中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 魏玉霞, 张显, 胡孟凯, 邵宇, 潘珊, 藤田盛久, 饶志明
- Wei Yuxia, Zhang Xian, Hu Mengkai, Shao Yu, Pan Shan, Fujita Morihisa, Rao Zhiming
- D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组枯草芽孢杆菌构建及固定化应用
- Construction and immobilization of recombinant Bacillus subtilis with D-allulose 3-epimerase
- 生物工程学报, 2021, 37(12): 4303-4313
- Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(12): 4303-4313
- 10.13345/j.cjb.210005
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文章历史
- Received: January 3, 2021
- Accepted: March 16, 2021
- Published: March 16, 2021
D-阿洛酮糖是D-果糖C-3差向异构体,属于稀有糖的一种,它具有蔗糖70%的甜度,但热量很低,只有蔗糖的0.3%[1]。2014年,美国食品药品监督管理局(U.S. Food and Drug Administration,FDA) 正式批准D-阿洛酮糖为一般公认安全(Generally recognized as safe,GRAS),允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中[2]。D-阿洛酮糖具有多种保健作用,可抗高血糖症、预防或治疗肥胖及因肥胖引起的炎症、调节胆固醇代谢和调节肠道微生物群发挥其生物学效应。D-阿洛酮糖天然存在于一些水果中,含量极低[3],化学方法合成D-阿洛酮糖步骤烦琐且效率低,经济便捷的生物法合成D-阿洛酮糖成为研究热点。日本香川大学Izumori团队利用1株产碱菌首次实现生物法合成D-阿洛酮糖,并通过固定化酶异构化D-果糖合成D-阿洛酮糖[4-5]。近十年来,已有15种以上的D-阿洛酮糖3-差向异构酶被报道,转化率均在20%–35%,反应条件偏碱性,其中半衰期最久的D-阿洛酮糖3-差向异构酶来源于解纤维梭状芽胞杆菌Clostridium cellulolyticum H10,该酶在60 ℃半衰期为6.8 h[6]。酶分子N端融合双亲短肽是提高热稳定性的有效方法,例如,通过短肽形成的氢键作用提高固定化酶的热稳定性[7]。D-阿洛酮糖为胞内酶,获得纯酶需浓缩、破细胞和纯化等步骤,工业生产选择全细胞催化较为经济快捷。全细胞生物催化,要求宿主细胞是不分泌内毒素、外毒素和异味物质的GRAS菌株,枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌的模式生物,是宿主细胞的最佳选择[8]。
游离的全细胞在催化反应结束后,收集困难并且在重复使用的过程中会造成细胞破损。为了解决游离细胞的生产弊端,固定化细胞技术应运而生,1973年,日本的千畑一郎首次在工业上使用固定化微生物细胞,成功利用固定化大肠杆菌连续生产L-天冬氨酸[9]。固定化细胞制备方法包括吸附法、包埋法、共价法和交联法4种,固定化材料要求无生物毒性,性质稳定,廉价耐用。固定化载体有无机载体(硅藻土、多孔玻璃、金属氧化物)、有机载体(天然多糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇)、复合载体(金属有机框架MOF、海藻酸钠-石墨烯、海藻酸钠-二氧化硅),其中复合载体具有两种固定方法共同作用,例如共价-交联法、吸附-包埋法[10]。孙帆等通过硅藻土-海藻酸钠(吸附-包埋法) 固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase,DPEase) 重组枯草芽孢杆菌,固定化细胞酶活回收率为64%,连续7个转化批次残余酶活保留81%[11]。李秋喜等通过海藻酸钠包埋和戊二醛交联固定化DPEase重组大肠杆菌酶活回收率为76%,重复使用8次后残余酶活保持61%[12]。
