多巴胺(Dopamine) 作为一种简单的儿茶酚胺类化合物，是去甲肾上腺素和肾上腺素的合成前体，也可作为神经递质调控中枢神经系统的多种生理功能。多巴胺系统调节障碍可能引起帕金森病、精神分裂症、Tourette综合症、注意力缺陷多动综合症、垂体肿瘤等症状的发生^[1]。因此，可作为急救药剂，用于临床各种类型休克治疗。与此同时，随着材料表面工程在电子、生物医学等领域的广泛应用，近年来，多巴胺也被开发用于物质的表面修饰^[2]。

利用微生物合成技术可以高效生产多种芳香族化合物，例如苯甲酸^[3]、L-苯丙氨酸^[4]、L-酪氨酸^[5]、左旋多巴^[6]、多巴胺^[7]、酪醇^[5]、3, 4-二羟基苯乙酸^[8]、羟基酪醇^[9]、红景天苷^[10]等。多巴胺作为合成羟基酪醇、羟基红景天苷等高附加值化学品的合成前体，受到了研究人员广泛的关注。Das等^[11]报道了利用大肠杆菌Escherichia coli DH5α表达4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶(HpaBC) 和野猪Sus scrofa的多巴脱羧酶(DDC) 编码基因，以酪氨酸为底物，摇瓶发酵培养24 h，L-DOPA和多巴胺产量分别为26 mg/L和27 mg/L。Nakagawa等^[7]利用敲除tyrR的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，通过双质粒系统pCOLADuet-1-tyrA^fbr- aroG^fbr-tktA-ppsA和pET23a-RsTYR-DODC表达多巴胺合成途径关键基因，获得的工程菌株可以将978 mmol/L甘油(90 g/L) 合成14 mmol/L (2.15 g/L) 的多巴胺，摩尔转化率为3.8%。笔者所在研究组前期通过对基因组上的galP、glk、pgi、pykAF、aroF、aroE、tktA等10个基因进行组合调控，构建出高产3-脱氢莽草酸工程菌WJ060^[12]，该工程菌在5 L发酵罐中以葡萄糖为碳源，发酵52 h后3-脱氢莽草酸产量达到94.4 g/L。在该工程菌的基础上，利用组成型强启动子P_M1-93^[13]在基因组上过表达aroE、tyrA^fbr、hpaBC三个基因，强化左旋多巴合成途径，得到工程菌T004。该菌在5 L发酵罐中补料发酵培养60 h，左旋多巴产量达到60.4 g/L，葡萄糖摩尔转化率为16.8%^[14]。

本研究在左旋多巴大肠杆菌工程菌株T004基础上^[15]，通过筛选高效多巴脱羧酶，实现重组大肠杆菌高效合成多巴胺，合成途径如图 1所示。该工作可以为多巴胺以及下游芳香族衍生物的绿色生物合成研究提供高效的多巴脱羧酶。

图 1 大肠杆菌中多巴胺生物合成途径 Fig. 1 The biosynthetic pathway of dopamine in E. coli. The "red" indicates that the genes are enhanced. The "–" indicates that the genes are deleted. The gray arrows indicate that the pathway is extended. PTS: phosphotransferase system; TCA: tricarboxylic acid cycle; PPP: pentose phosphate pathway; pgi: glucosephosphate isomerase gene; E4P: d-erythrose 4-phosphate; PEP: phosphoenolpyruvate; DAHP: 3-deoxy-arabino-heptulonate 7-phosphate; DHS: 3-dehydroshikimate; CHA: chorismate; Tyr: L-tyrosine; DOPAC: 3, 4-dihydroxy phenylacetic acid; tyrA: CHA mutase/prephenate dehydrogenase gene; aroE: dehydroshikimate reductase gene; hpaBC: 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase gene; galP: galactose permease gene; glk: glucokinase gene; tktA: transketolase Ⅰ gene; pykAF: pyruvate kinaseⅠ/Ⅱ gene; aroF: DAHP synthase gene; tyrR: tyrosine repressor; ddc: DOPA decarboxylase gene; dbh: dopamine β hydroxylase; tyo: tyramine oxidase gene; feaB: phenylacetaldehyde dehydrogenase gene; adh: alcohol dehydrogenase gene.

