2021, Vol. 37中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 李尧慧, 张荣珍, 徐岩
- Li Yaohui, Zhang Rongzhen, Xu Yan
- 亲和标签调节的(S)-羰基还原酶2催化2-羟基苯乙酮的酶学性质
- Characterization of the affinity-tags-regulated (S)-carbonyl reductase 2 towards 2-hydroxyacetophenone reduction
- 生物工程学报, 2021, 37(12): 4277-4292
- Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(12): 4277-4292
- 10.13345/j.cjb.210088
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文章历史
- Received: January 28, 2021
- Accepted: May 6, 2021
- Published: June 29, 2021
引用本文
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羰基还原酶(EC 1.1.1.184) 来源广泛，能利用辅酶NAD(P)H还原潜手性酮，其中，多数潜手性酮及其产物可以作为合成药物和农药中间体的原料[1]。目前，国外通过异源表达已经将部分羰基还原酶，包括来自IEP GmbH的酮还原酶和Merck公司的重组酮还原酶等，成功应用于市场生产(S)-2-丁醇[2]和趋化性因子受体抑制剂[3]等。虽然国内利用生物催化法合成手性药物起步较晚，但近几年郑裕国教授团队和许建和教授团队等在合成他汀中间体方面的研究有较大进展[4-5]。因此，研究羰基还原酶的异源表达及其生物催化具有较大的医药和工业应用价值。
在异源表达目的蛋白时，为了提高目的蛋白的纯化效率或可溶性表达量，通常采用分子生物学的方法，在编码基因中添加不同的亲和标签。目前常用的亲和标签有组氨酸(His) 标签、链球菌抗生物素蛋白(Strep) 标签、麦芽糖结合蛋白(Matlose binding protein，MBP) 标签和谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase，GST) 标签等[6-8]。由于在大肠杆菌中异源表达的常用载体，如pET系列表达载体，带有组氨酸(His) 标签基因序列，因此，大部分在大肠杆菌中异源表达的重组蛋白都以组氨酸标签来纯化目的蛋白。然而，不同种类的亲和标签具有不同的纯化效率[9]，并且有可能影响蛋白的催化功能[10-11]。Majorek等[10]发现His标签可以通过影响Gcn5 (The general control non-repressed protein 5) 相关的N-乙酰基转移酶的构象，进而影响它的生物催化功能。Bräuer等[12]认为亲和标签可能会和蛋白发生相互作用，从而影响蛋白的功能。因此，研究不同种类的亲和标签对同一种蛋白的表达、催化功能及其酶学性质，具有重要的意义。
目前已经报道的大肠杆菌异源表达的重组型羰基还原酶大多以pET系列载体进行构建[13-14]。因此，针对不同的亲和标签可能对羰基还原酶功能存在的影响，目前鲜有报道。笔者实验室前期挖掘了近平滑假丝酵母Candida parapsilosis来源的(S)-羰基还原酶2 ((S)-carbonyl reductase 2，SCR2) 的基因信息，并发现该酶具有较广泛的潜手性酮类底物谱[11]。SCR2属于短链脱氢酶家族成员，具有典型的Rossman折叠域及保守的催化三联体[15-16]。由于该酶系的潜手性酮类底物谱广泛，因此具有较大的研究价值[17]。
本研究以近平滑假丝酵母SCR2为研究对象，通过在N-末端添加不同种类的亲和标签，包括His标签、Strep标签以及MBP标签，构建具有不同亲和标签的重组蛋白his6-SCR2、strep-SCR2和MBP-SCR2，研究并比较了它们的催化功能和酶学性质，并从二级结构和三级结构上分析了这些性质差异的原因。该研究旨在为羰基还原酶的亲和标签种类选择提供参考，并通过标签的优化改善SCR2酶的催化性能。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 由本实验室保存；近平滑假丝酵母Candida parapsilosis基因scr2 (GenBank登录号：FJ939563) 来源于本实验室保存的pCP-SCR2质粒[18]；质粒pET21b购自Novagen公司；带有MBP亲和标签的质粒pET-MBP和TEV蛋白酶表达质粒均由美国罗格斯大学Montelione教授实验室馈赠。研究涉及的质粒和重组菌见表 1。
| Strains and plasmids | Characteristics | Source |
| Strains | ||
| E. coli JM109/pCP-SCR2 | E. coli JM109 harboring pCP-SCR2 | This lab |
| E. coli JM109/pET21-his6-SCR2 | E. coli JM109 harboring pET21-his6-SCR2 | This work |
| E. coli JM109/pET21-strep-SCR2 | E. coli JM109 harboring pET21-strep-SCR2 | This work |
| E. coli JM109/pET-MBP-SCR2 | E. coli JM109 harboring pET-MBP-SCR2 | This work |
