随着人们对治疗性蛋白的需求不断提升，哺乳动物细胞的蛋白表达水平也亟待进一步提高。传统的蛋白表达方式为稳定基因表达，需要经历单克隆稳定细胞株的筛选过程，耗时耗力。由于大部分的候选重组蛋白只用于初期的研究而不能进入临床研究，因此需要更快速高效的表达方式。与传统的稳定表达方式相比，瞬时基因表达能够实现在数天内达到g/L级的产量，因而成为快速筛选高质量重组蛋白的表达方式的优选^[1]。

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary, CHO)作为最常用于表达治疗性蛋白的宿主细胞，与其他哺乳动物表达系统相比，具有如下突出优点：1)对重组蛋白进行的翻译后修饰与人类蛋白更相似；2)更安全因而更有可能获得监管机构对该细胞平台生产的新型治疗性蛋白的批准^[2]。虽然CHO细胞能够快速摄取培养基中的底物，如碳、氮源，但其对这些底物的代谢效率通常较低。并且在培养过程中会积累一些代谢中间物或代谢副产物，从而影响细胞的生长、产量以及重组蛋白的质量^[3]。为进一步提高CHO细胞的重组蛋白产量和质量，研究人员试图利用代谢工程方法改善CHO细胞的代谢。如，Fogolín等通过在CHO细胞中过表达丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase 2，PYC2)，降低了其在低温条件下乳酸的产量并提高了重组蛋白的产量^[4]。此外，Karengera等研究了在HEK293细胞中过表达PYC2对治疗性蛋白干扰素α2b质量的影响，发现由于过表达PYC2减少了代谢副产物的产生，因而能够提升干扰素α2b的质量^[5]。过表达苹果酸酶Ⅱ (Malate dehydrogenase Ⅱ，MDH2)也能够改善CHO细胞的代谢，提高胞内ATP和NADH的浓度，并提高活细胞数量^[6]。除了PYC2和MDH2，过表达丙氨酸转氨酶1 (Alanine aminotransferase Ⅰ，ALT1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(Ornithine transcarbamylase，OTC)、牛磺酸转运蛋白(Taurine transporter，TAUT)、透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)和氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ (Carbamoyl phosphate synthetase Ⅰ，CPSⅠ)等也都被报道能够改善CHO细胞的代谢^[7-12]。

LAG3 (Lymphocyte activation gene 3，CD223)为淋巴细胞激活基因，主要表达于激活型T细胞、NK细胞、B细胞以及浆细胞样DC细胞，是免疫负调节因子^[13]。LAG3的表达与特异性T细胞的免疫负调节功能相关，抑制LAG3分子功能可以增强特异性CD8⁺ T细胞的抗肿瘤作用，是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶点。ExpiCHO-S是一株商品化的悬浮细胞，能够实现瞬时表达g/L级浓度的重组蛋白，但其表达anti-hLAG3的表达量却较低，只能够达到0.1–0.2 g/L^[14]。为进一步提高anti-hLAG3的瞬时表达水平，本文通过过表达代谢相关蛋白，探究这些蛋白对ExpiCHO-S细胞生长和抗体表达的影响。此外，为了研究过表达这些代谢相关蛋白对抗体表达的影响是否在不同种细胞间存在差异，也探究了部分蛋白的过表达对H293T细胞生产抗体的影响。

1 材料与方法 1.1 菌种、细胞、载体及培养基

ExpiCHO-S细胞购于Thermo Fisher Scientific；H293T细胞为本实验室保存；LAG3-Relatlimab-IgG4由本实验室合成；pCAG-Hygro载体、pCAG- Hygro-IRES2-EGFP载体、大肠杆菌Escherichia coli DH5α由本实验室保存。ExpiCHO-S细胞培养及表达所用培养基为ExpiCHO Expression Medium，转染培养基为Opti-MEM；H293T细胞培养及表达所用培养基为含10%胎牛血清的DMEM，转染培养基为无血清DMEM，上述培养基均购于Thermo Fisher Scientific。

1.2 重组表达质粒构建

Mouse MDH2、mouse ALT1、mouse TAUT、yeast PYC2、Vitreoscilla VHb、mouse CPSⅠ和mouse OTC蛋白的基因序列为由其氨基酸序列(www.uniprot.org/)经密码子优化后由北京擎科新业生物技术有限公司合成，具体见表 1。随后由本实验室构建其表达载体，连接载体时所用到的酶切位点为NheⅠ和BamHⅠ，引物信息见表 2。为检测上述蛋白在细胞中的表达情况，在这些蛋白的基因后连接EGFP作为报告基因，之间用IRES2连接。

