGGAAGCTGCGGCAAAAGAAGCAGCGGCTAAAATGAGTTCAAATAAACTGACAACTA | MCOF-(EAAAK)2-CAT: MCOF-L/PFA5-R, PFA5-L/CAT-R |
| PFA5-R | TAGTTGTCAGTTTATTTGAACTCATTTTAGCCGCTGCTTCTTTTGCCGCAGCTTCCATGTGCATCCCCATCTTCTTG | |
| PFA6-L | GCCGATTAAAAAAGATTCTATGAATGAACCAGTTTTCGATTC | CAT & MCOF: CAT-L/PFA6-R, PFA6-L/MCOF-R |
| PFA6-R | GAATCGAAAACTGGTTCATTCATAGAATCTTTTTTAATCGGC | |
| PFA7-L | GCCGATTAAAAAAGATTCTGGTGGCGGTGGCTCTATGAATGAACCAGTTTTCGATTC | CAT-GGGGS-MCOF: CAT-L/PFA7-R, PFA7-L/MCOF-R |
| PFA7-R | GAATCGAAAACTGGTTCATTCATAGAGCCACCGCCACCAGAATCTTTTTTAATCGGC | |
| PFA8-L | GCCGATTAAAAAAGATTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGATGAATGAACCAGTTTTCGATTC | CAT-(GGGGS)2-MCOF: CAT-L/PFA8-R, PFA8-L/MCOF-R |
| PFA8-R | GAATCGAAAACTGGTTCATTCATCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCAGAATCTTTTTTAATCGGC | |
| Note: the homology sequences that used for Gibson assembling are underlined. | ||
将表达MCOF、CAT和融合酶的重组大肠杆菌接种到LB培养基中，在37 ℃、220 r/min条件下培养12 h，再按照2%的接种量转入TB培养基中培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG和1 mmol/L Cu2+，20 ℃下诱导表达20 h。发酵液在4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min后收集菌体，用20 mmol/L PBS (pH 7.4) 洗涤2次后置于冰水浴上进行超声破碎。超声破碎条件：工作2 s，停3 s，破碎时间10 min。在4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min收集上清液，获得MCOF、CAT和融合酶MCOF & CAT的粗酶液。酶的纯化采用镍柱亲和层析法[25]，用含0.5 mol/L咪唑的PBS溶液(pH 7.4) 进行梯度洗脱，收集有活性的组分脱盐后用于后续研究。
1.6 酶活力测定 1.6.1 多铜氧化酶活力测定采用可见光分光光度法测定多铜氧化酶活力[26]：即以2, 2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 为底物，通过检测ABTS被氧化的量来计算多铜氧化酶的酶活力。反应时间为1 min，反应体系为50 μL酶液、950 μL含1 mmol/L ABTS和1 mmol/L CuCl2的50 mmol/L柠檬酸缓冲液。在50 ℃、pH 3.5的条件下，每分钟氧化1 μmol ABTS所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
1.6.2 过氧化氢酶活力测定采用可见光分光光度法测定过氧化氢酶活力[27]：反应体系为1 mL，将50 μL待测酶液快速加入到0.95 mL含10 mmol/L H2O2的50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液中，用UV-2450型紫外-可见光分光光度计于240 nm处测定H2O2的分解。在50 ℃、pH 3.5的条件下，每分钟分解1 μmol H2O2所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
1.7 多铜氧化酶融合酶稳定性分析将酶量为2 000 U/L的多铜氧化酶或融合酶纯酶置于含有20 mmol/L H2O2的磷酸盐缓冲液中4 ℃放置2 h，通过测定其残余酶活力分析酶对过氧化氢的稳定性。将酶量为4 000 U/L的多铜氧化酶或融合酶纯酶置于含有100 mg/L组胺的磷酸盐缓冲液(调节pH至4.5) 中37 ℃保温48 h，每隔8 h测定残余酶活力，分析酶在降解组胺过程中的稳定性。
