自然界中，酶经过亿万年的进化，形成复杂又精巧的结构以行使其功能^[1-2]。了解其如何进化成现在的结构与功能有助于我们更好地了解地球早期地质生物化学演化^[3]、物种的起源与进化^[4]和结构与功能关系的演化^[5-6]等。祖先序列重建技术(Ancestral sequence reconstruction，ASR)，为解决部分这些基本问题提供了新的思路^[7]，特别是酶祖先序列重建技术。该技术通常可分为6个步骤，即搜集同源序列集、序列集多序列比对、系统发育树构建、计算机工具推测祖先序列、实验室克隆、酶学性质表征(图 1)。ASR使得研究人员能够(1) 重建和“复活”，即在体内或体外合成灭绝的酶，以研究它们与现代酶的差异；(2) 识别在时间尺度上改变酶功能的关键氨基酸变化；(3) 从垂直的角度研究酶序列，结构与功能的关系^[8]等。同时，前寒武纪时期地球的极端环境如高温和原始细胞仅依赖于少数酶系的假设，祖先酶通常具有更好的热稳定性^[9-10]、高异源表达量^[11-13]、低pH活力^[14]、高活性^[9]、催化混杂性(Catalytic promiscuity)^[15-16]等，更符合现代绿色生物制造对工业酶的需求^[17]。除此之外，祖先酶还有突变耐受性，在酶定向进化技术广泛应用于工业酶定制的背景下^[18]，祖先酶相较于现代酶展现出更好地作为突变亲本和蛋白质支架的能力^[19]。基于此，本综述介绍了酶祖先序列重建技术的发展历程和常用工具，重点讨论了其在酶定向进化领域的应用前景。

图 1 酶祖先序列重建技术流程 Fig. 1 Process of ASR of enzymes.

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从已知的现存蛋白质序列中推导出古代/祖先蛋白质序列相对合理的近似值的设想最初是由Pauling和Zuckerkandl在20世纪60年代提出(图 2)^[20]。然而，它一直是一个理论概念，直到20世纪90年代，随着生物信息学的进步，蛋白质序列的日益增加和分子生物学的进步使得祖先序列编码的蛋白质能够在实验室中分子克隆。1990年，Stackhouse等首次报道了酶祖先序列的实验室重建，作者使用最大简约法(Maximum parsimony，MP) 重建了生活于上新世(530万年前至258.8万年前) 的沼泽水牛和河牛共同祖先的核糖核酸酶和两个可能是现代核糖核酸酶进化过程中的中间产物序列，并在实验室中表征了它们的性质^[21]。MP算法重建的祖先蛋白序列被定义为能够通过最少的点突变转化为其后代序列的序列，后续使用MP算法又复活了祖先溶菌酶^[22]和祖先糜酶^[23] (表 1)。1995年，Yang等在其设计的PAML软件包中实现了通过最大似然法(Maximum likelihood，ML) 重建祖先序列^[24]，自此MP算法逐渐被淘汰。1997年，Zhang等比较了MP、ML和他们开发的基于距离的贝叶斯算法(Distance-based Bayesian) 推断祖先氨基酸序列的准确性^[25]。在ML算法中，使用进化的统计模型来计算序列中与树的最深节点相关联的每个位置上的每种氨基酸的可能性。祖先序列被定义为其中每个残基在其相关位置存在的可能性最大的残基集合。贝叶斯算法则将与系统发育树拓扑、分支长度和替换模型相关的不确定性集成到祖先序列计算中^[7]。当氨基酸序列的离散度较低时，这3种方法都能给出可靠的推断。然而，当序列分歧程度较高时，ML和基于距离的贝叶斯算法比MP算法给出更准确的结果。2002年，Zhang等利用基于距离的贝叶斯算法和MP算法重建高等灵长类动物核糖核酸酶的祖先序列并在实验室中表征其酶学性质。作者研究发现，MP算法推测的祖先序列与贝叶斯推论获得祖先序列大体一致^[26]。2006年，Williams等将真实祖先序列的热力学性质与由MP、ML和贝叶斯算法推断的“祖先序列”的性质进行比较。作者发现MP和ML算法高估了“祖先序列”的热稳定性，而贝叶斯算法则不会高估“祖先序列”的热稳定性^[27]。Hall等比较了ML和贝叶斯算法的理论精度，发现贝叶斯算法推断的DNA序列比ML算法推断的DNA序列更准确，但对于推断的蛋白质序列则相反^[28]。2012年，Hobbs报道了分别使用ML和贝叶斯算法从芽孢杆菌的最后一个共同祖先中重建结构复杂的核心代谢酶3-异丙基苹果酸脱氢酶。这种酶的贝叶斯版本也是嗜热的，但表现出异常的催化动力学^[29]，说明贝叶斯版本比其ML版本的祖先序列包含更多的序列错误。

图 2 祖先序列重建算法的发展历程 Fig. 2 The history of ASR algorithm.

