犬瘟热(Canie distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canie distemper virus，CDV)感染犬、水貂等多种肉食动物而引起的一种高度接触性传染病^[1]。该病传染性高、发病率高、临床症状多样，感染后期容易形成继发和混合感染^[2-3]。近年来，犬瘟热病毒自然感染宿主不断扩大^[4]。据报道，野生动物老虎、狮子、豹和海豹，甚至大熊猫群体中都暴发过犬瘟热。2015年1月，我国陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心圈养的5只大熊猫因感染CDV强毒而死亡，Feng等在实验室对组织病料进行了CDV分离鉴定，证实此毒株属于AisaⅠ型强毒株，命名为giant panda/SX/2014^[5]。2015年，广东省的动物园发生了2起独立的犬瘟热疫情，西伯利亚虎和小熊猫因感染犬瘟热病毒而死亡^[6]。实际上，我国和日本学者都曾报道，CDV能够自然感染非人灵长类动物，如我国猕猴和日本食蟹猴^[7-8]。而且，在人变形性骨炎Paget’s患者体内检测到CDV核酸^[9]。可见，犬瘟热病毒正在给全球动物养殖业和生物多样化带来极大的损失和危害。同时，随着我国经济的快速发展，人们对犬猫等宠物的拥有量逐年增多，犬瘟热引起的社会公共危害越来越受到人们重视。因此，犬瘟热预防和治疗迫在眉睫。目前世界范围内，犬瘟热的预防一直依靠弱毒活疫苗。但是，犬瘟热病毒的感染和传播依然不容乐观^[10]。近几年数据显示，虽然许多动物接种弱毒活疫苗，但仍然存在免疫后犬瘟热发病的案例^[11-12]。反向遗传技术是新兴的一种定向修饰或改造病毒的重要技术，应用前景非常广阔^[4-13]。近十几年，国内外许多学者利用反向遗传学技术拯救出多株犬瘟热病毒。2000年Uta Gassen等首次利用痘病毒提供T7 RNA聚合酶，从位于T7启动子下游的Onderstepoort株全长cDNA拯救获得感染性病毒^[14]。2001年Parks等拯救出高效表达荧光素酶的重组Onderstepoort株^[15]。2004年Plattet等建立了CDV野毒A75/17 Vero细胞适应株A75/17-V的感染性克隆，在基因组3′端插入EGFP基因，重组病毒能在细胞上持续性表达EGFP^[16]。2007年Fujita等在日本CDV野毒Yanaka株骨架上插入EGFP，获得表达EGFP的重组犬瘟热病毒^[17]。2012年Wang等构建了弱毒疫苗株CDV/R-20/8感染性克隆，获得了表达狂犬病病毒G蛋白的重组犬瘟热病毒，在小鼠和犬体内，能诱发针对两种病原的高水平抗体^[18]。2015年Li等将狂犬病毒Flury-FEP株G基因插入到犬瘟热病毒基因组，重组病毒rCDV-RV-G免疫小鼠和犬，机体内均能产生抗CDV和RV的中和抗体^[19]。本研究以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗毒CDV-3株为病毒模型，构建了高效的CDV-3株病毒拯救系统，为毛皮动物CDV活载体基因工程疫苗的开发提供平台。

犬瘟热病毒CDV-3株由中国农业科学院特产研究所动物疫病研究室保存；293T和Vero细胞由中国农业科学院特产研究所动物疫病研究室保存。

培养液DMEM、青链霉素和小牛血清FBS，均购自Gibco公司；真核表达载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司；克隆载体pEASY-Blunt或pEASY-Simple-Blunt、高保真酶TransStart FastPfu DNA聚合酶和FITC标记的羊抗鼠二抗购自北京全式金生物技术有限公司；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自Thermo公司；转染试剂Lipofectamine^TM 2000和反转录试剂盒SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix购自Invitrogen公司；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，购自AXYGEN公司；RNeasy Mini Kit和EndoFree Plasmid Maxi Kit购自QIAGEN公司；抗体CDV-NP购自Veterinary Medical Research and Development公司。

取冻存的犬瘟热病毒CDV-3株细胞培养悬液200 µL，根据RNeasy Mini Kit操作说明，提取总RNA。用SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix试剂盒反转录合成cDNA。根据GenBank已公布的CDV-3株参考序列，用软件Primer Premier 5.0设计了13对特异性引物(表 1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用TransStart FastPfu DNA聚合酶试剂盒进行PCR扩增，对目的片段进行回收纯化，连接至pEASY-Blunt载体，转化至Trans-T1感受态，涂菌至含有氨苄抗性的平板，筛选3个以上的阳性克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

