2020, Vol. 36中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 徐碧林, 朱庆, 陈岩岩, 郑永良
- Xu Bilin, Zhu Qing, Chen Yanyan, Zheng Yongliang
- 利用优化的反向PCR策略高效构建多位点突变体
- Optimized inverse PCR strategy for constructing multilocus mutants efficiently
- 生物工程学报, 2020, 36(4): 801-809
- Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(4): 801-809
- 10.13345/j.cjb.190311
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文章历史
- Received: July 13, 2019
- Accepted: September 16, 2019
- Published: October 10, 2019
引用本文
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2. 武汉市疾病预防与控制中心，湖北 武汉 430015
2. Wuhan Center for Disease Control and Prevention, Wuhan 430015, Hubei, China
构建突变体是设计生物医学/生物技术具有预期性能的新物质[1]和研究蛋白质结构与功能的主要策略之一，例如，研究酶的稳定性和活性[2-3]蛋白质相互作用[4]、蛋白质修饰位点的确定[5-8]、蛋白质和DNA相互作用[9]以及酶的加工成熟方式[10]等。目前常用的引入突变的方法大体可分为两类：以常规PCR[11]、重叠PCR[12-15]、大引物PCR[16-18]和反向PCR[19]为主的重组PCR技术[20]以及Stratagene公司基于反向PCR原理开发的点突变试剂(QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis System (QCM))[21]。其中重组PCR方法能构建点突变、插入和缺失等多种突变体，但是具体操作起来比较繁琐、耗时较长，而且多步操作还会降低克隆的阳性率：尤其是重叠PCR和大引物PCR，第一轮PCR结束后必须进行胶回收得目的片段用于第二轮PCR，另外第二轮PCR结束后需要再回收、酶切、与酶切后的载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，挑克隆进行PCR和酶切鉴定。QCM利用突变引物进行一轮反向PCR扩增全长质粒，用限制性内切酶DpnⅠ酶切除去甲基化和半甲基化的模板后，再进行转化就可以在24 h内得到阳性率高达70%–90%的转化子。然而，经过验证发现，该方法可以高效构建3个及以下相邻氨基酸残基突变的突变体，较难构建4个及以上相邻氨基酸残基突变的突变体。为此，基于反向PCR原理，本研究设计了一个可高效、快捷地构建多位点突变体的方法。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种与质粒菌种Escherichia coli DH5α和质粒pET26b、pUC18- Lip-SBRN2均保存于黄冈师范学院经济林种质资源改良与综合利用湖北省重点实验室。
1.1.2 主要试剂酵母提取物(Yeast extract)和蛋白胨(Tryptone)购自英国OXOID公司，琼脂粉购于BioSharp公司。氯化钠(NaCl)和卡那霉素购自上海申试化工。FastPfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech.)。限制性内切酶DpnⅠ购于赛默飞世尔(Thermo scientific)。λ-HindⅢ digest DNA Marker购于TaKaRa公司。Cycle-pure PCR产物回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自美国Omega Bio-tek公司。琼脂糖：分析纯，购自西班牙Biowest公司。
1.2 方法 1.2.1 重组质粒pET26b-Lip-SBRN2的构建以包含编码嗜热脂肪酶Lip-SBRN2基因的质粒pUC18-Lip-SBRN2为模板，上游引物pET26b-Lip-SBRN2-F：5′-ATTAATTCGGATCCGATGCTGTCTGTTGTG-3′，下游引物pET26b-Lip- SBRN2-R：5′-GTGGTGGTGCTCGAGTTATTTCCCGCT-3′ (下划线标明的序列为酶切位点，正向引物的酶切位点为BamHⅠ，反向引物的酶切位点为XhoⅠ)。总体积50 μL反应体系含有20 ng模板质粒、各10 pmol上下游引物、10 nmol/L dNTPs、2.5 U FastPfu DNA聚合酶、10 μL 5×FastPfu缓冲液和10 μL 5×PCR刺激剂。按照反应程序(95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸30 s，从变性到延伸共30个循环，72 ℃保温5 min后12 ℃保温)进行PCR反应扩增得到Lip-SBRN2基因片段。用BamHⅠ和XhoⅠ酶切大肠杆菌表达载体pET26b及回收的PCR产物，酶切产物回收后连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，随机挑取3个转化子于5 mL LB液体培养基37 ℃培养12 h后，提质粒酶切检测，挑取酶切正确的质粒利用T7通用引物进行测序鉴定。