| E. coli BL21/pET21-his6-SCR2 | E. coli BL21(DE3) harboring pET21-his6-SCR2 | This work |
| E. coli BL21/pET21-strep-SCR2 | E. coli BL21(DE3) harboring pET21-strep-SCR2 | This work |
| E. coli BL21/pET-MBP-SCR2 | E. coli BL21(DE3) harboring pET-MBP-SCR2 | This work |
| Plasmids | ||
| pET21b | 5.4 kb, Ampr | Novagen |
| pET-MBP | The expression vector containing gene his8-MBP, 6.8 kb, Ampr | Rutgers university |
| pET21-his6-SCR2 | The expression vector containing gene his6-SCR2, and a TEV cleavage site between His-tag and SCR2, 6.2 kb, Ampr | This work |
| pET21-strep-SCR2 | The expression vector containing gene strep-SCR2, and a TEV cleavage site between Strep-tag and SCR2, 6.2 kb, Ampr | This work |
| pET-MBP-SCR2 | The expression vector containing gene MBP-SCR2, and a TEV cleavage site between MBP-tag and SCR2, 7.6 kb, Ampr | This work |
| TEV | 6.5 kb, Kanar | Rutgers university |
| Primers | Sequence (5′–3′) | Size (bp) |
| MBP-F | cccgctcgagctatggacaggtgaatccaccatc | 34 |
| MBP-R | actctcgagctatggacaagtgtaaccaccat | 32 |
| His-F | atcggatccgcatcatcatcatcatcatgaaaatttatatttccagagtatgggcgaaatcgaatctta | 69 |
| His-R | tgactctcgagctatggacacgtgtatccacc | 32 |
| Strep-F | atcggatccgtggtctcatcctcaatttgaaaaggaaaatttatatttccagagtatgggcgaaatcgaatctta | 75 |
| Strep-R | tgactctcgagctatggacacgtgtatccacc | 32 |
| Note: underlined bases represent restriction enzyme site. | ||
限制性内切酶、DNA标准分子及蛋白标准分子等购自宝生物工程(大连) 有限公司。重组质粒构建所需的引物合成由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成。细菌质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒以及柱纯化试剂盒等均购自Omega Bio-tek公司；酵母膏和蛋白胨购自Oxford公司。其余常用试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。大肠杆菌采用LB培养基：0.5%酵母膏，1%蛋白胨，1%氯化钠，必要时添加100 μg/mL氨苄青霉素钠或者50 μg/mL卡那霉素(固体培养基再添加1.5%的琼脂粉)。
1.2 实验方法 1.2.1 表达载体和菌株的构建以实验室保存的pCP-SCR2为模板，利用引物His-F1和His-R1 PCR扩增带组氨酸标签的scr2基因片段his6-SCR2。接着，将扩增片段his6-SCR2和载体pET21b质粒[17]分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，分别胶回收后，利用T4 DNA连接酶于16 ℃连接过夜，涂布100 μg/mL氨苄青霉素钠平板，于37 ℃过夜培养。挑取单克隆接种于含有100 μg/mL氨卞青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜。提取质粒进行PCR和酶切验证，阳性克隆E. coli JM109/pET-his6-SCR2送生工生物工程(上海) 股份有限公司测序。以Strep-F1和Strep-R1为引物，用同样的方法构建重组菌E. coli JM109/pET-strep-SCR2。以MBP-F1和MBP-R1为引物，用同样的方法构建重组菌E. coli JM109/pET-MBP-SCR2。所有质粒和引物见表 1。
1.2.2 蛋白的表达与纯化将测序正确的质粒pET-his6-SCR2、pET-strep- SCR2、pET-MBP-SCR2、pET-MBP和TEV转化至感受态细胞E. coli BL21(DE3) 后，涂布于含相应抗性的固体LB平板，于37 ℃倒置培养过夜。挑取单菌落至5 mL的LB液体培养基中培养7−8 h，按1%的接种量转接于500 mL的LB培养基中，于37 ℃、200 r/min摇床培养至OD600值为0.6−0.8，加入终浓度为0.1 mmol/L的诱导剂IPTG，接着在25 ℃、200 r/min培养12 h[19]。