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综上所述，ML和贝叶斯算法是目前祖先序列重建的首选算法，尤其是Yang等开发的PAML软件包中的Codeml模块^[24]，然而两者的优劣，不同的研究对象具有不同的结论，目前尚无广泛认可的证据说明二者的优劣。

酶祖先序列重建首先被用作探索进化假说和进化过程的工具^{[22, 30]}，继而被用作地球生物学的重要研究手段，研究分子在行星时间尺度上对不断变化的环境的适应性^[31]。2010年，Harms等探讨了酶祖先序列重建作为重要手段，研究酶的历史突变对其功能多样化的影响的优势及示范性案例^[6]。作者提出通过对祖先酶的序列重建和生化性质评估，有望对塑造蛋白质进化的物理化学决定因素和蛋白质结构的历史决定因素提供新的见解^[6]。2013年，Risso等对A类β-内酰胺酶进化中的几个前寒武纪节点进行了序列重建、异源表达和生化特征分析。这些结果支持前寒武纪生命是嗜热的推论，蛋白质在自然进化过程中从催化底物杂乱无章的“多面手”进化成“专家”的观点(图 3)。作者还强调了前寒武纪蛋白质在实验室中序列重建在生物技术领域的潜力。因为高稳定性和催化混杂性是蛋白质支架在分子设计和定向进化方面的有利特征^[32]。

图 3 实验室序列重建的前寒武纪β-内酰胺酶的稳定性和混杂性[32] Fig. 3 The stability and promiscuousness of Precambrian β-lactamase reconstructed in the laboratory[32]. (A) A tree derived from phylogenetic analysis of 75 modern lactamase sequences. (B) The biophysical and chemical properties of Precambrian lactamase.

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后续一系列研究表明，序列重建的祖先酶通常表现出高稳定性^{[10, 33]}、高活性^[34]、底物混杂性^{[11, 35]}和催化混杂性等^[36]，这些特征有助于酶的进一步进化^[37]，并引起了广泛的关注^{[8, 17, 19, 37-39]}。基因组和后基因组时代的序列数据库的指数增长，加上系统发育学和生物信息学的进步，已经将ASR转变为几乎例行的计算程序。因此，酶祖先序列重建技术有成为常规的挖掘和设计性能优异的工业酶的工具的发展趋势^{[9, 12, 40-42]}。如2018年，Gumulya等通过ASR技术获得了能够承受高温和长时间反应的P450酶和酮醇酸还原异构酶。CYP3家族的脊椎动物祖先体中的P450酶(CYP3_N1) 比现存人体中的CYP3A4对溶剂的耐受性更强，同时以相当的效率催化相似的底物范围。此外，与现存的大肠杆菌来源的酮醇酸还原异构酶相比，祖先酶的比活力提高了8倍，热稳定性也更好^[9]。为了确定祖先CYP3是热稳定性的推断的稳健性，作者进一步构建了祖先序列预测中不确定性最大的10个位点的祖先酶库，在1 023个突变样本中，77%的突变体能够正常表达，大多数突变体表现出类似的热稳定性，其中222个突变体的热稳定性明显高于CYP3_N1。作者提出即使只使用最近祖先的序列数据也可以设计出耐热蛋白质。2019年，Chaloupkova等描述了酶祖先序列重建具有获得多功能催化剂的潜力^[43]。

除此之外，酶祖先序列重建还被用于探究宇宙生命共同祖先的环境温度^[44]；生物分子机器复杂性的进化^[45]；酶催化功能的起源与进化，如尿酸酶^[46]、解毒酶^[47]；揭示抗癌药物格列卫选择性的详细原子机制^[48]；促进蛋白质结晶^[49]；提高苯丙氨酸/酪氨酸解胺酶疗法的潜力^[50]；CMGC组激酶特异性的进化机制^[15]和调控进化^[51]；代谢途径进化的大规模分析^[52]；丝氨酸-苏氨酸激酶变构激活的起源^[53]等(表 1)。