1.2.2 多位点突变体ZQ1~ZQ7引物设计为探究嗜热脂肪酶Lip-SBRN2 (GenBank: EF584562.1)的温度适应机制，将其成熟酶区与高度同源的嗜温脂肪酶Lip A (UniProtKB: P37957)非保守氨基酸残基替换为Lip A对应位点的氨基酸残基，突变策略如图 1所示，其中ZQ1–ZQ7为本研究重点阐述的突变体，它们包含的突变位点如表 1所示。结合优化的反向PCR策略，遵循以下原则设计引物：1)如图 2A所示，每构建一个多位点突变体需要设计4条引物：两条长引物(Ⅱ/Ⅲ)和两条短引物(Ⅰ/Ⅳ)，其中长引物包含突变位点，短引物不包含突变位点，长短引物分别与质粒模板的两条链互补，二者5′端可以交错重叠也可不重叠(图 2B和2C)；2)根据突变氨基酸残基数目的差异，包含突变位点的长引物3′端延伸区最少需要包含与突变的氨基酸残基数目相匹配的且与模板完全互补的碱基；3)引物的3′端应包含至少一个G或C碱基，尽量避免3个以上的重复碱基，以免错配；4)两条引物GC含量最好都控制在80%以内；5)同一组反向PCR内，两条引物(如Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ)退火温度差≤40 ℃；6)短引物一般长约15–18 bp，如果需要突变的氨基酸残基较多，可根据长短引物退火温度差≤40 ℃来调节短引物的长度；7)使用经过PAGE或HPLC纯化的引物，否则会降低突变阳性率。
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| 图 1 Lip-SBRN2 (GenBank: EF584562)和Lip A (UniProtKB: P37957)成熟酶氨基酸序列比对 Fig. 1 Amino acid sequence alignment of the mature of Lip-SBRN2 (GenBank: EF584562) and Lip A (UniProtKB: P37957). Sequence alignment was performed by ESPript 3.0 software. The black shadows represent conserved amino acid residues, unshadowed represents non-conserved amino acid residues. The underlined sequences represent the non-conserved amino acid residues substituted from Lip A into Lip-SBRN2, ZQ1–ZQ7 represent the multi-locus mutants to be constructed in this study. |
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| Mutants | Mutated sites | Number of mutated amino acids |
| ZQ1 | T32S/S33R/S34D/E35K | 4 |
| ZQ2 | E57R/Y58F/I59V/K60Q/R61K | 5 |
| ZQ3 | P114L/Q115P/N116G/D117T/K118D/I119P/S120N/Y121Q/T122K/S123I/I124L | 11 |
| ZQ4 | S126T/T127S/S128I/D129Y/Y130S/I131S/V132A/L133D/N134M/S135I | 10 |
| ZQ5 | L136V/S137M/K138N/L139Y/D140L/G141S/A142R/N143L/N144D | 9 |
| ZQ6 | V145G/Q146A/I147R/S148N/G149V/V150Q/S151I | 7 |
| ZQ7 | V153G/G154V/L155G/L156H/F157I/N158G/N159L/K160L | 8 |
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| 图 2 多位点突变体引物设计策略示意图 Fig. 2 Schematic diagram of primer design strategy for mutants with multiple sites. |
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以包含编码嗜热脂肪酶Lip-SBRN2基因的质粒pET26b-Lip-SBRN2为模板，高保真聚合酶FastPfu DNA聚合酶以及表 1中的引物进行反向PCR。构建每一个多位点突变体分别包含两组反向PCR反应(分别以引物对ZQ(1–7)-a-F/R和ZQ(1–7)-b-F/R进行两组PCR)，总体积50 μL反应体系含有20 ng模板质粒、各10 pmol上下游引物、10 nmol/L dNTPs、2.5 U FastPfu DNA聚合酶、10 μL 5×FastPfu缓冲液和10 μL 5×PCR刺激剂。按照反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s；ZQ1-a：44 ℃、ZQ1-b：32 ℃，ZQ2-a：48 ℃、ZQ2-b：48 ℃，ZQ3-a：54 ℃、ZQ3-b：55 ℃，ZQ4-a：50 ℃、ZQ4-b：38 ℃，ZQ5-a：40 ℃、ZQ5-b：42 ℃，ZQ6-a：40 ℃、ZQ6-b：47 ℃，ZQ7-a：45 ℃、ZQ7-b：55 ℃，退火1 min；72 ℃延伸2 min 30 s，从变性到延伸共30个循环，72 ℃保温5 min后12 ℃保温，进行PCR反应扩增得到含有突变位点的线性质粒。
