2021, Vol. 37中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 陈佳杰, 徐美娟, 杨套伟, 张显, 邵明龙, 李华钟, 饶志明
- Chen Jiajie, Xu Meijuan, Yang Taowei, Zhang Xian, Shao Minglong, Li Huazhong, Rao Zhiming
- 亮氨酸脱氢酶C端Loop区域的理性设计及多酶级联高效合成L-2-氨基丁酸
- Rational design of the C-terminal Loop region of leucine dehydrogenase and cascade biosynthesis L-2-aminobutyric acid
- 生物工程学报, 2021, 37(12): 4254-4256
- Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(12): 4254-4256
- 10.13345/j.cjb.210064
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文章历史
- Received: January 20, 2021
- Accepted: March 19, 2021
引用本文
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L-2-氨基丁酸(L-2-aminobutyric acid，L-2-ABA) 是一种非天然手性氨基酸，用于抑制人类神经信息的传递，促进脑细胞代谢[1]，因此被广泛用作手性药物的前体。它可以通过酰胺化制备(S)-2-氨基丁酰胺，是制备抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦的关键前体[2]；也可以通过还原L-2-ABA制备(S)-2-氨基丁醇，是抗结核药物乙胺丁醇的关键手性中间体[3]。目前，L-2-ABA主要是通过化学法或生物法制备。传统的化学制备因成本高、能耗高、污染严重、光学纯度低等缺点失去了竞争力[4]。因此，L-2-ABA的生物制备已成为当今的研究热点，主要用于合成的生物催化剂包括氨基酰化酶[5]、氨基酸氧化酶[6]、腈水解酶[7]、转氨酶[8]、脱氢酶[9]等，其中利用氨基酸脱氢酶催化α-酮酸的不对称还原胺化最具工业前景，除应用最广泛的大肠杆菌外，Weber等[10]利用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae作为全细胞生物催化剂，通过外源添加L-苏氨酸将L-2-氨基丁酸产量提高至1.7 mg/L。近些年来，以L-苏氨酸为底物，苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase，TD)、亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase，LDH)、甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH) 一锅法转化制备L-2-ABA，收率为97.3%[11]。然而，上述方法需要构建两种单基因单独表达或双基因共表达的生物催化剂，并严格配比不同重组酶所需添加的酶量、操作烦琐，增加了生产成本和工艺要求。因此，亟需构建多酶级联催化的单细胞以实现同一宿主的多酶共表达。
亮氨酸脱氢酶(EC1.4.1.9) 以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH) 为辅因子催化α-酮酸的还原胺化且产物分离提取简单、纯度高、适合大规模的工业化生产，因此被广泛用于非天然氨基酸的制备，例如，L-叔亮氨酸[12]、L-2-ABA[13]、(S)-1-环丙基-2-甲氧基乙胺[14]等。在最近的研究中，来源于芽孢杆菌Bacillus[15]、嗜冷芽孢八叠球菌Sporosarcina psychrophila[16]、西伯利亚杆菌Exiguobacterium sibiricum[12]、Alcanivorax dieselolei[17]及Laceyella sacchari[18]的LDHs已经被克隆表达并且酶学性质也已被鉴定，表现出潜在的工业价值，例如来源于Exiguobacterium sibiricum的LDH在α-酮酸的还原胺化中表现出较高的活性且在60 ℃下的半衰期较长。很多研究显示利用蛋白质工程技术对氨基酸脱氢酶进行分子改造，但LDH作为被广泛工业化应用的关键限速酶，其改造进展相对较少。Zhu等[19]使用高通量筛选LDH文库，其中突变体A43V增加了底物结合口袋的疏水性；Xu等[20]应用一种半理性设计改造LDH，定点饱和突变得到一株kcat/Km提高了44.5倍的Q358N突变株。因此，作为L-2-ABA生产中的关键和限速酶，理性设计改造LDH提高其催化活性、构建多酶级联催化的单细胞是本研究的重中之重。
本研究将来源于E. sibiricum的亮氨酸脱氢酶与底物2-酮丁酸(2-ketobutyric acid，2-OBA)对接，再利用分子动力学模拟软件计算分析，发现该酶的均方根涨落(Root mean square fluctuation，RMSF) 值在361–373位氨基酸之间有剧烈波动，因此对该Loop区域合理设计、适当截短该区域的长度，获得了一株比酶活及稳定性均得到改善的突变株，并将其运用至L-2-ABA的生物制备中；此外，由于L-2-ABA制备过程中苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸制备2-OBA的速率过快导致2-OBA积累，使得LDH酶活在高浓度2-OBA存在下被严重抑制，同时FDH提供再生的辅因子NADH不能满足反应的需要，使得多酶催化更加不平衡，因此双拷贝LDH及FDH可以平衡多酶催化速率，构建多酶级联催化的单细胞E. coli BL21/pACYCDuet-RM (图 1)。