含组氨酸标签的重组蛋白SCR2、蛋白MBP和蛋白酶TEV的纯化参照文献[20]。含有Strep标签重组蛋白的纯化过程包括两个步骤：Strep-Tactin亲和层析和Superdex 200 Increase 10/300 GE凝胶层析[20]。该过程中所用的缓冲液包括缓冲液A (40 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、pH 8.0)、缓冲液B (40 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L d-脱硫生物素，pH 8.0)、缓冲液C (50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、pH 8.0)。将离心收集的菌体，用缓冲液A重悬，超声破碎后，于4 ℃、12 000 r/min离心40 min后收集上清。随后分步骤利用Strep-Tactin亲和层析和Superdex 200 Increase 10/300 GE凝胶层析获得纯化的蛋白。
将纯化后的蛋白his6-SCR2，用TEV蛋白酶酶切[21]，可以获得无融合标签的SCR2蛋白。具体步骤如下所述：将纯化后的his6-SCR2和TEV蛋白酶以摩尔比为1︰10的比例，在添加1 mmol/L的还原剂TCEP的条件下，于4 ℃孵育过夜(约12 h)。第2天，将经孵育的混合液流经Ni-NTA除去组氨酸标签和TEV蛋白酶。最后，将洗脱液浓缩并流经经缓冲液C平衡的Superdex 200 Increase 10/300 GE凝胶柱，收集凝胶层析洗脱液用于后续研究。重组蛋白MBP-SCR2和strep-SCR2在标签和SCR2基因之间添加了TEV蛋白酶酶切位点，因此也可以应用上述方法切除相应的标签。
1.2.3 酶活力和酶活动力学测定酶活力测定方法、酶活力的定义以及酶活力的计算等参考文献[17]，略作改动。酶活力测定体系为250 μL：0.1 mol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.0)，5 mmol/L底物2-羟基苯乙酮(2-hydroxyacetophenone，2-HAP)，0.5 mmol/L NADPH。反应前加入适量酶液吹吸混匀后，于30 ℃、340 nm处扫描吸光度的变化。由于羰基还原酶的pH依赖性较强，为了避免由于底物浓度不足而造成的酶活力测定差异，因此在pH稳定性测定时，提高底物浓度为10 mmol/L，其他条件保持不变。
酶活的计算公式：
酶活(U)=EW×V/(6 220×0.639 9)
其中，EW：1 min内340 nm处吸光度的变化；V：反应液的体积(L)；6 220：NADPH在340 nm下的摩尔消光系数(L/(mol·cm))；0.639 9：光程距离(cm)。本研究中U的单位为μmol/min，而比酶活的单位为U/μmol。
以2-羟基苯乙酮为底物的酶活动力学的测定方法如下：在NADPH为0.5 mmol/L的条件下，测定蛋白在不同底物浓度下(0.5−30 mmol/L) 的酶活力。根据在不同浓度的底物条件下测定的初始酶活力，利用GraphPad Prism 8拟合相关数据。所用的公式为米氏方程(1)。每个数据均至少测定3次后取平均值。
| $ Y=V_{\max} ×X/(K_{\rm m}+X) $ | (1) |
蛋白含量用Nanodrop测定，酶的消光系数通过ExPASy网(https://web.expasy.org/protparam/)求得。
1.2.4 酶的最适温度和最适pH的测定酶的最适温度测定如下：在0.1 mol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.0) 条件下，测定纯酶在不同温度(30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃) 条件下的酶活力。每个数据均至少测定3次后取平均值。
酶活力的最适pH测定如下：在温度为30 ℃的条件下，测定纯酶在不同pH (4.0、5.0、6.0、7.0和8.0) 条件下的酶活力。每个数据均至少测定3次后取平均值。
1.2.5 酶的温度和pH稳定性的测定酶活力的温度稳定性测定如下：将纯酶在不同的温度(0–60 ℃) 下温育1 h后，在冰上放置10 min，随后检测它们的酶活力，并定义在0 ℃温育1 h后的酶活力为100%，计算其他温度下温育1 h后的相对酶活力。每个数据均至少测定3次后取平均值。
酶活力的半衰期测定方法如下：在50 ℃孵育温度下，测定不同保温时间下酶的残余活力，定义保温前测定的酶活力为100%。当酶残余活力降低为50%时，其对应的时间为酶在50 ℃下的半衰期。
酶活力的pH稳定性测定如下：将纯酶在不同的pH (4.0–8.0) 下，于30 ℃温育0 h和13 h后，检测它们在30 ℃条件下的酶活力，计算温育13 h后相对于0 h的酶活力。每个数据均至少测定3次后取平均值。
1.2.6 带有不同亲和标签的SCR2的同源建模和序列比对利用Robetta comparative modeling[22]预测SCR2、his6-SCR2、strep-SCR2以及MBP-SCR2的三维结构，并分析N端结构差异对SCR2的影响。利用PyMOL计算经历5轮异常值剔除后的均方根偏差(Root-mean-square deviation，RMSD)。利用ESPript 3.0在线网站进行序列比对[23]。
1.2.7 带有不同亲和标签的重组型SCR2的圆二色谱和解折叠温度分析圆二色谱测定蛋白二级结构：将过凝胶层析后的蛋白样品浓度调节至3 µmol/L，取300 µL于190–260 nm进行全波长扫描。圆二色谱数据分析利用SELCON3算法[24]。蛋白解折叠温度的测定：取220 nm作为热变吸光值的测定，热变温度范围为20−80 ℃，升梯温度为3 ℃/min。