反应结束后，用1%琼脂糖凝胶检测目的条带，限制性内切酶DpnⅠ酶切回收产物，除去甲基化和半甲基化模板；将每一个多位点突变体的两组酶切产物(ZQ(1–7)-a和ZQ(1–7)-b)等摩尔比混合，按照95 ℃变性10 min、60 ℃退火30 min、然后12 ℃保温的程序进行处理后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有终浓度为30 μg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃培养过夜。在每一个平板上随机挑取3个转化子于5 mL LB液体培养基37 ℃培养12 h后，提质粒酶切检测，挑取酶切正确的质粒利用T7通用引物进行测序鉴定。
2 结果与分析 2.1 重组质粒pET26b-Lip-SBRN2的构建以pUC18-Lip-SBRN2为模板，及针对脂肪酶Lip-SBRN2编码区的引物pET26b-Lip-SBRN2--F和pET26b-Lip-SBRN2-R，扩增得到了特异性的长度为588 bp的目的条带(图 3A)，与载体pET26b同时经BamHⅠ和XhoⅠ酶切、回收、连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞、挑取转化子测序鉴定之后，成功构建了重组质粒pET26b- Lip-SBRN2 (图 3B)。
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| 图 3 pET26b-Lip-SBRN2构建过程中酶切片段琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of enzyme digestion fragment during the construction of pET26b-Lip-SBRN2. (A) Agarose gel electrophoresis of recovered Lip-SBRN2 gene and pET26b which were digested by BamHⅠ and XhoⅠ. (B) Agarose gel electrophoresis of plasmid pET26b-Lip-SBRN2 and its' double enzyme digested fragments : 1: plasmid pET26b-Lip-SBRN2; 2: enzyme digested fragments of plasmid pET26b-Lip-SBRN2 which digested by BamHⅠ and XhoⅠ. |
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根据脂肪酶Lip-SBRN2 (GenBank: EF584562.1)和Lip A(UniProtKB: P37957)的DNA和氨基酸序列，结合优化的反向PCR策略，以及上述引物设计的原则，成功设计多位点突变体ZQ1–ZQ7的引物如表 2所示。其中各突变体包含的突变碱基数和长引物3′端与模板完全互补的碱基数以及短引物的碱基数总结如表 3所示。
| Primer name | Primer sequence (5′–3′) |
| ZQ1-a-F | |
| ZQ1-a-R | CCAGCCTTGACTTTG |
| ZQ1-b-F | CT |
| ZQ1-b-R | CTGTATGCAATTAAT |
| ZQ2-a-F | |
| ZQ2-a-R | TGATAATCGCGGTGC |
| ZQ2-b-F | |
| ZQ2-b-R | GTTTTAAACCAAACGGGT |
| ZQ3-a-F | C |
| ZQ3-a-R | AGCTGTGTTTGTCACCAATCGGTTCGCGCC |
| ZQ3-b-F | GA |
| ZQ3-b-R | TACAGTACCTCTGACTATATCGTGCTTAAC |
| ZQ4-a-F | A |
| ZQ4-a-R | GTAGATAGAGGTGTATGATATTTTGTC |
| ZQ4-b-F | T |
| ZQ4-b-R | CTAAGTAAACTTGATGGTGCAAACAAT |
| ZQ5-a-F | |
| ZQ5-a-R | TGAGTTAAGCACGATATA |
| ZQ5-b-F | AT |
| ZQ5-b-R | GTACAAATTAGCGGTGTA |
| ZQ6-a-F | G |
| ZQ6-a-R | ATTGTTTGCACCATC |
| ZQ6-b-F | G |
| ZQ6-b-R | CACGTCGGTCTGCTC |
| ZQ7-a-F | G |
| ZQ7-a-R | GTGGCTTACACCGCT |
| ZQ7-b-F | T |
| ZQ7-b-R | GTAAATGCTCTTATAAAGGACGGC |
| * The boxed bold bases are mutant bases. | |
| Mutants | Number of mutated bases (bp) | Number of 3′-end complementary bases of long primers (bp) | Number of short primer bases (bp) |
| ZQ1 | 8 | 15 | 15 |
| ZQ2 | 8 | 18 | 15 |
| ZQ3 | 20 | 36 | 30 |
| ZQ4 | 14 | 24 | 27 |
| ZQ5 | 14 | 30 | 18 |
| ZQ6 | 10 | 21 | 15 |
| ZQ7 | 12 | 24 | 15 |