1.3 细胞转染

ExpiCHO-S细胞的转染：于24孔深孔板中每孔接种6×10⁶ cells/mL的ExpiCHO-S细胞2.5 mL。取1.5 mL无菌离心管，加入192 μL Gibco OptiPRO SFM，然后加入2 μg质粒DNA，轻柔混匀后加8 μL ExpiFectamine CHO Reagent，再次轻柔混匀，立即加入准备好的细胞悬液中。LAG3-Relatlimab- IgG4质粒(轻重链比例为1︰1)占质粒总质量的80%。将细胞置于37 ℃、8% CO₂、200 r/min的恒温振荡培养箱中培养。在转染后18–22 h内加入15 μL增强剂和600 μL补料。

H293T细胞的转染：在转染前一天于6孔板中每孔接种1×10⁶ cells/mL的H293T细胞1 mL。转染当天，取1.5 mL无菌离心管，加入190 μL无血清DMEM，再加入2.5 μg质粒DNA，轻柔混匀后加7.5 μL 1 mg/mL的聚乙烯亚胺，再次轻柔混匀，静置15 min后将DNA复合物加入前一天准备的细胞中，将细胞置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中静置培养，24 h后吸弃上清液并加入新鲜的含10% FBS的DMEM。

1.4 流式细胞仪检测代谢相关酶在ExpiCHO-S细胞中的表达

取30 μL转染后第3天的细胞悬液，300×g离心5 min后弃上清，用无菌PBS洗涤2次，再用50 μL PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测EGFP的表达情况。阴性对照细胞为转染了空载体和anti-hLAG3轻重链的ExpiCHO-S细胞。

1.5 细胞密度及活率的检测

H293T细胞在计数前吸弃上清，加入10 mL无菌PBS轻柔洗涤，再加入2 mL胰酶消化1 min，最后加入5 mL含10% FBS的DMEM，用移液管轻柔吹打，混匀，取20 μL细胞悬液，加入20 μL 0.1%台盼蓝，混匀，用细胞计数仪计数。ExpiCHO-S细胞直接吸取20 μL细胞悬液，加入20 μL 0.1%台盼蓝，混匀，计数。

1.6 抗体浓度及亲和力检测

用Biacore 8K分析细胞上清中anti-hLAG3的浓度，检测芯片为Series S Sensor Chip Protein-A，缓冲液为pH 7.4的HBS-EP+溶液，再生液为pH 2.0的甘氨酸溶液。

Anti-hLAG3与hLAG3间的亲和力测定同样采用Biacore 8K。使用Protein A芯片在流速为10 μL/min条件下，捕获上清中的anti-hLAG3，并与25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25和0 nmol/L浓度的hLAG3蛋白进行动力学检测，流速为30 μL/min，结合和解离时间分别为180 s和600 s。数据的拟合分析使用Biacore 8K Insight Evaluation Software软件。得到结合常数K_a和解离常数K_d，最后通过计算得到平衡解离常数K_D=K_d/K_a。

2 结果与分析 2.1 过表达代谢相关酶对ExpiCHO-S细胞活率和密度的影响

如图 1A所示，在对照组和实验组中，转染后细胞活率均逐渐降低，由转染前的98.57%下降到第3天时的84.06%–97.82%。随后细胞活率逐渐恢复，到第7天可能由于营养物质缺乏，细胞开始衰亡。由图中可以看出，过表达OTC、MDH2、ALT1、TAUT、PYC2和CPSI对ExpiCHO-S细胞活率的影响均较小，而过表达VHb则会明显降低细胞活率。除了可能会影响细胞活率外，过表达代谢相关酶也可能会对细胞密度产生影响。如图 1B所示，ExpiCHO-S细胞密度在转染后的第1天增长较快，随后增长速度减慢，并在第3天后维持相对稳定。在第3天时，对照组(仅过表达EGFP)的细胞密度为1.73×10⁷ cells/mL，过表达ALT1能够轻微提高ExpiCHO-S的细胞密度(2.00×10⁷ cells/mL)，过表达OTC、MDH2、PYC2、TAUT和CPSI对ExpiCHO-S的细胞密度基本无影响，而过表达VHb则同样会明显降低ExpiCHO-S的细胞密度。总的来说，过表达ALT1能够提高ExpiCHO-S的活细胞密度，而过表达VHb能够降低ExpiCHO-S的细胞活率和细胞密度。过表达OTC、MDH2、TAUT、PYC2和CPSI对ExpiCHO-S细胞的活率和密度影响均较小。