图选项

本试验所用菌株与质粒如表 1所示。

氨苄青霉素钠(工作浓度100 μg/mL)、氯霉素(工作浓度34 μg/mL)、硫酸卡那霉素(工作浓度50 μg/mL) 购自上海生工生物工程有限公司；质粒小量快速提取试剂盒与DNA回收试剂盒购自康为世纪公司；快速克隆重组酶SooSoMix购自擎科生物公司；TransStart Fast Pfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术公司。

LB培养基(1 L)：5 g酵母提取物，10 g蛋白胨，10 g NaCl，固体平板添加15–20 g琼脂粉。蔗糖LB培养基(1 L)：5 g酵母提取物，10 g蛋白胨，100 g蔗糖，固体平板添加15–20 g琼脂粉。NBS培养基(1 L)：葡萄糖20 g，KH₂PO₄ 3.5 g，K₂HPO₄·3H₂O 6.5 g，(NH₄)₂HPO₄ 3.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，CaCl₂·2H₂O 15 mg，FeCl₃·6H₂O 1.6 mg，CoCl₂·6H₂O 0.2 mg，CuCl₂·2H₂O 0.1 mg，ZnCl₂ 0.2 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2 mg，H₃BO₃ 0.05 mg。发酵种子培养基(1 L)：K₂HPO₄ 5.6 g，(NH4)₂SO₄ 1.2 g，MgSO₄·7H₂O 1.6 g，柠檬酸三钠二水合物1.6 g，FeSO₄·7H₂O 2.8 mg，酵母提取物1 g。发酵罐无机盐培养基(3 L)：K₂HPO₄·3H₂O 22.5 g，(NH₄)₂SO₄ 4.8 g，MgSO₄·7H₂O 6 g，酵母提取物2 g，FeSO₄·7H₂O 0.233 g，柠檬酸6 g。

以E. coli T004为出发菌株，利用Red两步同源重组无痕敲除基因技术实现目的基因整合至大肠杆菌基因组中^[16]。首先以cat-sacB片段为模板，FeaB-cat-sacB-F和FeaB-cat-sacB-R为引物扩增第一步同源重组片段，该片段用于cat-sacB筛选标记基因替换原有基因feaB。以大肠杆菌ATCC8739基因组为模板，FeaB500U-F和FeaB500U-93-R为引物扩增片段A；以合成的野猪Sus scrofa来源的Ssddc基因为模板，P93-F和SsDDC-R为引物扩增片段B-I；以大肠杆菌ATCC8739基因组为模板，FeaB500D-F和FeaB500D-R为引物扩增片段C；以片段A、B-Ⅰ和C为模板，FeaB500U-F和FeaB500D-R为引物扩增得到第二步同源重组片段D-Ⅰ，该片段是合成杂合元件片段M1-93调控的基因Ssddc，用于替换第一步整合的cat-sacB片段。同理，以P93-F和DmDDC-R为引物扩增片段B-Ⅱ；以片段A、B-Ⅱ和C为模板，FeaB500U-F和FeaB500D-R为引物扩增得到第二步同源重组片段D-Ⅱ，该片段是合成杂合元件片段M1-93调控的基因Dmddc，用于替换第一步整合的cat-sacB片段。引物FeaB500U-F和FeaB500D-R同时作为第二步同源重组的验证引物。本研究所用引物见表 2。

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摇瓶发酵：将单菌落接种于3 mL含抗生素的LB培养基中，37 ℃培养过夜。取200 μL接种于10 mL含适当抗生素的NBS培养基中，37 ℃、250 r/min培养48 h。

5 L发酵罐发酵：挑取单菌落到含3 mL LB培养基的试管中，30 ℃、250 r/min培养12–14 h，转接至200 mL发酵种子培养基中培养18 h至OD₆₀₀在4左右，最终将种子液转接至含1.8 L的初始体积发酵培养基的5 L发酵罐体内。培养过程中需向培养基中添加硫酸卡那霉素至50 μg/mL，重组菌株在全自动5.0 L发酵系统BIOTECH-5BG中进行分批补料发酵。根据发酵液中残糖的含量来决定补加葡萄糖的量，补加原则是保持发酵液残糖含量控制在0–5 g/L。培养基pH值通过自动添加氨水(25%，W/W) 控制在6.8，温度控制在37 ℃。以1 vvm通入空气，搅拌速度为300–800 r/min，以保持溶解氧(DO) 水平在30 %。当初始葡萄糖耗尽后，进行计划补料，维持葡萄糖浓度在0–5 g/L，以保持菌株生长到所需的细胞密度。发酵过程中每间隔4 h取样一次，利用高效液相色谱检测发酵液中多巴胺、左旋多巴的含量，利用生物传感分析仪检测葡萄糖含量，利用分光光度计检测菌体密度(OD₆₀₀)。