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| 图 1 多酶级联表达制备L-2-氨基丁酸的示意图 Fig. 1 Schematic diagram of preparing L-2-aminobutyric acid by multi-enzyme cascade biosynthesis. |
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大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 及表达质粒pET28a (+) 由本实验室保藏；重组质粒pET28a-Esldh由本研究构建。本研究使用的引物见表 1。
| Primer names | Primer sequences (5′–3′) |
| DF | AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGTGGAAACCAATGTGGAAG |
| D1 R | TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAACTGCGGGCGCTACC |
| D2 R | TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACAGAAACTGACTGCGGGC |
| D3 R | TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAAATGTTCTTATCGCGACGCAGA |
| ES F | ATCACCACAGCCAGGATCCAATGGTGGAAACCAATGTGGAAG |
| ES-FDH R | AATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATTACAGAAACTGACTGCGGGC |
| ES-FDH F | CCCGCAGTCAGTTTCTGTAATAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTG |
| FDH-TD R | CCCTATAGTGAGTCGTATTATTATTTCTTATCGTGTTTACCGTAAGCTTT |
| FDH-TD F | GTAAACACGATAAGAAATAATAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTG |
| TD R | CATTATGCGGCCGCAAGCTTCTAACCCGCCAAAAAGAACCT |
| pACYCDuet-MCS1 F | AAGCTTGCGGCCGCATAA |
| pACYCDuet-MCS1 R | TGGATCCTGGCTGTGGTG |
| pACYCDuet-MCS2 F | CTCGAGTCTGGTAAAGAAACCG |
| pACYCDuet-MCS2 R | GGTACCGACGTCAGCGATC |
| Restriction sites are shown in underlined parts. | |
ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit、2×Phanta® Max Master Mix、DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司；BamH Ⅰ和Hind Ⅲ等限制性内切核酸酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司；L-2-ABA、2-OBA、氯霉素、卡那霉素等购自上海阿拉丁生化科技有限公司。
1.2 培养基LB培养基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0)；发酵TY培养基(酵母提取物8 g/L，胰蛋白胨12 g/L，K3PO4 4 g/L，NaCl 3 g/L，一水合柠檬酸2.1 g/L，柠檬酸铁铵0.3 g/L，甘油10 g/L，(NH4)2SO4 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0)，补料培养基(甘油400 g/L，酵母提取物50 g/L，胰蛋白胨25 g/L) 用于5 L发酵罐发酵。
1.3 突变体的构建使用表 1引物、以pET28a-Esldh质粒为模板扩增片段，将其连接到表达载体pET28a上，并将重组质粒转化到E. coli BL21(DE3) 中，经过测序及单双酶切验证构建突变体E. coli/pET28a- EsldhDx。
1.4 蛋白的表达与纯化将重组菌E. coli BL21/pET28a-EsldhDx接种到含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37 ℃、200 r/min振荡培养10–12 h后，转接、培养至OD600为0.6–0.8，加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D- thiogalactoside，IPTG)，于25 ℃诱导培养后，4 ℃、8 000 r/min离心收集菌体，用0.1 mol/L PBS缓冲液(pH 7.4) 洗涤菌体，菌悬液冰浴超声破碎，4 ℃、8 000 r/min离心取上清用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[21]。
利用镍离子亲和层析柱纯化[22]。通过观察紫外吸收峰收集洗脱液，SDS-PAGE分析，其余纯酶用于下一步酶活测定及酶学性质研究，以牛血清白蛋白BSA为标准品、Bradford法测定蛋白浓度[23]。