1.8 多铜氧化酶融合酶酶学性质分析 1.8.1 酶最适反应pH及pH稳定性测定测定酶最适反应pH时，将4 000 U/L纯酶与含有1 mmol/L ABTS和1 mmol/L CuCl2的50 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 2.5–5.0)混合，以测得的最高酶活力为100%，分别计算其他pH条件下的相对酶活。测定酶在不同pH下稳定性时，将4 000 U/L纯酶置于50 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 2.5–5.0) 中，4 ℃放置2 h后测定残余酶活。
1.8.2 酶最适反应温度及温度稳定性测定测定酶最适反应温度时，将4 000 U/L多铜氧化酶或其融合酶纯酶与含有1 mmol/L ABTS和1 mmol/L CuCl2的50 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5) 混合，测定不同温度(35–75 ℃) 下的酶活力，以测得的最高酶活力为100%，分别计算其他温度下的相对酶活。测定酶在不同温度下稳定性时，将4 000 U/L多铜氧化酶或其融合酶纯酶置于50 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5) 中，在不同温度(35–75 ℃) 下处理2 h后测定残余酶活。
1.9 酶对生物胺降解能力分析将2 000 U/L多铜氧化酶或融合酶纯酶分别与组胺、腐胺、尸胺3种单胺溶液(50 mg/L，pH 4.5)混合，在37 ℃反应48 h测定未被降解的生物胺含量。
1.10 生物胺含量测定待测样品或生物胺标准品溶液用丹磺酰氯衍生后，采用高效液相色谱(HPLC) 法进行定量测定[28]。色谱条件：流动相A为乙腈、流动相B为超纯水，柱温为30 ℃，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，紫外检测波长为254 nm。洗脱程序：0–7 min内，流动相A为55%，7–14 min内，流动相A为65%，然后在70%下保持6 min，最后1 min流动相A由70%恢复到55%。
2 结果与分析 2.1 过氧化氢对多铜氧化酶稳定性的影响多铜氧化酶在降解生物胺反应中生成的H2O2可能会使多铜氧化酶发生氧化损伤，对酶的稳定性产生影响。由图 2可知，5 mmol/L的H2O2即可使来源于发酵乳杆菌的多铜氧化酶MCOF稳定性降低；当体系中H2O2大于5 mmol/L时，MCOF的残余酶活力低于50%。在体系中添加CAT则使MCOF的稳定性显著提高，即使在30 mmol/L H2O2的条件下，MCOF的残余酶活力仍在90%以上。这说明H2O2对MCOF的稳定性产生了显著影响，而CAT能有效保护MCOF免受H2O2的损害。
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| 图 2 H2O2及过氧化氢酶对多铜氧化酶稳定性的影响 Fig. 2 Effect of H2O2 and CAT on the stability of MCOF. |
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为了增强多铜氧化酶抵御H2O2的能力和提高多铜氧化酶的稳定性，在大肠杆菌E. coli BL21中成功构建并表达了重组多铜氧化酶MCOF、重组过氧化氢酶CAT和8种不同方式连接的融合酶MCOF & CAT (图 3)。由图 4可知，8种MCOF融合酶均具有MCOF和CAT的酶活性，说明融合酶表达成功，但酶表达水平略有差异。这可能是重组酶因连接方式不同而使MCOF酶的活性和表达水平存在一定的差异性[29]。因此，几种融合酶的酶学性质还需要通过进一步的研究进行比较。
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| 图 3 多铜氧化酶、过氧化氢酶及其融合酶的表达 Fig. 3 Expression of MCOF, CAT and their fusion proteins. Arrows indicate expressed target proteins. M: marker; 1: control; 2: MCOF; 3: CAT; 4: MCOF & CAT; 5: MCOF-GGGGS-CAT; 6: MCOF-(GGGGS)2-CAT; 7: MCOF-EAAAK-CAT; 8: MCOF-(EAAAK)2-CAT; 9: CAT & MCOF; 10: CAT-GGGGS-MCOF; 11: CAT- (GGGGS)2-MCOF. |
