絮凝是指酵母细胞之间相互粘附、聚集成团的现象，该过程是无性的、可逆的，且依赖于钙离子的存在^[1]。酵母的絮凝为工业生产提供了有效、便利的产物和细胞的分离方式，大幅节约了生产成本，且有助于酵母细胞的回收和再利用^[2]。

啤酒酵母是啤酒酿造的灵魂，可分为拉格型(Lager) 和艾尔型(Ale) 两类。目前我国的市售啤酒中90%以上为拉格啤酒。拉格型啤酒酵母Saccharomyces pastorianus由酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和真贝酵母Saccharomyces eubayanus杂交而来^[3]，发酵温度一般在8–15 ℃。对啤酒酿造而言，酵母絮凝性能的好坏与啤酒的出酒率、透明度和过滤性能直接相关。絮凝性过强可能导致糖利用不完全或发酵速率迟缓，而絮凝性过差则会造成过滤困难^[4-6]。所以，在不影响发酵性能的情况下适度提高啤酒酵母的絮凝能力，对于啤酒生产有重要意义。

酵母的絮凝是细胞壁表面絮凝蛋白与相邻酵母细胞壁外侧甘露糖残基的特异性结合^[1]。絮凝蛋白由FLO基因家族编码，主要为FLO1、FLO5、FLO9、FLO10和Lg-FLO1^[7]。酵母絮凝的调控机制十分复杂，不仅受菌株遗传背景的影响，而且受温度、氧气、pH、乙醇浓度、营养等因素的影响^[7-10]。有研究发现，在缺氧条件下，脂质不饱和度的降低会激活内质网膜流动性传感器，从而诱导FLO1的表达^[11]，促进絮凝的发生；氮源饥饿引起Lg-FLO1基因表达量上调^[8]，诱导啤酒酵母的絮凝。酵母絮凝还受保守的MAPK信号通路的调节，依赖于MAPK Slt2及细胞壁完整性(Cell wall integrity，CWI) 途径中Rlm1的激活^[12]。

本实验室前期对一株工业用拉格型啤酒酵母G03及其絮凝突变株进行了比较基因组学分析，发现基因RIM21在突变菌中发生了移码突变。移码突变会导致基因编码的蛋白质序列发生改变，从而使基因表达产物的功能丧失。Rim21是碱性pH响应途径RIM101通路的传感器^[13]，在碱性pH压力响应、盐胁迫响应^[14]、弱酸胁迫响应^[15]等方面均能发挥作用。研究表明，Rim21与MAP激酶Slt2并行参与细胞壁的组装^[16]，但其具体的作用机制尚不明确。Rim21还可作为质膜传感器，通过感知质膜的脂质不对称来响应内质网压力应激^[17]。转录组学研究显示，絮凝型和非絮凝型酵母的差异表达基因与胁迫响应、细胞壁重构有关^[18]。因此，结合文献报道，推测RIM21基因缺失对拉格酵母G03的絮凝性能具有重要影响。为了验证这一推测，本研究构建了RIM21缺失的G03重组菌，探究了该基因缺失对菌株在低温发酵条件下的絮凝性能、发酵性能和胁迫耐受性能的影响。通过分析FLO基因及细胞壁完整性途径基因的表达量，初步分析了RIM21缺失对菌株絮凝性能的影响机制。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 菌株与培养基

拉格啤酒酵母S. pastorianus G03：中国某啤酒厂使用工业酵母，实验室保藏；质粒pUG6：实验室保藏。

YPD培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，酪蛋白胨20；固体培养基添加20 g/L琼脂粉；抗性筛选培养基添加G418至终浓度为200 μg/mL。

12 °P麦汁发酵培养基：制备方法参考文献[19]所述。

1.1.2 实验试剂

酵母提取物、硫酸钙、醋酸钠、葡萄糖、乙酸、乙二胺四乙酸-二钠、氯化钠、氯化钾、乙醇等试剂，均购于国药集团化学试剂有限公司；酪蛋白胨购于生工生物工程(上海) 股份有限公司；钙荧光白购于Sigma；DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京) 有限公司。PrimeSTAR^® Max DNA聚合酶购于宝日医生物技术(北京) 有限公司。