2 结果与分析 2.1 带有不同亲和标签的重组蛋白SCR2的构建及表达以载体pCP-SCR2为模板，构建SCR2带有不同亲和标签的重组蛋白表达基因his6-SCR2、strep-SCR2和MBP-SCR2 (图 1A)。经PCR和双酶切验证后，将筛选得到的阳性克隆E. coli JM09/pET-his6-SCR2、E. coli JM09/pET-strep-SCR2和E. coli JM09/pET-MBP-SCR2进行测序验证，并将测序正确的菌株保存用于后续研究。
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| 图 1 带有不同亲和标签的重组蛋白SCR2的构建、表达和纯化 Fig. 1 Construction, expression and purification of recombinant SCR2 enzymes with different affinity tags in E. coli. Construction scheme (A), SDS-PAGE analysis of the cell-free extracts (B) and purified recombinant SCR2 enzymes (C) were shown. |
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提取质粒转化E. coli BL21(DE3) 感受态细胞，并将3种重组菌株E. coli BL21/pET-his6- SCR2、E. coli BL21/pET-strep-SCR2和E. coli BL21/pET-MBP-SCR2经诱导剂IPTG诱导表达，收集细胞破碎上清液进行SDS-PAGE分析。结果发现3种重组蛋白在大肠杆菌中都过量表达，并且在细胞上清液中有大量的可溶性蛋白(图 1B)。
2.2 重组蛋白的纯化及酶活力的比较为了研究亲和标签种类对酶学性质的影响，纯化SCR2三种重组蛋白及其无融合标签蛋白，结果如图 1C所示。三种重组蛋白以及无融合标签SCR2催化5 mmol/L 2-羟基苯乙酮的酶活有差异(表 2)。在1 min内，MBP-SCR2的比酶活力最高，比his6-SCR2和strep-SCR2的比酶活力高约19.1%和8.7%，比无融合标签SCR2的比酶活力高约4.9%。由于不同亲和标签对酶的比酶活力有一定的影响，因此对于亲和标签的选择具有重要意义。
| Enzymes | Expression systems | Specific enzyme activities (U/μmol) | pH (relative enzyme activities > 75%) | Temperature (relative enzyme activities > 90%) | References |
| his6-SCR2 | E. coli BL21(DE3) | 2 318.22±203.11 | 4.0–6.0 | 30–35 ℃ | This work |
| strep-SCR2 | E. coli BL21(DE3) | 2 539.98±228.31 | 4.0–7.0 | 30–40 ℃ | This work |
| MBP-SCR2 | E. coli BL21(DE3) | 2 760.75±89.14 | 5.0–6.0 | 30–45 ℃ | This work |
| SCR2 | – | 2 632.35±106.44 | 4.0–6.0 | 30–35 ℃ | This work |
| his6-YaCRⅡ | E. coli BL21(DE3) | 290.45 | 5.0–6.0 | 35–55 ℃ | [25] |
| CMCR | Candida magnolia | 106.50 | – | – | [26, 51] |
| SSCR | Saccharomyces cerevisiae | 10.50 | 5.5–6.5 | – | [26-27] |
| Ymr226c | Saccharomyces cerevisiae | 26.84 | – | – | [26] |
| Notes: reaction velocity was determined at pH 6.0, 30 ℃, 5 mmol/L 2-hydroxyacetophenone and 0.5 mmol/L NADPH. | |||||
而在蛋白结晶等情况下，除了需要维持酶的天然活性结构，还要考虑酶结晶的可行性。在蛋白结晶过程中，由于亲和标签可能影响蛋白柔性进而影响蛋白结晶，因此通常考虑将其切除[28-29]。重组蛋白的标签大小直接影响酶切后蛋白的回收率。本研究通过计算获得重组蛋白MBP-SCR2的回收率只有约20%，而his6-SCR2和strep-SCR2的回收率接近80%。因此，在这种情况下，偏向于选择小分子亲和标签进行研究。
2.3 重组蛋白SCR2的最适反应温度和最适pH的分析温度不仅影响酶分子和底物分子在溶液中的运动速率，而且影响酶分子中氨基酸侧链的解离状态，从而影响酶分子催化反应的速率[30]，因此有必要确定带有不同类型亲和标签的重组蛋白SCR2酶分子催化反应的最适温度，为重组蛋白的后续应用做铺垫。如图 2A所示，带有不同亲和标签的重组蛋白SCR2以及无融合标签SCR2的最适反应温度均为35 ℃，因此，His标签、Strep标签以及MBP标签均不影响SCR2酶分子的最适反应温度。尽管如此，带有不同亲和标签的重组蛋白SCR2能进行高效催化反应的温度范围不同(表 2)。其中，MBP-SCR2在30–45 ℃均具有较高的比酶活力，而带有小分子类亲和标签的重组蛋白SCR2和无融合标签SCR2，在温度高于35 ℃时，酶催化反应的速率显著下降。在40 ℃的反应条件下，MBP-SCR2的相对酶活力比无融合标签SCR2高约9.8%。这可能与MBP融合标签具有稳定SCR2结构的潜力有关[31]。