利用软件DNAMAN分析1.2.1中所获得的CDV-3株全基因组序列的单一性酶切位点，选取适当的位置作为衔接点。利用Primer Premier 5.0设计特异性引物(表 2)，为了便于拼接，引物两端携带相应的酶切位点。用1.2.1中合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物依次命名为：F1、F2、F3、F4和F5。其中，引物F1F的5′端加入了SpeⅠ酶切位点(斜体)和锤头状核酶序列(黑体)。引物F5R的5′端加入了部分丁型肝炎核酶序列(黑体)。之后，改造载体pcDNA3.1的多克隆位点，用内切酶PmeⅠ酶切pcDNA3.1，连接入事先制备的双链DNA (上游引物：5′-GGC CGCATTTCGTACGAATTTTGTACATTTCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG-3′；下游引物：5′-CGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGAC GTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGAAATGTACAAAATTCGTACGAAATGC-3′)，最终pcDNA3.1的多克隆位点变为NheⅠ-NotⅠ- BsiwⅠ-Bsp1407Ⅰ-CpoⅠ-部分丁型肝炎核酶序列，改造后的pcDNA3.1称为pcDNA3.2。将F1连接至pEASY-Blunt，获得pEASY-Blunt-F1，SpeⅠ和NotⅠ双酶切pEASY- Blunt-F1，回收纯化F1片段；NheⅠ和NotⅠ双酶切pcDNA3.2，回收纯化载体片段；SpeⅠ和NheⅠ属于同尾酶，T4 DNA连接酶连接F1片段和pcDNA3.2载体片段，获得pcDNA3.2-F1。将F2和F3分别连接到克隆载体pEASY-Blunt Simple或pEASY-Blunt上获得pEASY-Blunt-F3和pEASY-Blunt-F2。用NotⅠ和NdeⅠ分别双酶切pEASY-Blunt-F3和pEASY- Blunt-F2，回收纯化F2片段和F3载体部分，T4 DNA连接酶连接，获得pBlunt-F2-F3。将F4和F5片段分别连接到克隆载体pEASY-Blunt上，获得pEASY-Blunt-F4和pEASY-Blunt-F5。NotⅠ和Bsp1407Ⅰ分别双酶切pEASY-Blunt-F4和pEASY- Blunt-F5，回收纯化F4片段和F5载体片段，T4DNA连接酶连接，获得pBlunt-F4-F5。用BsiwⅠ和CpoⅠ双酶切pBlunt-F4-F5和pcDNA3.2-F1，回收纯化F4-F5片段部分和pcDNA3.2-F1载体部分，连接酶连接获得pcDNA3.2-F1-F4-F5。PmeⅠ和BsiwⅠ双酶切pcDNA3.2-F1-F4-F5和pBlunt-F2-F3，回收纯化F2-F3片段和pcDNA3.2- F1-F4-F5载体部分，T4 DNA连接酶连接，获得CDV-3全基因组重组质粒pcDNA3.2-CDV-3。最后用PmeⅠ和Bsp1407Ⅰ双酶切鉴定全长重组质粒，筛选出正确的重组子pcDNA3.2-CDV-3 (图 1)。按照EndoFree Plasmid Maxi Kit的操作说明，大量提取全长重组质粒pcDNA3.2-CDV-3，测定浓度后分装，于−70 ℃保存待用。

图 1 CDV-3株全长cDNA克隆构建策略 Fig. 1 Construction strategy of CDV-3 full-length cDNA clone.

图选项

针对CDV-3株N、P和L基因的开放阅读框区域，利用Primer Premier 5.0设计特异性引物(表 2)，用1.2.1中合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物N、P和L。回收纯化片段N、P和L，分别连接至pEASY-Blunt-Simple上，获得pEASY-Blunt-Simple-N、pEASY-Blunt- Simple-P和pEASY-Blunt-Simple-L。KpnⅠ和NotⅠ双酶切pEASY-Blunt-Simple-N和pEASY-Blunt- Simple-L，AflⅡ和NotⅠ双酶切pEASY-Blunt- Simple-P，同时用相同内切酶组合双切载体pcDNA3.1。回收纯化N、P、L片段和pcDNA3.1载体片段，T4 DNA连接酶连接。筛选出正确的重组子pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L。按照EndoFree Plasmid Maxi Kit的操作说明，大量提取辅助质粒pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L，测定浓度后分装，于−70 ℃保存待用。

转染前24 h，于6孔板中接种2×10⁵个293T细胞/孔，第2天细胞生长密度至80%以上，开始转染，每个质粒用量为：全长质粒pcDNA3.2- CDV-3 5 µg，辅助质粒pcDNA3.1-N 1 µg，pcDNA3.1-P 0.8 µg和pcDNA3.1-L 0.5 µg，转染试剂22 µL。按照Lipofectamine^TM 2000说明书进行操作。共转染3 h，更换为含10% FBS的DMEM细胞培养液，37 ℃、5% CO₂条件下培养72 h。刮取细胞悬液，取300 µL至单层Vero细胞，观察细胞病变。出现犬瘟热病毒典型的合胞体样细胞病变时，反复冻融收获病毒液。