1.5 酶活力的测定使用分光光度计监测340 nm处的吸光度差值，LDH酶活测定体系：0.9 mol/L NH4Cl-NH3·H2O缓冲液(pH 9.0)，10 mmol/L 2-OBA，0.3 mmol/L NADH和适量纯酶[24]。酶活力定义为：在上述条件下，每分钟消耗1 μmol NADH所需要的酶量定义为一个酶活单位(1 U)。
1.6 酶学性质的研究酶的最适反应pH及温度：改变缓冲液的pH (Tris-HCl，pH 6.0–7.0；NH4Cl-NH3·H2O，pH 7.0–10.0，每组间隔1)，测定最适pH；在不同温度(30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、70 ℃) 下测定最适温度，以最高酶活定义为100%。
温度稳定性研究：将纯酶放置于不同温度的缓冲液(30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃) 中，每隔一段时间测定酶活。以0 h相对酶活定义为100%。
动力学参数研究：改变底物浓度(分别为0.5、1、2、4、6、8 mmol/L)，测定酶活力。以Hill方程V=Vmax(Sn)/(Kn+Sn) 进行线性拟合。
1.7 分子动力学模拟SWISS-MODEL Workspace用于预测三维结构模型[24]。所有蛋白的MD模拟均使用GROMACS和GROMOS96 43A1 AMBER force field[25]。使用AUTODOCK Vina将底物2-OBA分子对接至蛋白质结构中[26]。通过将该蛋白置于十二面体中添加抗衡离子，并使能量最小化，在确定温度及压力的环境下平衡NVT体系并进行模拟，模拟时长30 ns，步长2 fs，水分子模型为spc216，溶剂模型为显式。
1.8 多酶级联单细胞的构建以质粒pET28a-Esldh、pET28a-ilvA、pET28a-fdh为模板扩增均包含T7启动子的Esldh、ivlA、fdh基因，使用重叠延伸PCR构建多酶级联的重组菌株。先将Esldh-fdh-ivlA的大片段融合、扩增、与表达质粒pACYCDuet的第一个多克隆位点连接以获得重组质粒pACYCDuet- Esldh-fdh-ivlA，pACYCDuet-EsldhD2-fdh-ivlA。将得到的重组质粒转化到E. coli BL21(DE3) 中，得到重组菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RO和E. coli BL21/pACYCDuet-RT。将融合后的片段EsldhD2-fdh扩增，连接到构建好的重组质粒的第二个多克隆位点处，最终得到重组菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM (图 2)。
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| 图 2 pACYCDuet-RM质粒的图谱 Fig. 2 Map of the plasmid pACYCDuet-RM. |
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发酵培养重组菌株E. coli BL21/ pACYCDuet-RM，离心、收集菌体用于全细胞转化。转化体系为200 mL，包括L-苏氨酸、甲酸铵、菌体及PB缓冲液(100 mmol/L)。
转化初始pH的优化：控制反应温度为30 ℃，L-苏氨酸100 g/L、甲酸铵60 g/L，菌体OD600为60，初始pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的条件下进行全细胞转化反应，并以不控制pH的转化条件作为对照。
转化温度优化：控制初始反应pH 7.5，反应温度分别为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃的条件下进行全细胞转化反应。
底物浓度的优化：控制反应温度35 ℃，初始pH 7.5，分别设置L-苏氨酸浓度为40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120 g/L进行全细胞转化。
1.10 HPLC分析方法底物L-苏氨酸和产物L-2-ABA的浓度通过安捷伦LC1260型号的高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC) 系统进行测定，其检测方法是通过OPA FMOC在线衍生化来测定，HPLC色谱条件为：C18色谱柱，流速为1 mL/min，柱温40 ℃，波长338 nm的紫外检测器下检测，流动相为盐相与有机相梯度洗脱，具体方法参考文献[10]。
中间产物2-OBA属于有机酸，利用安捷伦LC1260型号的高效液相色谱系统来测定。其HPLC色谱条件为：Aminex HPX-87H有机酸分析柱，流速为0.5 mL/min，柱温35 ℃，波长210 nm处的紫外检测器下检测，流动相为0.272%的稀硫酸水溶液。
2 结果与分析 2.1 亮氨酸脱氢酶截短区域的选择及其突变体的构建对于EsLDH蛋白，通过分子动力学模拟对接底物小分子之后分析RMSF的变化，找到EsLDH最灵活的区域，该区域可能导致蛋白质分子不稳定。如图 3所示，在氨基酸361–374位之间即Loop区域中观察到最大的波动，其中氨基酸361–364位的RMSF值剧烈升高，364–370位的RMSF值剧烈减低，370–374位的RMSF值又急剧上升，表明该区域及其不稳定。因此，删除Loop区域与RMSF值相关的氨基酸包括361–374位、364–374位、370–374位将其命名为EsLDHD1、EsLDHD2、EsLDHD3。
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| 图 3 野生型EsLDH的RMSF值 Fig. 3 The RMSF value of the wild-type EsLDH. The part framed by the red dashed line indicates the area where the RMSF value fluctuates the most. |