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| 图 2 带有不同亲和标签的重组蛋白SCR2的最适温度(A) 和最适pH值(B) Fig. 2 Determination of optimal reaction temperature (A) and optimal pH (B) for recombinant SCR2 enzymes with different affinity tags. The enzyme activities of SCR2 enzymes were measured at pH 6.0 during determination of optimal reaction temperature, while the enzyme activities of SCR2 enzymes were measured at 30 ℃ during determination of optimal pH. |
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缓冲液pH影响酶分子表面的带电状态，包括蛋白活性口袋的氨基酸的带电状态，进而影响酶分子催化反应的速率[32]，因此有必要研究带有不同类型亲和标签的重组蛋白SCR2催化反应的最适pH，为其后续应用作参考。如图 2B所示，his6-SCR2、strep-SCR2、MBP-SCR2和SCR2催化2-羟基苯乙酮的最适pH均为6.0。如表 2所述，进一步比较重组蛋白SCR2的相对酶活力随着pH的改变发现，带有小分子类亲和标签的重组蛋白SCR2和无融合标签SCR2在偏酸性条件下(pH 4.0–6.0) 的相对酶活力较高，在pH 5.0，其相对酶活力维持在95.0%以上。而带有大分子标签的重组蛋白MBP-SCR2，在pH 5.0，其相对酶活力约为78.4%。因此，MBP-SCR2相对具有较强的pH依赖性，偏离最适pH 6.0，其酶活力显著下降。
2.4 重组蛋白SCR2的温度和pH稳定性不同于化学催化法，在酶催化反应过程中，由于酶本身不会被消耗，因此，若酶的稳定性较高，可以持续进行催化反应。温度和pH对酶的稳定性影响较大，因此考察SCR2酶分子在不同的反应温度和pH下的稳定性，从而为后续选取合适的温度和pH进行催化反应，具有非常重要的意义[33]。如图 3A所示，在不同温度下保温1 h后，带有不同亲和标签的重组蛋白SCR2和无融合标签SCR2的酶活力相对于各自保温前的酶活力的比值几乎一致。当温度小于或等于30 ℃时，重组蛋白SCR2和无融合标签SCR2在该温度下保温1 h，酶活力损失均小于20.0%。尽管带有不同亲和标签的重组蛋白SCR2和无融合标签SCR2在不同温度下保温1 h后的相对酶活力的变化趋势一致，但它们在50 ℃保温不同时间后的相对酶活力有一定的差异。如图 3B所示，可以观测到MBP-SCR2在50 ℃的半衰期约为11.9 min，比strep-SCR2 (约8.0 min)、his6-SCR2 (约9.0 min)和无融合标签SCR2 (约9.4 min) 长26.6%–48.8%。因此，MBP-SCR2的热稳定性相对较高，在工业应用中有一定的优势。
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| 图 3 带不同亲和标签的重组蛋白SCR2的温度和pH稳定性 Fig. 3 Determination of temperature and pH tolerance of SCR2 with different affinity tags using tag-free SCR2 as their control. (A) The relative activities of SCR2 enzymes measured at 30 ℃ after incubating at different temperatures for 1 h. Their remaining activities were measured at pH 6.0, 30 ℃ and 5 mmol/L 2-hydroxyacetophenone. (B) The relative activities of SCR2 enzymes measured at 50 ℃ after incubating for different time. Their remaining activities were measured at pH 6.0, 50 ℃ and 5 mmol/L 2-hydroxyacetophenone. (C) The relative activities of SCR2 enzymes measured at 30 ℃ after incubating at different pHs for 13 h. (D) Initial velocities of SCR2 enzymes after incubating at different pHs for 13 h. Their remaining activities were measured at pH 6.0, 30 ℃ and 10 mmol/L 2-hydroxyacetophenone. |