本研究通过融合双亲短肽(SAPs) 提高了DPEase的热稳定性,并以枯草芽孢杆菌为异源表达宿主,采用传统固定化材料海藻酸钠(Sodium alginate,SA) 为包埋载体,结合具有强吸附能力的新型金属氧化物二氧化钛(Titanium dioxide,TiO2),固定化重组细胞,探索了海藻酸钠浓度、二氧化钛添加比例、钙离子浓度、戊二醛浓度对固定化小球机械强度和异构化D-果糖合成D-阿洛酮糖的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌Escherichia coli DH5α,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168保存于江南大学生物工程学院应用微生物与代谢工程研究室。表达载体pMA5来自本实验室。
1.1.2 酶和试剂质粒小量制备试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,上海捷瑞生物工程有限公司;BamHⅠ、MluⅠ等限制性核酸内切酶与DNA聚合酶购于TaKaRa公司;D-果糖、D-阿洛酮糖购于上海麦克林生化科技有限公司;二氧化钛购于阿拉丁试剂公司;其他常规试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基LB、TB培养基参考TaKaRa商品目录。
1.2 方法 1.2.1 重组菌株的构建以多雷亚菌Dorea sp. CAG317 DPEase (DSDPEase) 基因为模板,克隆得到DSDPEase基因片段,利用重叠延伸PCR (Overlap-extension PCR) 得到不同的融合双亲短肽基因片段SAPs-DSDPEase,所用到的引物见表 1,方法参考李谞的实验方法[13]。质粒pMA5被快速限制性内切酶BamHⅠ、MluⅠ线性化,琼脂凝胶回收后,利用同源重组试剂盒将基因片段SAPs-DSDPEase与线性质粒pMA5连接。重组质粒pMA5-SAPs-DSDPEase转化到E. coil DH5α感受态细胞中,挑取正确的转化子,在10 mL LB液体培养基中过夜培养,质粒经过大量拷贝再使用质粒小量制备盒提取。将获得的pMA5-SAPs- DSDPEase重组质粒转化到B. subtilis 168感受态细胞中,过夜培养,挑取单菌落验证,得到重组菌株B. subtilis 168/pMA5-SAPs-DSDPEase。
Primer names | Primer sequences (5′–3′) | Size (bp) |
DSDPE-F | GCTAAAGCTGAAGCTGAAGCTAAAGCTAAAAAACACGGAATTTACTATGCCTATTGG | 57 |
R-pMA5-DS (MluⅠ-6XHis) |
TTTCGACCTCTAGAACGCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTCCAATCCAACATATATTTCTGGAATGCAAC | 74 |
pMA5 (BamHⅠ)-SAP1-F |
AAGTGAAATCAGGGGGATCCATGGCTGGCGCTGGCGCTACAGCTACAGCTGGCGCTGGCGCTACAGCTACACCTAAACCTAAACCTCCTA | 90 |
pMA5 (BamHⅠ)-SAP2-F |
AAGTGAAATCAGGGGGATCCATGGCTGAAGCTGAAGCTCATGCTCATGCTGAAGCTGAAGCTCATGCTCATCCTAAACCTAAACCTCCTA | 90 |
pMA5 (BamHⅠ)-SAP3-F |