序列的搜集和选择是ASR的第一步，通常以目标序列作为“Query”在NCBI、Uniprot等数据库中搜索同源序列，导出同源性序列以待进一步多序列比对(Multiple sequence alignment，MSA) 分析。MSA是生物信息学许多领域的核心，已经发展出连串的软件及比对结果修饰工具(表 2)，其中使用较多的软件为ClustalW^[68]和MUSCLE (Multiple sequence comparison by log-expectation)^[69]。虽然ClustalW更加常用，但MUSCLE更为精确，且对于常规大小的数据集，其运行速度是ClustalW的2-5倍。软件直接输出的比对结果一般不能直接用于构建系统发育树，需要借助修饰软件或者手动去除长尾序列等进一步的修饰，如trimAl^[70]，一个自动比对修剪的工具，可以从比对中去除排列不佳的区域以提高后续分析的质量。

用于MSA的序列丰度和准确的序列比对结果对系统发育树的精确构建具有重要的影响。平均氨基酸一致性百分率可用于评估多序列比对结果的可靠性。Ogden和Rosenberg的研究表明，当该值大于50%时，那么序列比对准确性对系统发育树构建的影响就微乎其微^[71]。

系统发育树(Phylogenetic tree，PT) 是由分支和连接的节点组成的，代表不同物种与它们祖先的关系或基因蛋白质序列与其祖先序列的关系。树内部节点代表“假定的祖先”，分支的长度代表祖先和它后代之间的变异程度。构建系统发育树的软件和算法有很多，其中Mega是使用最为广泛的软件，涵盖了邻接法、最大简约法、最大似然法等算法^[72]。MrBayers是广泛认可的使用贝叶斯推论(Bayesian inference) 构建系统发育树的软件^[73]。Ogden等和Hall等使用更接近生物学进化过程的模拟数据，比较了多种不同建树方法构建的树与正确的树的接近程度，同时考察了系统发育树拓扑结构和分支长度的准确性。两项研究结果表明，贝叶斯推论法比最大似然法稍准确，然后是最大简约法，而邻接法是准确性最低的方法^{[71, 74]}。

系统发育树构建是祖先序列重建技术的关键步骤，系统发育树算法的基本原理、可靠性检验方法和常用软件使用可以参考由陈士超等翻译的美国Barry G. Hall著作的《轻松构建系统发育树使用操作方法和理论》^[75]和相关文献综述^[76]。

ML和贝叶斯算法是目前ASR最常使用的计算机算法，其中由著名华裔科学家、伦敦大学统计遗传学教授杨子恒开发的PAML软件包^[24]是目前应用最广泛的祖先序列重建软件(表 2)，并免费提供给学术研究使用。PAML并不是最好的系统发育树构建软件，但在系统发育树的基础上可以非常有效地进行：进化参数估计、进化假说检验、分歧时间估计和正选择估计等。CodeML是PAML软件包下的一个程序，在估算蛋白编码序列同义替换的非同义替换速率、检测序列是否已经受正选择和ASR中受到广泛的认可。使用CodeML进行序列重建需要已经比对好的序列文件和树文件，还需要一个配置好的控制文件。

MrBayers是基于贝叶斯算法重建祖先序列的常用软件，它需要输入比对好的Nexus格式文件和一些指令来执行它的工作。祖先序列重建计算机算法的更多理论基础可以参考Merkl等的综述^[7-8]。

除此之外，还有系列ASR综合工具被开发出来，如PhyloBot^[77]、FastML^[78]和基于Mega的软件包(表 2)，它们将ASR所需的软件(多序列比对、系统发育树构建、祖先序列重建) 集成到一个用户界面中，还包括可视化工具，极大地简化了重建过程。如2016年，Hanson-Smith等开发的基于网络的工具PhyloBot^[77]。它专门为不熟悉生物信息学的科学家设计，可以在网络浏览器上运行，不需要在用户的电脑上安装。用户只需上传FASTA格式的蛋白质序列集合，为作业创建一个唯一的名称，并指定外类群(Outgroup)，然后使用网站默认的设置即可启动作业。外类群的定义是与内类群序列关系远于内类群序列内部相互关系的一条或多条序列。Mega软件中也整合了ASR工具(Ancestors) 和时间进化树分析工具(Computer timetree)。2020年，Carletti等建立了一个来自灭绝有机体的序列重建蛋白质的网络数据库^[79]。它包含来自文献的84个序列重建蛋白质的精选集合，每种蛋白质都有广泛的注释，包括结构、生化和生物物理信息。上述综合工具的开发与运用，一定程度上降低了ASR应用所需的计算机技术门槛。