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此外，重组蛋白SCR2在不同的pH缓冲液中，其稳定性也具有差异。如图 3C所示，重组蛋白his6-SCR2、MBP-SCR2和无融合标签SCR2在pH 5.0保温13 h后，相对酶活力为100%，而strep-SCR2在pH 5.0保温13 h后，相对酶活力仅剩79.3%。因此可知，重组蛋白his6-SCR2、MBP-SCR2以及无融合标签SCR2在pH 5.0的稳定性显著高于strep-SCR2。因此推出，His标签和MBP标签并不影响SCR2的pH稳定性，而Strep标签显著降低了SCR2在pH 5.0的稳定性。然而在其他pH条件下，各个重组蛋白的pH稳定性几乎保持一致。尽管MBP-SCR2的pH稳定性与无融合标签SCR2和带有小分子类亲和标签的重组蛋白SCR2保持一致，但其在pH 6.0处的剩余酶活力相对较高，是无融合标签SCR2的1.25倍(图 3D)。该优势可能和MBP-SCR2具有较强的pH 6.0依赖性有关(图 2B)。
2.5 重组蛋白SCR2的酶活动力学分析揭示其在低温下的存储稳定性酶活动力学分析反映了不同亲和标签对重组蛋白SCR2的催化常数以及米氏常数的影响。根据酶活动力学的测定可知(表 3)，3种重组蛋白his6-SCR2、strep-SCR2和MBP-SCR2的催化常数和无融合标签SCR2的催化常数保持一致，因此可知His标签、Strep标签以及MBP标签不影响SCR2酶分子的催化常数。然而，不同的重组蛋白SCR2的米氏常数有所差异，因此它们的kcat/Km也有差异，其中MBP-SCR2的kcat/Km约为无融合标签SCR2的1.5倍。
| Enzymes | Fresh | Stored in −80 ℃ for 60 d | References | |||||
| kcat (s–1) | Km (mmol/L) | kcat/Km (L/(mmol·s) | kcat (s–1) | Km (mmol/L) | kcat/Km (L/(mmol·s) | |||
| his6-SCR2 | 103.20±4.67 | 10.20±1.24 | 10.12 | 74.90±3.07 | 5.85±0.61 | 12.80 | This work | |
| strep-SCR2 | 101.30±2.62 | 5.13±0.26 | 19.75 | 58.47±0.91 | 3.26±0.16 | 17.93 | This work | |
| MBP-SCR2 | 100.20±7.22 | 5.80±1.09 | 17.28 | 84.54±3.77 | 3.06±0.42 | 27.62 | This work | |
| SCR2 | 101.30±4.26 | 8.75±0.86 | 11.58 | 67.67±1.76 | 3.52±0.27 | 19.22 | This work | |
| Polyol dehydrogenase | 0.50 | 0.80 | 0.63 | – | – | – | [34] | |
| 2, 3-butanediol dehydrogenase | 1.30 | 1.0 | 1.30 | – | – | – | [34] | |
| Notes: reaction velocity was determined at pH 6.0, 30 ℃ and 0.5 mmol/L NADPH. | ||||||||
对于商业化工业用酶，其存储稳定性和反应稳定性一样，也非常重要[35]。因此，我们研究了重组蛋白SCR2的存储稳定性(表 3)。在−80˚C存储60 d后，his6-SCR2、strep-SCR2、MBP-SCR2和SCR2的酶活动力学参数均有所下降。其中his6-SCR2、strep-SCR2和SCR2的kcat比初始值降低了27.4%–42.2%，而MBP-SCR2仅下降了15.6%。在−80 ℃存储60 d后MBP-SCR2的酶活动力学参数kcat比无融合标签SCR2的kcat高24.9%。此外，酶活动力学数据表明新鲜酶和冷冻储存60 d后的酶的Km有明显的差异，且重组蛋白SCR2对底物的亲和力都显著增强。由于重组蛋白SCR2是液氮速冻后置于−80 ℃存储，因此，理论上最有可能和酶分子发生相互作用而改变酶性能的是酶的结合水分子[36]。根据报道，水分子可以通过和酶分子的底物结合口袋中的氨基酸或者底物形成氢键，进而影响酶分子的催化过程[37]。液态水分子和固态水分子的物理化学特性有较大差异[38]。因此，在−80 ℃存储过程中固态结合水分子和底物结合口袋的长期相互作用可能改变了底物结合口袋中的物理化学环境，间接影响了后期底物进入酶分子活性口袋后的结合能力。根据表 3数据可知，MBP-SCR2的存储稳定性优于无融合标签SCR2，具有较好的商业化价值。
2.6 结构生物信息学分析重组蛋白SCR2的酶活力稳定性差异的原因MBP标签融合蛋白MBP-SCR2相比于his6-SCR2、strep-SCR2和SCR2表现出较高的酶活力稳定性。为了分析MBP-SCR2具有较高酶活力稳定性的原因，利用Robetta同源建模his6-SCR2、strep-SCR2、MBP-SCR2以及SCR2，并进行结构分析比较。Robetta同源建模获得SCR2、his6-SCR2和strep-SCR2结构模型(图 4A)，且各模型比对的RMSD的值均小于0.3 (图 4B)。各个重组蛋白SCR2的结构模型均保留典型的Rossman折叠域，为酶催化提供必要的活性口袋结构(图 4A)。由于MBP-SCR2由MBP蛋白和SCR2蛋白两个结构域组成，因此较难通过同源建模获得合理的结构模型。因此，图 4C展示了MBP-SCR2的概念图，表明该融合蛋白由MBP蛋白和SCR2蛋白两个结构域组成，两个结构域之间由连接子连接。尽管通过连接子连接在一起的融合蛋白的结构可能会有变化，但MBP标签对融合蛋白中另一个蛋白结构的影响通常较小[39]。比较SCR2和MBP-SCR2的结构(图 4A和图 4C) 可知，两者N端柔性环区域的灵活性有显著差异。SCR2 N端的31个氨基酸(M1-F31) 游离在Rossman折叠域之外，呈无规则卷曲，灵活性强，而MBP-SCR2的N端除了一段无规则卷曲外，在无规则卷曲的另一端连接了结构稳定的α螺旋，因此在一定程度上对于SCR2蛋白的N端具有稳定作用。