2.2 过表达代谢相关酶对ExpiCHO-S抗体产量的影响

首先分析了上述7种蛋白表达质粒在ExpiCHO-S细胞中的转染情况。如图 2A所示，转染后第3天，这些基因在细胞中的转染效率为16.2%–45.8%，随着培养时间延长，转染效率逐渐降低(图 2B)。其中，OTC、MDH2和VHb三种蛋白表达质粒在ExpiCHO-S细胞中的转染效率最高，在第3天时的转染效率分别为44.5%、45.1%和45.8%，到培养的第7天时，转染效率分别逐渐降低到39.4%、39.6%和39%。其次为CPSⅠ和ALT1表达质粒，其转染效率在第3天时分别为41.6%和36.2%，随着培养时间延长，两种质粒的转染效率分别降低到第7天的34.2%和28.1%。TAUT和PYC2表达质粒在ExpiCHO-S细胞中的转染效率均较低，第3天时的转染效率只有20.3%和16.2%，到第7天时，转染效率更降低到16.4%和12.4%。

进一步分析过表达上述7种蛋白对ExpiCHO-S细胞抗体分泌的影响发现，上述7种蛋白均能不同程度提高细胞的抗体产量(提高10%–29.2%)。如图 2C，两个对照组(null和EGFP)的抗体滴度相差较小，其中过表达EGFP后ExpiCHO-S细胞的抗体滴度由第3天的21.58 μg/mL增加到第9天的79.55 μg/mL。具体的，过表达OTC、CPSⅠ、MDH2和PYC2分别能够使抗体产量提高29.2%、27.6%、24.1%和20.3%。有趣的是，在第5天时，相比于对照(43.33 μg/mL)，过表达OTC和MDH2能够使抗体滴度分别提高70.7%和65.1%。由于对照组和处理组的抗体滴度在第3天时差异不大，因此表明过表达OTC和MDH2能够提高ExpiCHO-S培养前期的抗体生产速率。有趣的是，过表达OTC和MDH2后ExpiCHO-S在第5天时的抗体滴度(73.98 μg/mL和71.56 μg/mL)与对照组在第9天时的抗体滴度(79.55 μg/mL)相近，表明过表达OTC和MDH2能够使培养时间缩短4 d。另一方面，虽然过表达CPSⅠ没有明显提高ExpiCHO-S细胞培养前期的抗体生产速率，但在整个培养过程中抗体的生产速率基本保持不变，在细胞培养的中后期没有出现明显降低。除上述两种蛋白，过表达ALT1也能够明显提高ExpiCHO-S细胞在第5天时的抗体滴度，由对照组的43.33 μg/mL提高到66.86 μg/mL。然而，随着培养时间延长，抗体生产速度明显降低，到第9天时的抗体滴度为91.39 μg/mL，相比于对照仅提高了14.9%。过表达TAUT和VHb也能够轻微提高ExpiCHO-S细胞的抗体产量，相比于对照分别提高10%和13.7%。由此可见，过表达不同蛋白对ExpiCHO-S细胞的抗体生产速率的影响不同。

综上，上述7种代谢相关酶表达质粒在ExpiCHO-S细胞中的转染效率高低顺序为MDH2 > VHb > OTC > CPSⅠ > ALT1 > TAUT > PYC2，对细胞抗体产量的影响强弱顺序为OTC > CPSⅠ > MDH2 > PYC2 > ALT1 > VHb > TAUT。由此可以看出，对于7种不同蛋白，其表达质粒在ExpiCHO-S细胞中的转染效率与其对细胞抗体产量的影响没有很强的相关性。

2.3 过表达OTC和MDH2对ExpiCHO-S表达抗体亲和力的影响

除了会影响抗体的产量外，在ExpiCHO-S细胞中过表达代谢相关蛋白也可能会对抗体的质量产生影响。如表 3所示，过表达OTC和MDH2后，ExpiCHO-S细胞表达的anti-hLAG3对抗原的亲和力K_D与对照药与抗原的亲和力间的差异极小，表明过表达OTC和MDH2对ExpiCHO-S细胞产抗体的亲和力基本无影响。

2.4 过表达MDH2和ALT1对H293T细胞抗体产量的影响

为了验证代谢相关蛋白对其他类型哺乳动物细胞抗体分泌的影响，选用另一种细胞H293T细胞，研究这些蛋白对其抗体分泌的影响。所选蛋白为MDH2和ALT1，表达的抗体同上。转染后第3天测定培养上清中的抗体含量并消化细胞测定细胞密度和活率，结果如表 4所示。与对照相比，过表达MDH2和ALT1能够轻微提高H293T细胞的细胞活率和密度，并且抗体产量相比于对照(21.22 μg/mL)分别提高80.4%和11.1%，表明过表达MDH2和ALT1同样能够提高H293T细胞的抗体产量。