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| 图 4 重组多铜氧化酶表达水平分析 Fig. 4 Expression levels of recombined MCOFs. |
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已有研究证实，10 mmol/L H2O2可使氧化酶发生氧化损伤甚至导致酶失活[30-31]。为了考察CAT是否具有缓解MCO氧化损伤的作用，比较了20 mmol/L H2O2对MCOF和融合酶稳定性的影响。由图 5可知，融合酶在20 mmol/L H2O2中的稳定性显著高于MCOF，残余酶活力是MCOF的1.51–1.68倍。此外，在MCOF的N端融合CAT可使酶对H2O2的耐受性更强。因此，融合酶的活性和稳定性差异可能与酶的融合顺序有关[32-33]。
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| 图 5 H2O2对MCOF和其融合酶稳定性的影响 Fig. 5 Effect of H2O2 on the stability of MCOF and its fusion enzymes. |
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为了进一步了解多铜氧化酶在降解生物胺过程中融合CAT对其稳定性的影响，考察了多铜氧化酶及其融合酶在降解组胺过程中的酶活力变化。由图 6可知，在MCOF的C端融合CAT，24 h后融合酶的CAT活性低于20%；而在MCOF的N端融合CAT，48 h时融合酶的CAT活性仍有30%以上(图 6C–D)。除CAT & MCOF和MCOF-(EAAAK)2-CAT外，其他融合酶在催化过程中的稳定性均低于MCOF (图 6A–B)。CAT & MCOF在降解组胺过程中的稳定性最好，残余酶活比MCOF高9.48%–17.32% (图 6B)。由此说明，融合CAT可以提高MCO在降解组胺时的稳定性。因此，选择稳定性最好的融合酶CAT & MCOF用于后续酶的性质研究。另外，在2个酶之间添加肽接头(GGGGS)n没有提高MCOF在催化过程中的稳定性，这可能是因为融合蛋白不稳定以及融合蛋白在分子空间距离上的增加使H2O2不能有效地传递给CAT分解[34]。
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| 图 6 MCOF及其融合酶在降解组胺过程中的稳定性比较 Fig. 6 The stability of MCOF and its fusion enzymes during the degradation of histamine. |
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研究融合酶CAT & MCOF的酶学特性有助于更好地对其进行应用。通过比较酶反应动力学参数可知，以ABTS为底物时，融合酶CAT & MCOF对底物的亲和力(Km) 比MCOF提高了1.00倍，催化效率(kcat/Km) 提高了1.71倍，摩尔比酶活提高了1.23倍(表 3)。引起这种变化可能来源于两个方面的原因：融合CAT后引起MCOF空间结构上的变化，使底物更易与MCOF结合[35-36]；CAT及时分解产物H2O2促进了MCOF氧化底物时电子的传递[37]。
| Enzymes | Km (mmol/L) | kcat (/s) | kcat/Km (L/(μmol·s)) | Specific activity (U/mg) | Specific activity (U/μmol) |
| MCOF | 1.54 | 3.41 | 2.21 | 28.59 | 1 674.48 |
| CAT & MCOF | 0.77 | 4.59 | 5.99 | 32.25 | 3 731.95 |
CAT提高氧化酶类催化效率的机制目前尚不完全清楚[38]。为进一步揭示融合酶CAT & MCOF催化效率提高的原因，我们比较了等摩尔MCOF、CAT、CAT & MCOF氧化ABTS的速率。由图 7可以看出，融合CAT能显著提高MCOF的催化速率，融合酶CAT & MCOF对ABTS的氧化平均速率是MCOF的2.60倍。有研究表明，通过融合CAT能使超氧化物歧化酶(SOD) 对超氧阴离子(•O2–)的清除能力提高2.44倍，且融合酶具有比SOD更高的稳定性[39]。由此可见，通过融合CAT可有效提高某些氧化酶对氧胁迫的耐受性和稳定性。