AAGTGAAATCAGGGGGATCCATGGCTGATGCTGATGCTAAAGCTAAAGCTGATGCTGATGCTAAAGCTAAACCTAAACCTAAACCTCCTA | 90 |
The bolded sequence is the gene sequence of SAPs. |
蘸取-80 ℃保存的甘油管菌液在50 μg/mL卡那霉素的LB抗性平板上画线,挑取活化后的单菌落在含有50 μg/mL卡那霉素的10 mL LB液体培养基中过夜培养12 h,以2%的接种量转接到含有50 μg/mL卡那霉素的500 mL TB培养基中,220 r/min、37 ℃,振荡培养24 h,使用高速冷冻离心机收集细胞。
1.2.3 蛋白表达分析收集细胞后,洗涤3次,并浓缩至OD600为60,加入终浓度1 mg/mL的溶菌酶,置于冰上酶解6 h后进行超声破碎。离心后,取上清液,通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
1.2.4 酶活测定酶液酶活测定:取100 μL酶液加入到900 μL底物溶液(100 g/L D-果糖,140 μmol/L Co2+,50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.5) 中,在60 ℃、1 000 r/min振荡金属浴中反应2 min,沸水煮5 min,终止酶催化反应。固定化细胞酶活测定:称取0.5 g固定化细胞,加入1 mL反应溶液(100 g/L D-果糖,140 μmol/L Co2+,50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.5),在60 ℃、1 000 r/min振荡金属浴中反应2 min,使用移液枪取上清液,置于沸水中煮5 min,终止反应。
酶活单位定义:在pH 8.5 Tris-HCl缓冲液中,振荡金属浴60 ℃、1 000 r/min条件下,1 min生成1 μmol D-阿洛酮糖作为一个酶活单位。
酶活回收率:固定化细胞的酶活回收率是指固定化细胞的总活力与用于固定化的全细胞总活力的百分率。
酶活回收率(%)=(固定化酶总活力)/(用于固定化的总酶活力)×100
相对活性(%)=相同反应条件固定化细胞活性/相同反应条件固定化细胞最大活性×100
分析方法:反应溶液稀释相应倍数过0.22 μm纤维滤膜,使用安捷伦1260高效液相色谱RID检测器分析,分析条件为液相色谱柱HI-Plex Ca,300.0 mm×7.7 mm,柱温80 ℃,流动相超纯水,流速0.4 mL/min,单个样品运行时间40 min,检测器温度55 ℃。
1.2.5 热稳定性测定将DSDPEase、SAP1-DSDPEase、SAP2- DSDPEase、SAP3-DSDPEase、SAP4-DSDPEase纯酶置于40 ℃水浴锅孵育48 h,每隔6 h取出100 μL,按照1.2.4酶活测定方法检测残余酶活。
1.2.6 重组枯草芽孢杆菌固定化称取适量海藻酸钠,加入10 mL去离子水,加热搅拌至海藻酸钠全部融化,加入适量比例的二氧化钛,超声处理5 min,使各组分分散均匀,置于冰上冷却20 min,加入5 mL菌液,搅拌均匀。使用带有针头的10 mL注射器吸取混合液,在10 cm高处以1滴/s的速度滴入CaCl2溶液中,随即形成大小均一的光滑小球,0–4 ℃静置硬化一段时间。硬化结束,将固定化小球悬浮于0.03%的戊二醛溶液中交联,然后使用生理盐水洗涤3次,真空抽滤,吸取固定化小球表面水分,置于4 ℃备用。
1.2.7 固定化细胞条件优化采用单因素试验对海藻酸钠浓度、二氧化钛比例、CaCl2浓度、戊二醛浓度和细胞包埋量等固定化条件进行优化。海藻酸钠浓度2%,二氧化钛︰海藻酸钠1︰2,CaCl2浓度1%,戊二醛浓度0.01%,控制其中3个因素不变,单因素作为变量来考察每个因素对固定化细胞相对酶活回收率和机械强度的影响。