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将PCR产物导入E. coli BL21(DE3) 宿主中，涂布于抗性平板。挑选转化子培养提取质粒进行单、双酶切验证，验证结果如图 4所示，在1 000–2 000 bp之间有明亮条带，符合Esldh长度大小，在4 000–7 000 bp之间有明亮条带，符合pET28a和pET28a-Esldh线性化后的长度大小，证明基因已成功导入E. coli BL21中。将验证成功的突变株测序。
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| 图 4 截短突变体的构建 Fig. 4 Construction of truncated mutants. Single and double restriction digestion verification of plasmid pET28a-Esldh gene. M: DL10 000 marker; lane 1–2: EsldhD1; lane 3–4: EsldhD2; lane 5–6: EsldhD3. |
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将野生型EsLDH及截短突变体EsLDHD1、EsLDHD2、EsLDHD3发酵培养、超声波破碎取上清。
通过Ni-NTA亲和层析柱纯化酶蛋白，SDS-PAGE检测纯化结果。如图 5所示，所有酶蛋白均在44.3 kDa左右有单一且清晰的条带，与理论分子量一致。
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| 图 5 野生型EsLDH及突变体的纯化 Fig. 5 Purification of the wild-type EsLDH and its mutants. M: protein marker; lane 1–2: EsLDHD1; lane 3–4: EsLDHD2; lane 5–6: EsLDHD3; lane 7–8: EsLDH. |
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以野生型为对照，取同等蛋白浓度的纯酶测定其相对比酶活，结果如图 6所示，以野生型蛋白EsLDH的比酶活为100%，截短突变体D2的相对比酶活较高(123.2%)，其余截短突变体的比酶活均有所降低，分别为39.9%和74.8%。这个结果说明截短Loop处的氨基酸确实可以大幅影响酶活力，而且364–374位氨基酸的截短则显著提高了比酶活。对该突变体做进一步的酶学性质的研究。
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| 图 6 野生型EsLDH及突变体的相对比酶活 Fig. 6 Relative enzyme activity of the wild-type EsLDH and its mutants. The error bars show standard deviations calculated for three replicate experiments. |
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由图 7A可知，突变体EsLDHD2与野生型的最适温度为55 ℃。在30–55 ℃的范围内，酶活力随温度升高而升高，而在55 ℃之后酶活力开始降低，当温度超过60 ℃时，催化活性显著下降。由图 7B可知，突变体EsLDHD2与野生型的最适pH为9.0，而且在中性和碱性条件下的相对催化活性明显高于野生型。当缓冲环境为碱性时酶活力普遍偏高说明该酶偏好碱性环境。
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| 图 7 野生型EsLDH及突变体的酶学性质研究 Fig. 7 Enzymatic properties of the wild-type EsLDH and its mutants. (A) The optimal temperature. (B) The optimal pH. (C) Residual activity after incubated for 12 h at different temperatures. (D) Residual activity incubated at 60 ℃. The error bars show standard deviations calculated for three replicate experiments. |
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图 7C是在不同温度下孵育12 h后，野生型和突变体EsLDHD2的相对酶活力。随着孵育温度的不断升高，残余酶活不断降低。当突变体在30–55 ℃孵育12 h后的残余相对酶活均明显高于野生型，但6 ℃的相对酶活仅为18.7%。当相对酶活力下降至最初状态的一半时的时间即为酶的半衰期。由图 7D可知，野生型在最适温度下的半衰期为8 h，突变体EsLDHD2的半衰期较野生型提高了2.4 h，为10.4 h。目前推测截短相关的Loop区域有利于比酶活的提高，同时也提高了热稳定性。
2.3.4 野生型EsLDH与突变体的动力学参数以2-OBA为底物测量野生型LDH及其突变体的动力学参数(表 2)。结果表明，EsLDHD2的Km值比野生型低近8.2倍，kcat/Km值比野生型高4倍，说明EsLDHD2显著提高了对于底物2-OBA的亲和力和催化效率。
| WT | EsLDHD2 | |
| Km (mmol/L) | 0.905±0.090 | 0.110±0.029 |