2001年，Miyazaki等开发了一种基于ASR方法的耐热酶理性设计方法(图 4)，作者将推断的3-异丙基苹果酸脱氢酶的祖先氨基酸残基引入现代嗜热酶中，在测试的7个突变体中，有5个突变体表现出比野生酶更高的热稳定性，且突变对酶的催化活性没有明显影响^[82]，这一实验结果与原核生物共同祖先是极端嗜热的假说是一致的。该团队进一步将祖先氨基酸残基引入中温酶异柠檬酸脱氢酶，以验证该方法的普适性^[83]。5个突变酶中有4个比野生型异柠檬酸脱氢酶具有更高的热稳定性，实验结果表明，在现代蛋白质序列中加入祖先氨基酸残基提高蛋白质的热稳定性具有广泛适用性。2006年，Watanabe等进一步探究了嗜热酶3-异丙基-苹果酸脱氢酶的非保守氨基酸位点引入祖先氨基酸残基的效果。在测试的12个突变体中，至少有6个表现出比原始酶更高的热稳定性。结果表明，祖先残基对热稳定性的影响并不取决于位点残基的保守程度，这表明这些突变蛋白的稳定性与序列保守无关，而与引入的残基的古老程度有关^[84]。后续使用该方法成功提升了多种酶的稳定性和活性，如漆酶的pH稳定性和热稳定性^[85]、甘油激酶的热稳定性^[86]、木质素过氧化物酶的热稳定性和比酶活^[87]、8-淀粉酶的热稳定性和活力^[88]、漆酶和多功能过氧化物酶的热稳定性^[89]、甘氨酰-tRNA合成酶的热稳定性和活力^[90]，人工L-苏氨酸3-脱氢酶的热稳定性和活性^[91]。

图 4 现代酶融合祖先酶氨基酸残基提高其稳定性或活性 Fig. 4 Fusion of modern enzyme with ancestral enzyme amino acid residues to improve its stability or activity.

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传统酶基因挖掘一般采用菌种筛选、功能宏基因组等技术。菌种筛选以特定催化活性为导向，筛选的成功率受通量筛选方法效率的限制，功能宏基因组方法依赖实体样品，研发周期长，成本高^[92]。ASR与其他工程方法不同，它基于对非保守功能空间的概率搜索来生成新序列，在给定准确的序列比对输入的情况下，使每个输出都具有很高的功能性。如果输入数据集有足够的变化，得到的祖先通常会与现有序列有很大差异，甚至同源性 < 30%。这使得研究人员可以发现其他方法无法获得的有益突变，包括协调的突变集。这些可以改变由蛋白质全序列状态决定的特征，包括在热或其他压力下的稳定性^[40]。因此，祖先酶作为支架为新的酶活性的进化提供了强有力的起点^[93]。表 3总结了文献报道中祖先酶较现代酶的优势特性的部分实例(表 3)。

2020年，Gomez-Fernandez等报道了祖先酶序列重构与定向进化结合的应用实例。作者重建了几个可以追溯到5亿-2.5亿年之间的真菌漆酶的祖先序列。与现代漆酶不同的是，序列重建的中生代漆酶很容易被酵母分泌，具有相似的动力学参数，更广泛的稳定性和明显的pH活性。作者进一步对祖先酶进行了定向进化，以提高其催化1, 3-环戊二酮的氧化速率^[12]，获得的P163R-V165R双突变体的氧化速率是祖先亲本的1.6倍。

祖先序列重建在分子生物学和蛋白质工程中的广泛应用一直很缓慢，部分原因是这种方法需要大量的计算专业知识。同时，ASR在一定程度上不可避免地存在不确定性，因为不可能确定哪个序列在历史上是真实存在的，而只能推断最可能的祖先序列。目前的研究表明，ASR在表型水平上得到了很大程度的验证，且重建的祖先蛋白往往表现出更好的热稳定性，低pH活力，较高的表达水平。随着序列数据量的指数增长，加上系统发育学和生物信息学的进步，尤其是具有交互界面的综合性网站的开发，已经大大减少了该方法使用所需的计算机专业知识。此外，全基因合成成本的不断降低和标准的分子生物学方法的进步也大大促进了酶祖先序列重建的应用。祖先酶的序列重建技术，在研究分子进化与酶结构与功能关系的同时，向挖掘耐高温、高活性的新酶发展是未来趋势。随着定向进化技术与半理性设计技术的发展，祖先酶的稳定性，尤其是突变稳定性成为其独特优势，可以有效避免酶定向进化中的酶活力与稳定性不能兼得的问题。此外，详细的计算构象分析支持，通过改变其构象状态的集合，祖先蛋白可能进化为新的或更优异的现代功能酶。因此笔者相信，在不远的将来，不仅现存的酶，它们序列重建的祖先酶也可以在实验室的工作台上进行定向进化，并且很快就能收获酶祖先序列重建与定向进化结合带来的研究成果。