1.2.8 固定化细胞和游离细胞的最适反应温度和pH配制不同pH的缓冲液,pH 3.0–6.0 C6H8O7- Na3C6H5O7缓冲液,pH 6.0–8.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液,pH 8.0–9.0 Tris-HCl缓冲液,称取等量固定化小球,在不同pH缓冲液中按照1.2.4酶活测定方法,确定固定化细胞和游离细胞最适反应pH。在相同pH条件下,设置不同的反应温度,按照1.2.4酶活测定方法,确定固定化细胞和游离细胞的最适反应温度。
1.2.9 固定化细胞和游离细胞pH和温度稳定性将固定化小球分别在不同温度水浴锅中孵育10 h,取出按照1.2.5测定相对残余活性,测定固定化小球的温度稳定性。将固定化小球和游离细胞在不同pH缓冲液中冰浴5 h,取出用生理盐水洗涤3次,按照1.2.4方法测定固定化细胞pH稳定性。
1.2.10 固定化细胞操作稳定性在最优固定化条件下制作固定化细胞小球,并称取适量于250 mL三角瓶中,加入40 mL 500 g/L D-果糖溶液,反应温度参考1.2.9中的温度稳定性以延长固定化细胞小球的使用寿命,转速设置为200 r/min,反应1.5 h,计算不同批次的固定化细胞的酶活收率和机械强度。每次反应结束,生理盐水洗涤固定化细胞小球3次,重复操作,连续转化10次,分别计算每一批次的残余活性。探究了海藻酸钠-戊二醛(包埋-交联法) 和二氧化钛-海藻酸钠-戊二醛(包埋-吸附-交联法) 固定化细胞的操作稳定性。按照同样方法测定二氧化钛-海藻酸钠-戊二醛法固定化细胞不同使用批次的残余酶活与生成D-阿洛酮糖的转化率。
1.2.11 机械强度测定将一定量细胞置于50 mL三角瓶中,加入10 mL生理盐水,使用磁力搅拌器在50 ℃、200 r/min条件下搅拌8 h,计数完整的固定化细胞小球。
机械强度(%)=完整的固定化细胞小球数/初始固定化细胞小球数×100[14]
2 结果与分析 2.1 多雷亚菌DSDPEase的克隆与表达从NCBI数据库检索到多雷亚菌Dorea sp. CAG317的DPEase基因序列,人工合成DSDPEase基因片段,并以此为模板分别PCR得到相应碱基大小的基因片段(图 1)。按照方法1.2.1构建重组菌株,超声破碎细胞,对胞内蛋白进行SDS-PAGE分析(图 2),DSDPEase粗酶液、SAP1-DSDPEase、SAP2-DSDPEase、SAP3-DSDPEase目的蛋白大小均为33 kDa,蛋白凝胶在29 kDa附近出现较明显的蛋白质特征条带。
2.2 融合双亲短肽对DSDPEase热稳定性的影响为比较SAPs对DSDPEase热稳定性的影响,按照方法1.2.4测定不同时间的残余酶活,结果如图 3,SAP1-DSDPEase残余酶活高于对照组DSDPEase与SAP2-DSDPEase、SAP3-DSDPEase的残余酶活。由双变量t检验统计量分析,在0–48 h之内,SAP1-DSDPEase和SAP3-DSDPEase酶活力衰减速度与对照组DSDPEase相比较缓慢,显著差异性均为显著(P≤0.05),但在0–12 h与36–48 h,SAP1-DSDPEase衰减速度比SAP3-DSDPEase衰减速度缓慢,显著性差异为显著(P≤0.05)。上述现象表明,目的蛋白对不同的SAPs偏好性不同,这与蛋白氨基酸序列和SAPs氨基酸序列有密切关系[15]。
2.3 固定化细胞条件优化 2.3.1 海藻酸钠浓度对固定化细胞的影响海藻酸钠浓度影响固定化细胞的机械强度、比表面积和传质效率等,从而影响固定化细胞的酶活回收率。如图 4所示,海藻酸钠浓度越低,形成的固定化微球体积小、比表面积大,并且内部固定化结构孔径大、传质速率较高,酶活回收率最高,但是固定化小球的机械强度较低。随着海藻酸钠浓度升高,酶活回收率逐渐下降,机械强度增大。根据机械强度和相对酶活回收率,2%的海藻酸钠为宜。
2.3.2 细胞包埋量对固定化细胞的影响细胞包埋量影响固定化细胞的酶活回收率与催化活性,如图 5所示,当细胞包埋量20 g/L时,酶活回收率较高,固定化小球中的单位细胞传质效率较高,但是催化活性相对偏低,细胞量少会影响固定化小球的整体催化活性。细胞量增加导致固定化小球内部空间位阻增大、传质效率降低,与等量的游离细胞相比催化活性明显下降,故随之固定化细胞相对酶活回收率下降。当细胞包埋量60 g/L时,相对活性最大,更有利于固定化细胞在生产中发挥催化作用。