发酵液样品利用0.5 mmol/L的HCl稀释至待测范围(产物浓度：0.1–1.0 g/L) 后，12 000 r/min离心10 min，用0.22 μm水系滤膜过滤后进行液相色谱分析。高效液相色谱仪(安捷伦1260系列)配备Innoval C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和DAD紫外检测器。检测条件：流动相100%甲醇︰1‰磷酸溶液=20︰80，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，上样量10 μL，检测波长为220 nm和280 nm。

据报道，来自野猪的多巴脱羧酶可以特异性地将L-DOPA转化为多巴胺，广泛应用于多巴胺的生物合成研究^[17-18]。笔者所在研究组前期已经构建了高产L-DOPA的工程菌株大肠杆菌T004^[15]。在此基础上，为了实现多巴胺的高效生物合成，分别在低拷贝质粒pACYC184和中等拷贝质粒pET30a上组成型表达野猪的多巴脱羧酶基因Ssddc。将上述两个质粒分别转入大肠杆菌T004中，获得大肠杆菌TDA01和TDA02菌株。通过摇瓶发酵评价，利用高拷贝质粒表达Ssddc的TDA02菌株的多巴胺产量达到2.18 g/L，显著高于利用低拷贝质粒表达Ssddc的TDA01菌株的产量，但是TDA02菌株的L-DOPA残余量仍然达到1.26 g/L (图 2)。对照菌株T004和TDA01菌株的发酵产物主要是L-DOPA，只有极少量的多巴胺积累。该结果表明DDC催化L-DOPA到多巴胺的反应是限速步骤，通过增加基因拷贝数来提高Ssddc的表达量，从而提高DDC的总酶活力有助于获得更高的多巴胺产量。此外，发酵产物中仍有大量的L-DOPA残余，暗示着L-DOPA脱羧反应过程仍有较大的提升空间。

图 2 含有不同Ssddc拷贝数菌株的摇瓶发酵分析 Fig. 2 Dopamine production and cell growth of engineered E. coli TDA01 and TDA02 with pACYC184-SsDDC and pET30a-SsDDC, respectively. Data are $ \bar x $±s (n=3). Statistics were performed by the two-tailed Student's t-test. *: P < 0.05; ***: P < 0.001.

图选项

为了增强L-DOPA到多巴胺的催化转化能力，笔者继续筛选其他高效的DDC。利用已报道的SsDDC蛋白序列为模板，在NCBI蛋白数据库中进行同源比对，获得100条同源性较高的DDC序列，去除重复序列，选取其中45条进行系统发育树分析。用MEGA6.0软件以邻近相连法(Neighbor joining，NJ) 构建系统发育树，利用Bootstrap进行检验并设定初始值1 000次，模板序列SsDDC位于树形的根部(图 3)。上述45条DDC序列分别来自不同物种，选取与模板序列的同源性最高的野马Equus caballus来源的EcDDC作为其中一条备选序列。其次选取4种不同类型模式动物来源的DDC，分别为智人Homo sapiens HsDDC、小白鼠Mus musculus MmDDC、斑马鱼Danio rerio DrDDC、黑腹果蝇Drosophila melanogaster的DmDDC。SsDDC蛋白由486个氨基酸组成，分子量为54 kDa^[17]。SsDDC与EcDDC的蛋白序列一致性为91.44%，与HsDDC的一致性为89.12%，与MmDDC的一致性为86.43%，与DrDDC的一致性为73.26%，与DmDDC的一致性为59.49%。最终选取上述5条DDC进行后续实验研究。

图 3 不同物种来源DDC的系统发育树分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis of DDC homologs from different organisms.