将收获的rCDV-3病毒液接种至Vero细胞，培养72 h。用4%多聚甲醛固定细胞，0.5% Triton X-100通透细胞，一抗CDV-NP作用1 h，加入FITC标记抗羊抗鼠IgG荧光二抗染色。最后，DAPI染核，在荧光显微镜下观察绿色荧光。分别提取wtCDV-3和rCDV-3的总RNA，反转录合成病毒基因组cDNA。根据P-M处设计引物(JD-F：5′-TGGTATTACTCTGGGCTCA-3′和JD-R：5′-CTT TGAACATGCTCAAATTA-3′)，以各自的cDNA为模板，进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳后回收片段，用PmeⅠ酶切。rCDV-3由于基因组中被人为引入PmeⅠ位点，因此可以被切割开；而wtCDV-3序列中并无PmeⅠ位点，无法被切割。分别取病毒wtCDV-3和rCDV-3上清液100 µL，磷钨酸负染，电子显微镜观察和比较两种病毒粒子的形态大小。

将rCDV-3在Vero细胞上传代10次，取每一代病毒液300 µL，测定TCID₅₀。在Vero细胞上分别按感染复数(MOI=0.1)接种wtCDV-3和rCDV-3，35 ℃、5% CO₂培养5 d。于感染后12、24、48、72、96、120 h，分别取病毒液上清和细胞，测定上清和细胞中病毒的TCID₅₀。以上试验至少重复3次。

覆盖CDV-3株全基因组的13个目的片段，用RT-PCR方法扩增后，经1%琼脂糖凝胶电泳，可以看到13个目的条带的大小跟预期结果一致(图 2A)。拼接获得了本实验所用CDV-3全基因组序列，与GenBank CDV-3 (登录号：EU726268.1)的序列比对发现：全基因组共5个碱基不同，分别引起P蛋白1个、H蛋白2个和L蛋白2个氨基酸发生改变。

图 2 犬瘟热病毒CDV-3株全长重组cDNA和辅助质粒的鉴定 Fig. 2 Identification of full-length recombinant cDNA and helper plasmids of CDV-3 canine distemper virus. (A) The results of CDV-3 strain whole genome amplification; 1–13: amplification result of 13 fragments covering the whole genome of CDV-3 strain, M: trans 4K DNA marker. (B) CDV-3 strain segmented amplification results; 1–5: amplification results of 5 long fragments from CDV-3 strain, M: DL DNA 15 000 marker. (C) pcDNA3.2-CDV-3 identification results; 1: recombinant plasmid pcDNA3.2-CDV-3, 2: PmeⅠ and Bsp1407Ⅰ double digestions identification results of pcDNA3.2-CDV-3, M: DNA 15 000 marker. (D) Identification result of the helper plasmids; N: KpnⅠ and NotⅠ double digestion of pcDNA3.1-N, P: AflⅡ and NotⅠ double digestion of pcDNA3.1-P, L: KpnⅠand NotⅠdouble digestion of pcDNA3.1-L, M: DNA 15 000 marker.

图选项

CDV-3株全长分5段PCR克隆，获得5个片段，大小依次为：3 400 bp、2 500 bp、4 300 bp、3 100 bp和2 500 bp，与预期大小一致(图 2B)。质粒pcDNA3.2-CDV-3经PmeⅠ和Bsp1407Ⅰ双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，得到大小约9 900 bp和12 000 bp的目的条带(图 2C)，与预期结果一致。

辅助质粒pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L分别用构建时各自上下游引物添加的单一性限制内切酶进行双酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，分别得到约1 700 bp、1 600 bp、6 500 bp和5 400 bp目的条带，与预期结果一致(图 2D)。

4个质粒共转染后，接种到Vero细胞，观察到典型的合胞体细胞病变(图 3A)，同时空白对照组Vero无病变(图 3B)。为了进一步确定，用免疫荧光鉴定，可以看到发生病变的细胞能特异性与CDV-NP抗体结合，呈阳性信号(图 3C)，空白对照组为阴性(图 3D)。为区别wtCDV-3污染，利用特异性鉴定引物JD-F/R PCR扩增，纯化后的扩增产物用预先添加的PmeⅠ酶切，可以看到rCDV-3能被切割开，而wtCDV-3不能被切开(图 3E)。电镜下观察rCDV-3，可以看到直径约为200 nm、有囊膜的犬瘟热病毒粒子(图 3F)。

图 3 重组病毒rCDV-3的鉴定 Fig. 3 Identification of recombinant virus rCDV-3. (A) rCDV-3 cell pathology (×100). (B) Negative Vero cells (×100). (C) rCDV-3 immunofluorescence (×100). (D) Negative Vero cells immunofluorescence (×100). (E) PmeⅠ label identification of rCDV-3; 1, 3: RT-PCR amplification results of the P-M region of rCDV-3 and wtCDV-3, 2, 4: PmeⅠ digested products from lane 1 and 3, M: DL DNA2 000 marker. (F) Electron microscopic appearance of rCDV-3.