2.3.3 二氧化钛与海藻酸钠比例对固定化细胞的影响二氧化钛与海藻酸钠的比例会影响固定化细胞的机械强度、酶活回收率。如图 6所示,当不添加二氧化钛时,海藻酸钠包埋的固定化细胞空间位阻较小、传质效率较高,从而酶活回收率较高,但是机械强度相比添加二氧化钛的固定化细胞较差。当加入二氧化钛后,固定化细胞内部的空间位阻增大,酶活回收率呈现出下降趋势,随着固定化小球中二氧化钛比例增大,二氧化钛均匀分散在海藻酸钙凝胶孔隙中并吸附大量细胞,酶活回收率逐渐增大,机械强度保持良好,二氧化钛︰海藻酸钠为1︰4时,固定化细胞酶活回收率和机械强度最大。
2.3.4 钙离子浓度对固定化细胞的影响钙离子与海藻酸钠离子交换形成海藻酸钙凝胶是固定化细胞的重要过程,如图 7所示,固定化细胞在1% CaCl2溶液中难以成型,机械强度较差仅有62%,细胞流失,导致酶活回收率较低。CaCl2溶液进入细胞对酶活有抑制作用,当钙离子浓度超过2%时,固定化细胞酶活回收率呈现下降趋势。
2.3.5 戊二醛浓度对固定化细胞的影响单独海藻酸钠包埋法固定化细胞容易泄露,戊二醛可以与海藻酸钠和细胞膜表面的氨基结合形成交联,如图 8所示,戊二醛浓度在0.03%范围内不会对细胞酶活造成损伤,戊二醛浓度增大固定化细胞回收酶活率下降,随着戊二醛浓度的增大机械强度提高并趋于稳定。
2.4 固定化细胞最适反应温度与pH在相同温度下,固定化细胞与游离细胞相比,传质更慢,温度是影响反应速率的关键因素,如图 9A所示,随着温度的升高,固定化细胞与游离细胞的相对活性均增大。固定化细胞和游离细胞的最适反应温度均为80 ℃,超过80 ℃,相对活性急剧下降至30.5%。
反应溶液的pH影响固定化细胞的催化活性,如图 9B所示,在pH为3.0–5.0时,固定化细胞的相对活性较低,当pH升高到6.5时,固定化细胞相对活性最高,反应过程中观察到固定化细胞小球松散分离,这是在pH 6.5处相对活性提高的主要原因,关于稳定性分析见2.5。在pH为7.0–8.5时,固定化细胞的相对活性都保持在90%左右,由此可见,在中性偏碱的条件下反应溶液的pH对固定化细胞的催化活性影响不大。
2.5 固定化细胞温度和pH的稳定性称取适量固定化细胞,分别在30–70 ℃水浴锅中过夜孵育10 h,称取0.5 g测定残余酶活,其余做机械强度测定。如图 10A所示,固定化细胞在30 ℃、40 ℃保存10 h残余酶活仍保持100%,机械强度没有降低;在50 ℃,固定化细胞残余酶活力为99.6%,机械强度为98%;固定化细胞在60 ℃的残余酶活为68.1%,机械强度下降至86%,然而70 ℃下孵育10 h已丧失酶活力,考虑到已失去研究意义,不再讨论该温度下的机械强度。
将适量细胞置于pH 6.0–8.5的缓冲液中保存5 h,用生理盐水洗涤3次,测定固定化细胞残余酶活与机械强度。如图 10B所示,固定化细胞在pH 6.0的缓冲液中出现溶破现象,固定化材料被洗脱掉,细胞暴露相对活性较大,但机械强度仅有85%,在pH 6.5的缓冲液中相对活性增大,机械强度依然是85%。在pH 7.0–8.5的缓冲液中固定化细胞不被破坏,相对活性受传质影响低于最高残余酶活,但机械强度均为100%,故认为固定化细胞在pH 8.5的环境下稳定性最好。
2.6 固定化细胞操作稳定性固定化细胞在优化后的反应条件下,重复使用,如图 11所示,随着使用批次的增多,海藻酸钠包埋的固定化细胞机械强度不耐受加热及搅拌剪切力的作用急剧下降,残余酶活回收率在第3批次下降至60%,在第5批次固定化细胞酶活回收率仅有30%,第6批次已无完整颗粒存在。二氧化钛-海藻酸钠复合包埋吸附的固定化细胞小球表现出极稳定的机械强度,从第8批次开始小球开始被溶破机械强度下降至94%,残余酶活回收率保留62%,连续操作10次,固定化小球机械强度依然维持在80%,残余酶活回收率保留58%。