| kcat (s–1) | 0.296±0.024 | 0.147±0.027 |
| kcat/Km (L/(mmol·s)) | 0.327 | 1.336 |
根据网站预测(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/)，EsLDH的4个活性中心分别为G51、K77、K89和D124。根据预测的LDH的2-OBA结合通道，使用AUTODOCK Vina将底物2-OBA分子对接到蛋白质结构中，关键活性位点及所需截短的区域均在图 8A中显示。使用GROMACS进行分子动力学模拟。RMSD的结果表明，突变体的结构相较于野生型更稳定；RMSF值与野生型无较大差异；回旋半径Rg定义为旋转系统中轴到最大惯性点的距离，其显著降低表明截短后蛋白构象的紧密性更好，这很好地解释了截短后突变体的热稳定性显著提高的现象(图 8B)。有文献显示，删除暴露的Loop区域可以提高稳定性且Loop的长度和稳定性之间呈现负相关，通过缩短环的长度来增加稳定性[25-26]。除此之外，我们推测C端Loop区域的截短导致底物进入结合通道的空间变大，底物更易结合导致酶活提高。通过MMPBSA方法计算了底物与蛋白之间的结合自由能，野生型体系的结合自由能为−3.45 kcal/mol，突变后体系的结合自由能为−6.28 kcal/mol，这充分显示了突变后的蛋白与底物的结合更强，佐证了我们的推测。
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| 图 8 EsLDH的三维结构模拟及分子动力学模拟分析参数变化 Fig. 8 Three-dimensional structure simulation of the EsLDH and molecular dynamics simulation analysis of parameter changes. (A) Three-dimensional structure simulation of EsLDH and partial enlargement of key areas. EsLDH (right) was shown in different colors, with helixs in blue, sheets in purple, and Loops in magenta. A partial enlarged view of key sites was shown on the left, with substrate in yellow, active centers and the truncated Loop areas by red sticks. (B) Analysis of EsLDH and its mutant D2 after docking 2-OBA by molecular dynamics simulation about RMSD, RMSF and Rg between wild type and its mutant. |
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考虑到2-OBA和NADH相对比较昂贵，因此在E. coli BL21(DE3) 中共表达了来自E. coli的TD和来自博伊丁氏假丝酵母Candida boidinii的FDH以构建多酶级联的单细胞。但是，第一次转化的结果并不理想，因为TD转化L-苏氨酸的速度更快，导致中间产物2-OBA的积累限制了L-2-ABA的制备。因此我们旨在通过双拷贝LDH和FDH调节从2-OBA到L-2-ABA的转化；同时在实际的多表达系统中，基因插入位置不同，表达也不同[27]，因此，将ivlA基因插入Esldh和fdh之后以削弱TD的表达。将构建好的重组菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RO、E. coli BL21/ pACYCDuet-RT，E. coli BL21/pACYCDuet-RM分别发酵培养、破碎获得粗酶，测定粗酶中TD、LDH、FDH的酶活；同时将3株菌发酵培养、收集菌体用于全细胞转化制备L-2-ABA，HPLC测定L-2-ABA及2-OBA的浓度。由表 3可知，菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM相较于原始菌和另两株重组菌具有明显的优越性，摩尔转化率相较于E. coli BL21/pACYCDuet-RO、E. coli BL21/ pACYCDuet-RT各提高了74.6%和39.0%。
| Strains | TD (U/mL) |
LDH (U/mL) |
FDH (U/mL) |
L-2-ABA (g/L) | 2-OBA (g/L) | Molar conversion rate (%) |
| E. coli BL21/pACYCDuet | 4.6±0.5 | 1.7±0.2 | n/a | n/a | 0.2 | n/a |
| E. coli BL21/pACYCDuet-RO | 62.0±6.4 | 39.1±5.4 | 0.4±0.2 | 33.5 | 43.3 | 39.4 |
| E. coli BL21/pACYCDuet-RT | 57.8±5.1 | 48.8±6.1 | 0.4±0.2 | 42.1 | 39.8 | 49.5 |
| E. coli BL21/pACYCDuet-RM | 56.2±8.2 | 70.4±5.7 | 0.7±0.1 | 58.5 | 12.5 | 68.8 |
| n/a means not detected. | ||||||