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| 图 4 带不同亲和标签的重组蛋白SCR2的三级结构的比较 Fig. 4 Tertiary structure comparison of SCR2 with different affinity tags using crystal structure of SCR (PDB ID 3CTM) as their searching model performed on Robetta server[22]. (A) Homology modeling of SCR2 with different affinity tags. (B) All-atom root-mean-square deviations for superposed structures from homology modeling of SCR2 with different affinity tags calculated by PyMOL. (C) Concept map of fusion protein of MBP-SCR2 presented with tertiary structures of MBP and SCR2 connected by a linker. |
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根据2.6中结构信息学的分析，推测MBP标签可能具有稳定SCR2蛋白结构的作用，因此利用圆二色谱分析蛋白的二级结构及其解折叠温度。图 5利用Espript 3.0[23]比对了带有不同亲和标签的SCR2蛋白和MBP蛋白序列，其中MBP的二级结构信息来自其晶体结构(PDB ID：5BJZ)[40]，故可以作为圆二色谱分析的参考。根据图 5计算获得MBP结构中α螺旋的比例约为0.42，β折叠的比例约为0.15，该数值和圆二色谱测定的比值(图 6A) 几乎保持一致。此外，如图 6B所示，His和Strep标签的SCR2的重组蛋白的二级结构与无融合标签SCR2的二级结构几乎一致，且带有小分子亲和标签的蛋白his6-SCR2和strep-SCR2与无融合标签SCR2的酶活数据相一致(表 2)。综上所述，推测圆二色谱测定的数值可以从一定程度上反映SCR2的二级结构的状态和重组蛋白SCR2酶活力之间的关系。而带有MBP标签的SCR2重组蛋白的二级结构分析需要同时结合无融合标签SCR2蛋白和MBP蛋白。如图 6B所示，计算在193 nm、208 nm以及222 nm[41]处的α螺旋，以及195 nm和218 nm处的β折叠的平均信号强度可知，重组蛋白MBP-SCR2在208 nm处α螺旋信号强度比MBP蛋白和无融合标签SCR2的α螺旋信号强度之和低6.56%，而其他波长下的信号强度几乎一致(表 4)。研究人员报道，每种蛋白都有自己的进化规律，二级结构中α螺旋和β折叠的比例与其结构稳定性有特殊的关系[42]。因此，α螺旋比例的微小变化可能和MBP-SCR2表现出的酶活力和稳定性差异相关。
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| 图 5 重组蛋白SCR2的序列比对 Fig. 5 Sequence alignment of SCR2 enzymes with different affinity tags at its N-terminus with maltose binding protein (MBP). |
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| 图 6 重组蛋白SCR2解折叠温度和二级结构的分析 Fig. 6 Analyses of melting temperatures and secondary structures of recombinant SCR2 enzymes and maltose binding protein (MBP). (A) Composition of secondary structures of SCR enzymes and MBP analyzed by SELCON3[24] with data from circular dichroism and their relative Tm values. (B) Analyses of protein circular dichroism for SCR2 enzymes and MBP. (C) Melting temperature analyses of SCR2 enzymes and MBP. |
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| Wavelength (nm) | Circular dichroism (mdeg) | ||||
| SCR2 | MBP | SCR2+MBP | MBP-SCR2 | (MBP-SCR2)-(SCR2+MBP) | |
| α-helix | |||||
| 222 | –11.753 9 | –17.700 65 | –29.454 55 | –29.425 95 | 0.028 6 |