0.051%硫酸钙溶液：称取0.51 g硫酸钙溶解于1 L蒸馏水。

醋酸钠-硫酸钙缓冲液：称取0.51 g硫酸钙、6.8 g醋酸钠和4.05 g乙酸溶解于1 L蒸馏水中，再加入4.5%的乙醇。用醋酸调节pH至4.5。

5 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 溶液：称取1.68 g EDTA-2Na溶解于1 L蒸馏水。

1.2 仪器与设备

恒温生化培养箱，上海博迅实业有限公司；组合式摇箱，太仓市强乐实验设备有限公司；旋涡混合仪，骋克仪器(上海) 有限公司；Five Easy Plus台式pH计，METTLER TOLEDO公司；紫外可见分光光度计，UNICO (上海) 仪器有限公司；PCR仪，美国Bio-Rad公司；Anton Paar全自动啤酒分析仪，安东帕(上海) 商贸有限公司。

1.3 实验方法 1.3.1 重组菌的构建

根据NCBI中酿酒酵母S288c的RIM21基因(Gene ID：855422) 序列来设计同源重组敲除引物，引物列表见表 1。参考Baudin等^[20]的短侧翼同源区PCR介导的基因破坏方法(SFH-PCR)，使用引物RIM21-a和RIM21-b，以质粒pUG6为模板，通过PCR扩增获得含有G418抗性的基因破坏盒，抗性基因两端分别为基因RIM21蛋白质编码区上游66 bp和下游68 bp的同源序列。采用电转化的方法将基因破坏盒导入啤酒酵母感受态细胞中。感受态细胞的制备及电转化方法参考文献[21]所述。转化后的细胞涂布至含有200 μg/mL G418的YPD平板上，28 ℃培养2–3 d后挑取转化子，使用两对引物RIM21-LA和KAN-1、RIM21-RA和KAN-2对转化子DNA进行PCR验证。

1.3.2 重组菌的遗传稳定性

将重组菌在不含G418抗性的液体YPD培养基中28 ℃、180 r/min连续转接10代，并用第10代重组菌分别在不含G418抗性和含有G418抗性的YPD平板上划线。

1.3.3 生长曲线的测定

从固体培养基中挑取一环酵母单菌落于5 mL液体YPD培养基中，28 ℃、180 r/min培养过夜后，接种至100 mL YPD中，调整初始OD₆₀₀为0.1。定期取样，在波长600 nm处测定吸光值。

1.3.4 啤酒发酵实验

本研究中的啤酒发酵实验均在三角瓶中进行。酵母菌株经过活化并扩培后，以1.2×10⁷个细胞/mL的浓度接种到装有150 mL 12 °P麦汁的锥形瓶中，11 ℃静置发酵7 d。每个锥形瓶需用单向排气阀加水密封以模拟厌氧发酵条件。

1.3.5 啤酒酵母絮凝性能的测定

定量测量絮凝F值：从发酵液中收集酵母细胞，用去离子水洗涤两次后再次重悬于去离子水，并调整细胞浓度至4.5×10⁷个/mL，根据Bendiak等^[22]描述的方法测定絮凝F值。

定性观察：取1 mL细胞悬浮液，经0.051%硫酸钙溶液洗涤后重悬于1 mL醋酸钠-硫酸钙缓冲液中，转移至1.5 mL EP管或35 mm培养皿中，充分扰动后静置10 min再观察。

1.3.6 啤酒酵母发酵性能的测定

在发酵过程中，每日测定锥形瓶中的二氧化碳排放量，作为评价发酵速率和性能的初级指标。发酵结束后，采用全自动啤酒分析仪测定成品啤酒的理化指标，如酒精含量、表观发酵度和真实发酵度。