3 讨论

在哺乳动物细胞培养过程中通常会产生副产物乳酸，乳酸会抑制细胞生长和重组蛋白的表达^{[3, 15]}。Fogolín等在表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的CHO细胞中过表达PYC2，发现其能够降低细胞的生长速度同时减少65%的乳酸产生并最终使重组蛋白的产量提高2倍^[4]。本研究中，在ExpiCHO-S细胞中过表达PYC2虽然对细胞生长的影响不大，但也能够提高细胞的抗体产量，由于PYC2能够连接糖酵解与三羧酸循环，推测PYC2的过表达能够提高葡萄糖的代谢效率，降低副产物如乳酸等的产生^[16]。除PYC2外，过表达VHb也被证明能够降低乳酸产生。Juárez等研究了在CHO-K1细胞中过表达VHb对细胞代谢和生长的影响，发现过表达VHb可以提高细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的比生长速率并降低单个细胞的乳酸产量。用荧光显微镜观察发现VHb分布在胞质和细胞器上，推测其能够充当氧运载体，促进有氧代谢^[9]。在本研究中，虽然过表达VHb会轻微降低细胞的活率和密度，但其能轻微提高ExpiCHO-S的抗体产量。推测可能是由于CHO-K1为贴壁细胞，培养过程为静态，而ExpiCHO-S为悬浮细胞，培养过程为振荡培养，两种细胞的溶氧不同，VHb可能通过其他方式影响细胞的抗体产量，但具体原因还有待进一步研究。

除乳酸外，在细胞培养过程中通常也会积累副产物氨，降低重组蛋白的产量和质量^[17]。Kim等通过同时过表达尿素循环中的前两个酶CPSⅠ和OTC，减少了培养液中氨的积累，因而增加了细胞的生长速度，并提高了EPO的产量和质量^[8]。此外，Tabuchi等在CHO细胞中过表达牛磺酸转运蛋白(Taurine transporter，TAUT)，发现其能够通过促进谷氨酰胺的消耗提高CHO细胞单克隆抗体的滴度，并减少副产物乳酸和氨的生成^[12]。随后该研究团队进一步在过表达TAUT的CHO细胞中共过表达ALT1，发现过表达ALT1后细胞产生的副产物丙氨酸能够被转化为丙酮酸和谷氨酸，后两者再进入TCA循环，因而能够促进细胞的生长和抗体的产生^[7]。在本研究中，分别过表达OTC和CPSⅠ对ExpiCHO-S细胞生长的影响均不大，但能够使抗体产量分别提高29.2%和27.6%。由于这两种酶是尿素循环中的前两个酶，因而其过表达可能能够加快氨的代谢，减少氨的积累。同样，分别过表达TAUT和ALT1也能够轻微提高ExpiCHO-S细胞的抗体产量，相比于对照分别提高10%和13.7%，推测是由于TAUT能够促进细胞对氨基酸以及代谢物质的吸收利用，而ALT1也能够催化丙氨酸的转化，因而优化了细胞的代谢过程，降低培养液中氨的积累。

除常见的代谢副产物乳酸和氨外，Chong等用代谢组学分析CHO细胞的胞外代谢物发现苹果酸盐聚集严重，进一步研究发现是由于细胞将培养基中的天冬氨酸转化为苹果酸盐，但由于细胞中MDH2的不足，导致苹果酸盐积累^[6]。在线粒体中，MDH2转化苹果酸盐为草酰乙酸，从而为细胞提供能量和还原力。在细胞中过表达MDH2能有效降低苹果酸盐的积累，提高细胞中ATP和NADH的水平，并使活细胞密度增加。有趣的是，在本研究中，虽然过表达MDH2对ExpiCHO-S细胞密度和活率的影响不大，但能够明显提高ExpiCHO-S细胞的抗体产量。此外，在H293T细胞中过表达MDH2能够轻微促进该细胞的生长，同时也能大幅提高anti-hLAG3的产量。因此推测MDH2的过表达同样能够促进ExpiCHO-S和H293T细胞中苹果酸盐的聚集，具体原因还有待进一步试验验证。

本文首次较系统地探讨了细胞代谢相关蛋白对瞬时表达细胞ExpiCHO-S的细胞生长、抗体滴度和抗体质量的影响。过表达OTC、CPSI、MDH2、PYC2、ALT1、VHb和TAUT均能不同程度提高细胞的抗体滴度。此外，过表达两种或以上蛋白组合有望进一步提高CHO细胞的重组蛋白生产能力。本研究表明可以利用细胞工程提高瞬时表达系统的重组蛋白生产能力。