图选项

将上述5个ddc基因分别连接至pET30a载体上，利用组成型启动子P_M1-93调控相关基因的表达。随后将这些质粒分别转入高产L-DOPA工程菌T004中，获得TDA03-TDA07菌株。通过摇瓶发酵分析，TDA03和TDA04菌株的多巴胺产量均高于TDA02菌株。其中TDA04菌株的多巴胺产量最高，达到3.33 g/L，比生长产量为266.51 mg/(L·OD)，相对葡萄糖的摩尔转化率达到19.6%。TDA04比TDA02菌株的多巴胺产量提高了53%，其L-DOPA残余量明显减少，但仍然达到0.76 g/L (图 4A)。该结果表明HsDDC比SsDDC具有更高的催化活性，更有利于多巴胺的生物合成。虽然TDA07菌株的多巴胺产量低于TDA02菌株，为1.94 g/L，但是其L-DOPA残余量仅有0.02 g/L。

图 4 产多巴胺菌株的发酵评价(A：不同物种来源DDC的多巴胺生产菌株摇瓶发酵评价；B：TDA04菌株5 L发酵罐分批补料发酵评价；C：TDA07菌株5 L发酵罐分批补料发酵评价. “向下箭头”指示过程中补加抗生素的时间点) Fig. 4 Production of dopamine by engineered strains. (A) Dopamine production and cell growth of engineered E. coli strains with different DDC. TLD02 as control strain; TDA02 with Ssddc; TDA03 with Ecddc; TDA04 with Hsddc; TDA05 with Mmddc; TDA06 with Drddc; TDA07 with Dmddc. Data are x±s (n=3). 5 L fed-batch fermentation for dopamine production by strain TDA04 (B) and strain TDA07 (C). The "downward arrow" indicates when antibiotics are added during the fermentation process.

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为了进一步研究工程菌多巴胺的发酵生产性能，笔者选取通过摇瓶发酵多巴胺产量较高的TDA04和L-DOPA残余较少的TDA07菌株，分别进行分批补料发酵评价。上述2个菌株发酵34 h时，多巴胺产量均达到最大值(图 4B–C)。其中TDA04菌株的产量为13.3 g/L，葡萄糖消耗量为126.6 g/L，转化率为12.35% (mol/mol)；TDA07菌株的产量为16.2 g/L，葡萄糖消耗量为157.7 g/L，转化率为12.08% (mol/mol)。TDA04菌株发酵液中L-DOPA残余量达0.45 g/L，而TDA07菌株仅有极少量的L-DOPA残余，产量为0.23 g/L。该结果表明在测试的条件下DmDDC更适合用于将L-DOPA转化为多巴胺。

由于上述工程菌通过pET30a质粒表达外源基因ddc，在发酵放大培养时存在质粒遗传稳定性差的问题。因此，当发酵进行到24 h时补加硫酸卡那霉素，TDA04发酵液中的L-DOPA含量明显降低。该结果表明补加抗生素可能有利于维持细胞内质粒的遗传稳定性，从而有利于ddc基因的稳定表达，促进前体物L-DOPA转化为多巴胺。

为了提高发酵菌种的稳定性，笔者分别将Ssddc和Dmddc整合到T004菌株的feaB (苯乙醛脱氢酶编码基因) 位点进行组成型表达，获得大肠杆菌TD01和TD03菌株。通过摇瓶发酵分析，整合Dmddc后的TD03菌株的多巴胺产量达到2.4 g/L (图 5B)，高于质粒表达的TDA07菌株产量(1.94 g/L)，并且几乎检测不到L-DOPA残余。该结果表明非质粒表达DmDDC的催化活性足以高效地将L-DOPA转化为多巴胺。然而，单拷贝表达Ssddc的TD01菌株只有0.32 g/L多巴胺积累，表明SsDDC的催化活性较低，只有在多基因拷贝下大量表达时才具有较强的多巴胺合成能力。

图 5 ddc基因组整合菌株摇瓶发酵分析 Fig. 5 Dopamine production and cell growth after integrating the ddc genes. (A) Cell growth. (B) Dopamine production. Data are $ \bar x $±s (n=3). Statistics were performed by the two-tailed Student's t-test. **: P < 0.01; ***: P < 0.001.

图选项

为了进一步验证TD03在发酵放大条件下的多巴胺的生物合成能力，笔者对该菌株进行分批补料发酵评价。随着细胞逐渐生长，多巴胺产量逐渐升高。在36 h时，多巴胺产量最高达17.7 g/L (图 6)，葡萄糖消耗量为143.5 g/L，相对葡萄糖的摩尔转化率为14.50%；36 h之后，多巴胺产量迅速降低，并且发酵液颜色越来越黑。L-DOPA在整个发酵过程中始终维持在较低水平。该结果再次证明DmDDC的酶活性较强，即使以基因组上单基因拷贝形式进行表达，仍然能够高效地将L-DOPA转化为多巴胺，并且菌株遗传稳定性强，整个发酵过程无需添加抗生素。该工作为多巴胺以及下游芳香族衍生物的生物合成研究奠定了重要基础。

图 6 TD03菌株5 L发酵罐分批补料发酵评价 Fig. 6 5 L fed-batch fermentation for dopamine production by strain TD03.