1.3.7 酵母细胞胁迫耐受分析

从固体培养基中挑取酵母单菌落于5 mL YPD培养基中，28 ℃、180 r/min培养过夜后，以1%接种量转接至20 mL YPD培养基中。28 ℃、180 r/min培养8 h后，将培养液离心并收取酵母细胞。用无菌水将细胞洗涤2次后，调整细胞浓度至4.5×10⁷个/mL，并分别稀释10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍，共6个浓度梯度。吸取5 μL不同浓度梯度的酵母菌液点样于含有0.5 mol/L氯化钾、30 μg/mL钙荧光白、30 μg/mL刚果红、10%乙醇的YPD平板上，28 ℃培养60 h。

1.3.8 基因表达量的测定

从发酵液中收集酵母细胞并用无菌水洗涤2次。提取酵母中的总RNA后，使用TaKaRa公司逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit，将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，ACT1为内参基因，根据文献[12]描述的方法测定并分析目标基因的表达量。

2 结果与分析 2.1 RIM21缺失的G03基因工程菌的构建

为了构建RIM21缺失的G03基因工程菌，使用引物RIM21-a和RIM21-b，以含有KanMX抗性的质粒pUG6为模板，通过PCR扩增获得RIM21基因破坏盒。PCR产物经纯化后，通过电击转化法导入啤酒酵母G03中。分别使用两对引物RIM21-LA和KAN-1、RIM21-RA和KAN-2，对转化子基因组进行PCR验证。琼脂糖凝胶电泳检测显示了敲除成功的重组菌株G03-RIM21Δ (图 1)。

2.2 重组菌G03-RIM21Δ的遗传稳定性

为验证重组菌的遗传稳定性，将出发菌和重组菌在不含G418抗性的液体YPD中连续转接10次，并用第10代菌液划线，结果如图 2所示。图 2B抗性平板中的空白区域为出发菌划线，其余区域均为重组菌划线。结果表明，在传代10次后，重组菌仍然可以在含有G418的YPD平板上生长，表明重组菌的遗传稳定性良好。

2.3 重组菌G03-RIM21Δ与出发菌G03的生长性能比较

为了分析出发菌G03及重组菌G03-RIM21Δ的生理性能，测定了它们在YPD中的生长曲线。图 3的结果显示，G03和G03-RIM21Δ在28 ℃条件下的YPD中都能正常生长，G03在9 h左右进入对数生长期，G03-RIM21Δ的生长则略有延迟。G03-RIM21Δ与G03整体生长趋势基本一致，生长性能没有明显差别。

2.4 重组菌G03-RIM21Δ和出发菌G03的絮凝性能对比

在11 ℃条件下，在浓度为12 °P的麦汁中，对出发菌G03和重组菌G03-RIM21Δ进行发酵，并在发酵过程中测定了菌株的絮凝F值。由图 4可知，在发酵过程中，两株菌的絮凝F值均随着发酵的进行而增长，重组菌的絮凝F值始终高于出发菌。

在发酵结束时，对重组菌和出发菌细胞的絮凝情况进行定性观察。图 5A显示了细胞在醋酸钠-硫酸钙缓冲液中的沉降速度，重组菌的沉降速度明显快于出发菌；由图 5B可知，重组菌的细胞聚集程度明显强于出发菌。

表 2比较了常温(25 ℃) 和低温(11 ℃) 发酵结束后出发菌和重组菌的絮凝F值。低温发酵结束后，重组菌的絮凝F值比出发菌增加了20.06%；然而，常温条件下二者的F值并无明显差异。上述结果表明，基因RIM21的缺失会导致拉格酵母G03在低温发酵后的絮凝能力明显增强。

2.5 重组菌G03-RIM21Δ和出发菌G03的发酵性能对比

在11 ℃发酵过程中，对出发菌和重组菌的每日CO₂失重进行测定，可以初步判定重组菌在低温发酵时的发酵速率。如图 6所示，出发菌与重组菌的发酵速率没有明显差别。发酵结束后，重组菌与出发菌的酒精度、表观发酵度和真实发酵度也没有明显区别(图 7)，表明RIM21的缺失不会对G03的发酵能力造成不良影响。