| 208 | –11.548 9 | –14.974 95 | –26.523 85 | –24.789 95 | 1.733 9 |
| 193 | 25.289 85 | 28.250 325 | 53.540 175 | 53.744 5 | 0.204 325 |
| β-sheet | |||||
| 218 | –12.362 3 | –15.688 925 | –28.051 225 | –28.357 2 | –0.305 975 |
| 195 | 23.953 95 | 30.339 05 | 54.293 | 54.174 95 | –0.118 05 |
重组蛋白SCR2的解折叠温度分析揭示了重组型MBP-SCR2的解折叠温度比带有小分子类亲和标签的重组蛋白SCR2高约5 ℃ (图 6C)，进而从结构上证明其具有较高的温度稳定性。这一数据从一定程度上解释了MBP-SCR2具有较高的存储稳定性的原因。蛋白在存储过程中，其结构可能发生一定程度的解折叠变化，而结构越稳定，其发生解折叠变化的可能性相对较小。因此，在低温下保存60 d后，MBP-SCR2仍保留较高的酶活性。根据MBP具有较高的解折叠温度可知，MBP在稳定MBP-SCR2结构中起了关键作用。
3 讨论目前已经报道的羰基还原酶对于2-羟基苯乙酮的催化活力普遍较低[25-27, 34, 43]。前期，新型羰基还原酶的挖掘[44]以及在现有的羰基还原酶基础上的定点突变[45-46]，为提高羰基还原酶催化2-羟基苯乙酮的主要手段。标签作为重组蛋白的一部分，可能对蛋白的折叠和空间结构有一定的影响。His标签、Strep标签和MBP标签分子量大小和氨基酸序列均有显著差异，因此它们的物理和化学性质不同。本研究所用的His标签由6个组氨酸组成(His6)。His6仅0.8 kDa，其分子量较小，不易影响蛋白质的结构[47]。Strep标签又称生物素结合类标签，通常包含8个氨基酸(WSHPQFEK)，可以和链霉亲和素琼脂糖凝胶(Strep-Tactin) 结合。Strep标签仅1.1 kDa，其分子量小且和Strep-Tactin亲和效率高，因此通过Strep标签一步法纯化后，蛋白纯度通常较高[48]。MBP是一种麦芽糖结合蛋白，通常用来增加融合蛋白的表达量或者溶解度[49]。然而MBP作为亲和标签，和直链淀粉树脂的亲和力一般[50]，因此通常在MBP的N端再设计8个组氨酸标签，利用组氨酸标签的特性纯化蛋白。本研究中重组蛋白MBP-SCR2的纯化利用了上述方法。MBP标签约45 kDa，具有独立的结构域，因此可能会影响融合蛋白的功能[39]。本研究根据以上3种标签的特点，分别构建带有这几种亲和标签的重组蛋白，从而观察不同亲和标签对SCR2的功能造成的影响。
研究过程中证实了重组蛋白SCR2和无融合标签SCR2的酶学性质有一定的差异(表 2)。酶活力数据表明小分子类亲和标签His和Strep对SCR2蛋白的酶活力影响较小，而MBP亲和标签在一定程度上具有提高蛋白稳定性的作用。MBP-SCR2在pH 6.0、30 ℃条件下保温13 h后的剩余酶活力是无融合标签SCR2的1.25倍，是重组蛋白his6-SCR2和strep-SCR2的1.32–1.40倍，且MBP-SCR2在50 ℃的半衰期比strep-SCR2、his6-SCR2和无融合标签SCR2长26.6%–48.8%。结合结构信息学，圆二色谱和解折叠温度分析，从一定程度上解释了MBP-SCR2具有较高热稳定性的原因。MBP中C末端的α螺旋可能具有稳定SCR2的N端无规则卷曲的作用，从而提高了SCR2的稳定性。这一解释和前期Zhang等阐述的SCR羰基还原酶的N端和蛋白结构稳定性及其酶活力相关的结论相吻合[43]。
研究中发现带有小分子类亲和标签的重组蛋白SCR2和无融合标签的SCR2的pH依赖性相对较小。在2个pH单位(pH 4.0–6.0) 的范围内变化时，这些重组蛋白的相对酶活力均高于75%。而解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae来源的羰基还原酶仅在1个pH单位的范围内变化时，其相对酶活力高于75%[25, 27]。因此，本研究构建的重组蛋白SCR2的pH耐受范围相对较宽。此外，本研究中报道的SCR2催化还原2-羟基苯乙酮的酶活力，是目前所报道的其他来源的羰基还原酶如解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica[25]、木兰假丝酵母Candida magnolia[26, 51]和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae[27]的10–100倍(表 2)。进一步的酶活动力学分析证明，SCR2催化2-羟基苯乙酮的酶活动力学催化常数约为101.3 s–1，为目前所报道的最高催化常数，如比多元醇脱氢酶和2, 3-丁二醇脱氢酶[34]分别高约200倍和100倍(表 3)。因此本研究报道的SCR2具有较高的研究价值。
本研究通过构建带有不同亲和标签的3种重组蛋白SCR2，在大肠杆菌中实现异源表达，纯化并研究其酶学性质。研究结果表明，不同亲和标签对重组蛋白SCR2的酶学性质具有一定的影响。其中，重组蛋白MBP-SCR2具有高效稳定催化2-羟基苯乙酮的特点，具有较强的pH依赖性、较宽泛的反应温度范围以及较高的存储稳定性。该研究不仅为羰基还原酶家族增添了一种2-羟基苯乙酮的稳定高效催化剂MBP-SCR2，同时证明了羰基还原酶的功能和性质在一定程度上可以通过亲和标签进行调节。因此，在本研究的基础上，后续可以通过比较亲和标签对多种酶的表达和催化性质的影响，从而总结亲和标签对酶的表达和催化性质等影响的规律，进而指导其他种类的酶的亲和标签的选择。
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