图选项

将重组病毒rCDV-3连续传代培养，分别测定每代病毒悬液的TCID₅₀ (图 4A)。重组病毒rCDV-3传代稳定后，按MOI=0.1接种Vero细胞，于不同时间点收集上清和细胞，测定TCID₅₀，绘制出生长曲线。同样绘制wtCDV-3的生长曲线，并进行比较(图 4B)。

图 4 rCDV-3的生长特性 Fig. 4 Growth characteristics of rCDV-3. (A) The passage stability of rCDV-3. (B) The growth curves of wtCDV-3 and rCDV-3.

图选项

反向遗传技术是深入研究RNA病毒结构与功能关系、感染与免疫机制、开发新型疫苗的有力手段。近年来，犬瘟热病毒自然感染宿主不断扩大，流行毒株不断变异，毒力也有增强^[20]。这不仅对宠物犬猫饲养、毛皮动物养殖造成了巨大经济损失，而且还严重威胁了人类公共卫生安全。因此，建立犬瘟热病毒疫苗毒CDV-3株的反向遗传操作平台，有利于我们针对流行变异毒株，精准研发安全高效的新型疫苗，从而防控犬瘟热的流行。目前，国内外已经成功构建了多株犬麻疹病毒的反向遗传系统，包括疫苗株Onderstpoort、CDV/R-20/8和CDV-L株、强毒株A75/17和5804P等。随着生命科学的飞速发展，副粘病毒的反向遗传系统，从全长cDNA的克隆，构建到病毒拯救方法，都发生了许多改进。克隆策略从单一的酶切连接改进到快速高效的同源重组。病毒拯救，最初利用复制缺陷型痘病毒载体提供T7 RNA聚合酶，之后，建立了稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系用于提高病毒拯救效率。犬瘟热病毒虽然能广泛地感染多种动物的多种细胞，但是在体外，最适合犬瘟热病毒增殖的细胞是Vero细胞。由于Vero细胞的拯救效率较低，因此病毒拯救时，需要先利用高效表达的293T、BHK等细胞进行转染，然后再用Vero细胞进行重组病毒的增殖。这也增加了犬瘟热病毒的拯救难度。此外，学者们通过不同原理的转染试剂、优化转染试剂与质粒比例等条件来提高病毒的拯救效率。目前并没有犬瘟热病毒CDV-3株反向遗传系统的建立。

本研究利用酶切连接策略，以pcDNA3.1(+)为骨架，构建了犬瘟热病毒CDV-3株的全长cDNA重组质粒。利用脂质体转染试剂，各个质粒比例为全长5 µg、N 1 µg、P 0.8 µg和L 0.5 µg，共转染293T细胞，转染试剂与质粒比例为3︰1，建立了犬瘟热病毒CDV-3株反向遗传操作平台。重组病毒rCDV-3按MOI=0.1，接种单层Vero细胞时，生长速度显著快于wtCDV-3的。rCDV-3感染细胞3 d内，能使Vero细胞病变率达到95%，而wtCDV-3则需要4–5 d才能达到相同的病变率。此外，两种病毒的生长曲线也证明了这一点，rCDV-3在感染后36 h，上清和细胞相关病毒滴度均达到最高值，而wtCDV-3在感染后72 h，达到峰值(图 4B)，wtCDV-3病毒增殖速度平缓。rCDV-3连续传代时，最大病毒滴度能较为稳定地达到10^7.667 TCID₅₀/mL (图 4A)，wtCDV-3的病毒滴度一般稳定在10^6.667 TCID₅₀/mL。多次重复测定，结果证明，两种病毒的最高滴度存在显著性差异P < 0.05 (数据未呈现)。rCDV-3的电镜形态呈现球形，属于犬瘟热病毒的经典形态。rCDV-3增殖较快的分子机制尚不清楚，因此，后续我们将探索重组病毒rCDV-3增殖速度快、滴度高的分子机制。

本研究成功通过优化病毒拯救系统，成功建立犬瘟热病毒疫苗株CDV-3株反向遗传平台。研究结果表明，通过该平台拯救获得的重组病毒rCDV-3具有增殖快、滴度高的特点。