由图 9A可知，控制全细胞转化温度为30 ℃、底物L-苏氨酸的浓度为100 g/L、等摩尔的辅底物甲酸铵、转化OD600为60，制备L-2-ABA的最适pH为7.5，此时重组菌E. coli/pACYCDuet-RM转化产物的产量达到最大值且中间产物2-OBA的积累量少于10 g/L，此时产量为59.3 g/L，产率达70%。由图 9B可知，控制转化pH为7.5，在其他转化条件不变的情况下，制备L-2-ABA的最适温度为35 ℃，此时重组菌E. coli/pACYCDuet-RM转化产物的产量达到最大值68.4 g/L，中间产物2-OBA的积累量为13 g/L，此时产率达80.5%。由图 9C可知，控制转化pH为7.5、转化温度为35 ℃，在其他转化条件不变的情况下改变全细胞转化的底物L-苏氨酸的浓度，其最适底物浓度为80 g/L，此时重组菌E. coli/pACYCDuet-RM转化产物的产量达到最大值66.4 g/L，此时产率接近100%。
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| 图 9 全细胞转化条件优化 Fig. 9 Optimization of the whole cell biotransformation. (A) The optimal temperature. (B) The optimal pH. (C) The optimal substrate concentration. The error bars show standard deviations calculated for three replicate experiments. |
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将重组菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM在5 L发酵罐中培养，将溶氧电极偶联搅拌速度和通气量，在OD增长至对数生长期时加入IPTG诱导，当OD不再增加时收集细胞进行全细胞转化。在最适条件下转化，120 g L-苏氨酸制备了97.9 g的L-2-ABA，其摩尔转化率为96%，且底物转化率大于99% (图 10)。
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| 图 10 5 L发酵罐全细胞转化制备L-2-ABA Fig. 10 Whole-cell biotransformation in 5 L fermenter for the production of L-2-ABA. The error bars show standard deviations calculated for three replicate experiments. |
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迄今为止，L-2-ABA主要是由一锅法制备，最高产量是在30 L的转化系统中生产了29.2 mol L-2-ABA，产率为97.3%。然而，该催化系统需要严格配比两种以上的菌体量且需要添加辅因子，这增加了工艺的复杂性和生产成本[28]。然而，并没太多通过单细胞制备L-2-ABA的尝试，并且最新报道的产量仅达到68.5 g/L[29]。在我们的研究中，单细胞E. coli BL21/pACYCDuet-RM产量达97.9 g/L，为L-2-ABA工业化的进一步应用奠定了理论和实验基础。
3 讨论本文通过同源建模得到LDH的三维结构并对接底物2-OBA，GROMACS模拟分析RMSF值，通过截短RMSF值剧烈波动的Loop区域、测定比酶活，发现截短突变体EsLDHD2的比酶活提高了23.2%且热稳定性也得到改善，其半衰期较野生型提高了2.4 h (为10.4 h)，推测回旋半径Rg的显著降低使截短后蛋白构象的紧密性更好，导致稳定性改善且C端Loop区域的截短导致底物进入结合通道的空间变大，底物更易结合，酶活提高。除此之外，由于涉及多酶级联催化导致中间产物2-OBA积累限制了L-2-ABA的制备。因此本文旨在通过双拷贝LDH和FDH以加快从2-OBA到L-2-ABA的转化从而实现多酶催化的平衡。结果显示，双拷贝菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM相较于原始菌和另两株重组菌具有明显的优越性，摩尔转化率相较于E. coli BL21/pACYCDuet-RO提高了74.6%。
酶法催化需要额外添加辅因子增加了工业成本且易失活，而全细胞催化更稳定、胞内存在的辅因子足以满足辅酶循环所需，同时省去了酶法催化所需的破碎细胞的过程，经济效益更高。所以为了契合实际的工业生产，本研究对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM全细胞转化合成L-2-氨基丁酸的反应条件也进行了优化。结果表明，在温度35 ℃、pH 7.5、底物浓度80 g/L的最适条件下，摩尔转化率大于99%；在最适底物浓度以下其转化率也基本大于99%，但随着底物浓度的增加，中间产物不断积累，转化率持续下降。5 L发酵罐发酵培养E. coli BL21/pACYCDuet-RM且在最适条件下转化，120 g L-苏氨酸得到97.9 g L-2-ABA，其摩尔转化率为96%，且底物转化率大于99%。综上所述，文中所构建的突变株及其相关研究结果为L-2-氨基丁酸的工业化应用进一步奠定了理论和实验基础。
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Wang Y, Li GS, Qiao P, et al. Increased productivity of L-2-aminobutyric acid and total turnover number of NAD+/NADH in a one-pot system through enhanced thermostability of L-threonine deaminase. Biotechnol Lett, 2018, 40(11): 1551-1559.
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