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| 图 7 MCOF与其融合酶对ABTS氧化速率的比较 Fig. 7 Comparison of the oxidation rate of ABTS by MCOF and CAT & MCOF. |
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pH和温度是影响酶催化活性的重要因素，研究二者对酶活性和稳定性的影响对评估其应用特性至关重要。本研究发现，融合酶CAT & MCOF的最适反应pH和最适反应温度均未发生改变(图 8A，图 9A)。但是在酸性条件下，CAT & MCOF的活性显著高于MCOF的活性。其中，CAT & MCOF在pH 4.5条件下的酶活是MCOF的4.02倍。另外，在酸性(pH 2.5–4.5) 和中高温(35–55 ℃) 条件下，CAT & MCOF的稳定性较MCOF都有不同程度的提高(图 8B，图 9B)。分子改造也是常用的提高酶稳定性的技术手段之一。已有研究采用定点突变改造了来源于芽孢杆菌的MCOB，使其在pH 2.5–5.0范围内的稳定性提高了约11%–90%，但此突变体在45–55 ℃下的稳定性却下降了约14%–51%[40]。由此可见，融合表达具有减弱H2O2氧化作用的CAT，对提高氧化酶在不同pH范围和中高温条件下的稳定性具有一定的优势。
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| 图 8 MCOF和CAT & MCOF最适反应pH和在不同pH下的稳定性 Fig. 8 The optimal pH and the stability under different pH of MCOF and CAT & MCOF. |
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| 图 9 MCOF和CAT & MCOF最适反应温度和在不同温度下的稳定性 Fig. 9 The optimal temperature and the stability under different temperature of MCOF and CAT & MCOF. |
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融合酶CAT & MCOF以ABTS为底物时的催化效率和稳定性都得到了显著提高。为了进一步验证融合酶CAT & MCOF降解生物胺能力的改善，考察了CAT & MCOF和MCOF对3种单胺(组胺、腐胺、尸胺) 的降解效果。由图 10可知，融合酶CAT & MCOF对3种单胺的降解能力都显著高于MCOF。其中CAT & MCOF对腐胺的降解能力提高最显著，比MCOF提高了1.33倍(图 10A)。CAT & MCOF对尸胺和组胺的降解能力也有较为明显的改善，对两者的降解率分别为36.0%和57.8%，比MCOF提高了45.7%和38.9% (图 10B–C)。而通过组合突变获得的催化效率和对盐的耐受性均提高的MCOB三突变体T317N/L386Y/S427E在使用与本研究相同酶量降解组胺时，其降解率略低于野生酶；只有当酶的用量高于10 000 U/L时，该突变体对组胺的降解率才显著高于野生酶，且只提高了30%[40]。由此可以看出，融合CAT的表达策略是改善MCO应用特性的有效方法。
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| 图 10 MCOF和CAT & MCOF降解生物胺的能力比较 Fig. 10 Comparison of the efficiency of MCOF and CAT & MCOF in degradation of biogenic amines. |
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利用生物酶法降解发酵食品中的生物胺是目前控制食品中生物胺含量最有前景的措施之一。MCO作为一种广谱生物胺降解酶用于生物胺降解目前存在的主要问题是酶的催化效率低、稳定性较差和降解率低。本研究通过融合可消除H2O2的CAT，获得了1个稳定性和催化效率显著提高的融合酶CAT & MCOF。以ABTS为底物时，CAT & MCOF对底物的亲和力是MCOF的2倍，其催化效率、催化速率和在酸性与中高温条件下的稳定性较MCOF均得到显著提高。此外，融合酶CAT & MCOF对腐胺、尸胺和组胺的降解能力也有显著提高，分别比MCOF提高了132.5%、45.7%和38.9%。在本研究的基础上，今后可以通过融合酶构建策略优化、融合酶表达优化等方法进一步提高MCO对生物胺的降解率和降解效率，推进MCO用于生物胺降解的工业应用进程。
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