2.7 固定化细胞的应用将固定化细胞加入到500 g/L D-果糖溶液中,50 ℃、200 r/min,反应时间1.5 h (由预实验确定),连续转化10次。固定化细胞转化率呈现出先上升后下降的趋势,这是由于固定化细胞小球在溶液中浸泡溶胀,细胞与底物接触面积增大,转化效率逐渐增大,直到细胞流失而导致转化效率下降。如图 12所示,D-果糖生成D-阿洛酮糖的转化率为28.8%–30.7%。这一结果与已报道的相同基因来源的游离酶DPEase在50 ℃条件下31.8%的转化率是接近的[16]。在连续转化过程中,固定化细胞残余酶活力的变化趋势与2.6中酶活回收率变化相符,第10批次转化相对活性为70.5%,验证了二氧化钛-海藻酸钠-戊二醛固定化细胞重复使用的稳定性。
3 讨论D-阿洛酮糖3-差向异构酶是D-果糖转化成D-阿洛酮糖的关键酶,由于该酶热稳定性和化学稳定性差,不易与产物分离,限制了其在工业化生产中的应用。固定化酶与游离酶相比不仅保持催化反应的特异性、高效性,还能起到保护酶的作用,延长酶的使用周期,缩短生产分离的时间。李晓波[17]利用壳聚糖包埋法固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶,提高了酶的pH耐受性,但其热稳定性没有得到改善,固定化酶在60 ℃保持30 min酶活几乎丧失。通常在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中异源过表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶,均需要破细胞才能得到粗酶液。在食品领域中,何伟伟[18]将重组枯草芽孢杆菌冷冻干燥,成功制作冻干酶制剂,应用到D-阿洛酮糖的生产中。李秋喜等[12]通过海藻酸钠戊二醛包埋交联法固定化DPEase重组细胞,酶活回收率76%,重复操作8次后酶活回收率61%。孙帆等[11]利用硅藻土海藻酸钠吸附包埋重组枯草芽孢杆菌,细胞包埋量50 g/L,酶活回收率64%,重复7次操作,残余酶活保留81%。海藻酸钠廉价易得,物理化学性质稳定,且无毒无异味,通常是固定化细胞的首选材料。李力等[19]制备L-谷氨酸氧化酶(LGOX) 重组大肠杆菌的固定化细胞,海藻酸钠浓度2.5%,CaCl2溶液浓度13 g/L,得到的固定化工程菌机械强度最好。
二氧化钛是一种粘附力强不易起化学变化的两性氧化物,美国食品药品监督管理局规定二氧化钛可以作为所有的食品白色素,可被添加在凉果类、果冻、果酱等食品中[20]。董依慧等[21]发现,介孔二氧化钛可吸附蛋白质,为固定化酶提供了新的载体。孟俊丽等为了改善海藻酸钠固定化酶微球的扩散性与酶活稳定性,通过金属阳离子交联二氧化钛-海藻酸杂化凝固定化木瓜蛋白酶,发现固定化酶中加入二氧化钛能有效减少酶的泄露[22]。
本实验首先融合SAPs双亲短肽延长DSDPEase的半衰期,为游离重组细胞在收集存储过程中提供数据参考,然后制备二氧化钛-海藻酸钠复合载体固定化重组细胞并使用戊二醛交联,由于二氧化钛均匀分布在海藻酸钙结冷胶内部空间结构中,对细胞膜表面蛋白的吸附作用可有效阻止细胞泄露,使固定化细胞各组分之间交联紧密疏松有秩,提高了固定化细胞与底物溶液的接触面积,从而有效提高固定化细胞的酶活回收和机械强度。通过单因素实验,以酶活回收率、机械强度为参考,对海藻酸钠、二氧化钛、钙离子、戊二醛浓度做了优化得出固定化细胞最优工艺参数:2%的海藻酸钠、1︰4的二氧化钛︰海藻酸钠添加比例、2%的CaCl2、0.03%的戊二醛。固定化细胞未改变生物转化反应条件,但提高了热稳定性,并且固定化细胞的pH稳定性与游离细胞相近,添加二氧化钛后可显著增加固定化细胞的重复使用次数,重复操作10次,酶活回收率依然保持在58%,机械强度为80%。重复使用过程中,固定化细胞转化D-果糖生成D-阿洛酮糖的效率较高,连续使用10次转化率依然保持28.8%。总之,本研究构建的重组菌株为改善DPEase热稳定性提供了参考,确定的固定化工艺参数为工业固定化细胞提供了重要的理论依据。
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