图选项

近年来，代谢工程上的突破使得再生资源更容易生产生化产品。这些进展主要包括设计构建大型合成通路(从头合成DNA序列)，以及通过转录或翻译水平工程优化通路表达，这对于避免毒性产物的积累至关重要。目前，这一进展主要依赖于基于单拷贝基因组整合或质粒的基因表达^[19]。

通过将Ssddc连接至不同拷贝数质粒发现，低拷贝质粒虽然在拷贝数上对比基因组单拷贝占优势，但受到遗传不稳定性的影响，培养过程中不断减少的活性重组等位基因的数量，限制了Ssddc基因的最终表达活性^[19]。因此，本研究中Ssddc基因在pACYC184质粒上以多拷贝(1–5/细胞) 形式表达时反而比染色体整合、单拷贝形式存在时多巴胺产量更低。而携带中等拷贝质粒pET30a-SsDDC (约15/细胞) 菌株TDA02通过拷贝数目的进一步增加，使活性等位基因数目大量增加，Ssddc基因的最终表达活性也相应放大，最终多巴胺产量为2.18 g/L，摩尔产率约为12.8% (图 2)，有效地将L-DOPA转化为多巴胺，降低了前体物积累并提高了产量。尽管有研究表明，诱导型启动子控制的低拷贝质粒表达会提高DDC表达活性^[18]，但由组成型启动子控制的中等拷贝质粒表达DDC同样具备优势。组成型启动子的控制不需要额外的诱导剂的添加，消除了诱导剂可能对微生物生长的影响；使发酵过程更加简易的同时降低了生产成本。

本研究通过质粒将平衡表达的异源特异性多巴脱羧酶基因转化到T004菌株中，基于同源序列比对挖掘高效转化的多巴脱羧酶，得到高产多巴胺菌株。其中TDA07菌株的多巴胺产量和OD₆₀₀均显著低于TDA02菌株，分别为1.94 g/L和9，但是L-DOPA残余量仅有0.02 g/L，该结果暗示DmDDC虽然具有较高的催化活性，但是过量表达可能会抑制细胞生长。研究首次发现来自果蝇的异源蛋白DmDDC有效避免了前体物的积累，提高了多巴胺的产量(图 4A)。5 L发酵罐进行分批补料发酵评价，多巴胺的产量达16.2 g/L (图 4C)，远超此前国内外报道的最高水平(2.15 g/L)^[7]。整个发酵过程中，让我们意外发现羟基酪醇的产生。发酵4 h体系中开始出现羟基酪醇，羟基酪醇的量随发酵时间而增加，至16 h羟基酪醇积累0.34 g/L，随后产量逐渐减低至消失。然而不同于质粒表达系统，基因组整合菌株TD03，在整个发酵过程中均可以检测到微量的羟基酪醇的积累。这可能是由于在发酵这个复杂的动态过程中，产物的产量随细胞不断增加而增长，但质粒在过程中的丢失影响多巴胺的产生，羟基酪醇合成前体物也随之减少。与此同时，由于自身的不稳定性不断被消耗，最终导致羟基酪醇积累量逐渐减低至消失。

本研究通过Red同源重组将多巴脱羧酶SsDDC、DmDDC的基因整合到T004中，得到遗传稳定的菌株TD01和TD03。其中TD03相比质粒表达菌株TDA07，多巴胺产量提高了11%。可能是由于多巴胺会被空气中氧气或体内酚羟基氧化酶氧化形成黑色素，菌株TD03发酵36 h后，发酵液颜色逐渐变黑，多巴胺产量也随之下降^{[2, 18]}。与出发菌株T004相比，菌株TD01和TD03明显增加了多巴胺的合成能力，且TD03是TD01产量的7.5倍(图 5B)。这表明基于序列的同源比对挖掘策略是用于开发生物合成的各种催化活性酶的有力工具。

本研究构建了不含质粒的、遗传稳定的高产多巴胺菌株，为高效生产多巴胺提供了基础；同时构建平台菌株，可以用于其他芳香族化合物合成，为实现极具应用前景的苯酚类化合物生产菌构建及生产提供了重要参考。