2.6 RIM21的缺失对菌株胁迫耐受性的影响

为了解基因RIM21缺失对菌株G03的影响，按照1.3.6所述的方法对比了出发菌和重组菌对不同胁迫的耐受性，结果如图 8所示。在0.5 mol/L KCl的渗透压胁迫下，重组菌的生长未受到明显抑制。与出发菌相比，RIM21的缺失使重组菌对10%乙醇胁迫的耐受性略有减弱。

荧光增白剂(Calcofluor white，CFW) 和刚果红(Congo red，CR) 是两种细胞壁抑制剂，其中CFW能与酵母细胞壁中的几丁质结合^[23]，CR能与细胞壁中的β-1, 3葡聚糖结合^[24]，从而造成细胞壁损伤，破坏酵母细胞壁的正常组装，抑制酵母生长。图 8表明，重组菌对这两种细胞壁抑制的抗性明显强于出发菌，表明RIM21的缺失引起了G03细胞壁的重构。通常，酵母细胞壁的重构是酵母细胞应对环境压力的一种方式^[25]。

2.7 RIM21基因缺失促进菌株低温絮凝的机制分析

为了探究在低温发酵条件下RIM21缺失对菌株絮凝性能的影响机制，在发酵96 h时取样，根据1.3.8所述的实验方法测定了出发菌和重组菌FLO基因及细胞壁完整性途径相关基因的表达量，结果如图 9所示。图 9A表明，FLO1和FLO10在出发菌和重组菌中均不表达，重组菌中FLO5和Lg-FLO1表达量分别是出发菌株的2.32倍和3.48倍。图 9B分析了细胞壁完整性途径中基因MID2、WSC1、WSC2、WSC3、RLM1、RHO1、SLT2的表达量。其中，重组菌的RLM1、WSC2、MID2的表达量分别是出发菌的2.96倍、2.15倍和1.77倍。这些结果表明，在低温发酵条件下，RIM21的缺失上调了FLO基因及细胞壁完整性途径的部分基因。

3 讨论

絮凝是酵母重要的生产性状。在发酵结束后，酵母的絮凝将有利于产物和细胞的分离。同时，絮凝也是酵母细胞应对恶劣环境压力时的自我保护机制^[26]。本研究以RIM21为靶基因，通过同源重组法构建了一株RIM21基因缺失的拉格酵母重组菌G03-RIM21Δ。对重组菌进行11 ℃低温发酵，发现基因RIM21的缺失使菌株的絮凝F值增加了20%，使菌株对10%乙醇胁迫耐受略有减弱，但菌株的生长和发酵能力未受影响；同时，RIM21的缺失还增强了菌株对细胞壁抑制剂的抗性。

FLO5和Lg-FLO1的表达对啤酒酵母的絮凝具有重要作用^{[4, 8]}。相对于出发菌株，重组菌中基因FLO5和Lg-FLO1表达的上调，这从转录水平上解释了重组菌絮凝性增强的原因。有文献报道酵母细胞中CWI途径被激活后，FLO基因上调表达^[12]。因此，进一步测定了CWI途径中的相关基因，发现重组菌中的基因WSC2、MID2、RLM1也有上调。WSC2、MID2是细胞壁上的压力传感因子^[23]。Rlm1是CWI途径中关键的转录因子，它参与了CWI途径的激活^[27]。目前尚无文献表明Rim21与Rlm1之间存在相互作用。CWI途径可在多种压力条件下被激活^[28]，因此推测RIM21的缺失可能导致重组菌在低温发酵条件下比出发菌具有更强的压力应激反应，从而导致CWI途径部分基因的上调。对出发菌和重组菌进行比较转录组学和蛋白组学分析，将有助于阐释RIM21基因缺失对啤酒酵母低温絮凝性能的影响机制。

目前，尽管基因工程菌用于啤酒生产仍存在安全风险，但本研究为啤酒酵母的絮凝调控机理提供了一定的理论依据。基因RIM21有望成为工业拉格酵母G03絮凝突变株选育的新靶点。