以重组质粒pET26b-Lip-SBRN2为模板，以及针对全长质粒且含有突变位点的引物ZQ(1–7)- a-F/R和ZQ(1–7)-b-F/R，分别进行两轮反向PCR，扩增得到了特异性的长度约为5 900 bp的目的条带(图 4A)。经过回收、DpnⅠ酶切及二轮变性退火处理后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞、挑取转化子测序鉴定之后，成功构建了重组质粒ZQ1–ZQ7 (图 4B)。
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| 图 4 多位点突变体ZQ1–ZQ7 PCR结果及重组质粒凝胶电泳检测图 Fig. 4 Gel electrophoresis diagram of pcr products and recombinant plasmid of multilocus mutants ZQ1–ZQ7. (A) PCR products of ZQ1–ZQ7. ZQ-a and ZQ-b were the products of two rounds of reverse PCR, the target strip were pointed by the arrow. (B) Recombinant plasmids ZQ1–ZQ7. |
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根据2.2所述原则设计的引物，利用上述PCR体系和程序，我们成功构建了多位点突变体ZQ1–ZQ7，该结果表明优化的反向PCR策略可以高效构建多位点突变体。现将该PCR策略的原理展示如图 5所示。设计合成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四条引物，分别以Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ两对引物和模板进行两组反向PCR扩增全长质粒。一轮PCR反应结束后，可得到一条链含有突变位点的半甲基化非正常质粒；第二轮PCR反应结束后，以含有突变位点的那一条链为模板扩增时，可得到双链都含有突变位点的无甲基化非正常质粒；第三轮PCR反应结束后，以双链都含有突变位点的非正常质粒为模板扩增时，可得到含有突变位点的非甲基化的线性质粒，且以Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ为引物扩增得到的两组线性质粒的断开位点分布在突变位点两侧。经过多轮反向PCR扩增后，体系中可积累大量的含有突变位点的非甲基化线性质粒。将这两组PCR扩增产物分别回收后用限制性内切酶DpnⅠ酶切去掉甲基化和半甲基化的模板，等摩尔比混合后按照95 ℃变性10 min、60 ℃退火30 min、然后12 ℃保温的程序进行处理，两条线性质粒在95 ℃变性后互相以来自对方的单链DNA为模板退火形成开环质粒，将处理后的开环质粒直接转化大肠杆菌感受态细胞后可环化为可存活的质粒，挑转化子进行鉴定即可得到阳性克隆。
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| 图 5 优化的反向PCR策略原理图 Fig. 5 Schematic diagram of optimized reverse PCR strategy. |
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本研究基于反向PCR原理，通过设计两对一长一短的引物(长引物包含突变位点，短引物不包含突变位点，长短引物分别与质粒模板的两条链互补)，取一长一短两条引物同时进行两轮反向PCR扩增得到包含突变位点的线性质粒，用DpnⅠ酶切扩增产物降解甲基化模板后等摩尔比混合，再进行一轮变性和退火处理并转化大肠杆菌感受态细胞，即可在24 h内得到包含多位点突变的转化子。
由Stratagene公司基于反向PCR原理开发的点突变试剂盒QCM，通过设计一对包含突变位点的互补引物，进行一轮反向PCR反应扩增全长质粒就可以在DNA序列中引入突变，用DpnⅠ酶切扩增产物降解甲基化模板后转化大肠杆菌感受态细胞，在24 h内即可得到突变体阳性率约为70%–90%的转化子[21]。反向PCR方法和QCM技术可以快速构建突变3个及以下氨基酸残基的突变体，对于突变多于4个及以上氨基酸残基的突变体阳性率则急剧降低[21-22]。而本研究提供的优化反向PCR策略可以成功构建4–11个相邻氨基酸残基突变的多位点突变体。
对于多位点突变体的构建，Wang等曾基于QCM技术，通过两步共三轮PCR反应实现了多位点突变、插入和缺失，该方法的阳性突变率也高达70%–90%，但是多轮PCR反应耗时更长且相对较繁琐[23]。Cabré也曾基于QCM技术，利用完全反向互补且包含突变位点的一对长引物实现了8个相邻碱基突变体的构建[24]，对于相邻碱基突变，该方法具有较强的可操作性，但是对于不相邻的多碱基突变，该方法的效果可能有待进一步检测。相对于Wang等的多轮PCR扩增，本研究只需要同步的两组反向PCR扩增即可构建多位点突变，大大提高了构建克隆的效率。此外，本研究提供的方法可以实现8–20 bp碱基突变，其中包含7个相邻碱基突变，相对于Cabré等8个相邻碱基的突变具有更广泛适用性。综上所述，本研究提供的优化反向PCR策略高效、快捷地实现了多位点突变体的构建。但是利用该方法进行多位点缺失和插入突变的效果还有待进一步研究，且该方法构建突变体过程中出现的包含一条多余的扩增引物的假阳性转化子的形成原因也有待进一步深入探究。
4 结论通过优化引物设计，利用两长两短(长引物包含突变位点，短引物不包含突变位点，长短引物分别与模板质粒的两条链互补) 4条引物同时进行两组反向PCR扩增，以及一轮变性、退火处理，成功高效快捷(24 h内即可得到转化子)地实现了4–11个氨基酸残基突变(8–20 bp)的突变体构建。该方法为生物医药和生物技术设计新的化合物及蛋白质结构和功能的研究奠定了基础。
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