2020, Vol. 36中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 舒小琴, 胡小梅, 郑健, 李杰, 张娟
- Shu Xiaoqin, Hu Xiaomei, Zheng Jian, Li Jie, Zhang Juan
- 人丙氨酸氨基转移酶同工酶在人体组织中的分布
- Study on the distribution of human alanine aminotransferase isoenzyme in human tissues
- 生物工程学报, 2020, 36(11): 2424-2434
- Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(11): 2424-2434
- 10.13345/j.cjb.200135
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文章历史
- Received: March 19, 2020
- Accepted: June 18, 2020
- Published: July 20, 2020
引用本文
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丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT，也称谷丙转氨酶，Glutamic pyruvic transaminase，GPT)是参与人体糖和蛋白代谢重要的酶，在L-丙氨酸和α-酮戊二酸之间催化可逆性的转氨反应形成丙氨酸和L-谷氨酸。人ALT存在两种同工酶，分别由不同的基因编码：ALT1蛋白由496个氨基酸组成，位于染色体8q24.3[1]；ALT2蛋白由523个氨基酸组成，位于染色体16q12.1，ALT2基因由于对前导序列的差别剪接，从而产生了一种含523个氨基酸的蛋白产物及另一个含423个氨基酸的蛋白产物，含423个氨基酸的剪接突变体命名为ALT2-2[2]。近来研究表明ALT1和ALT2两种同工酶在组织上分布不同，mRNA水平上人组织中ALT1在肾脏中高水平表达，在肝脏、肌肉和心脏中度表达，而ALT2在脂肪、肌肉、肾脏和脑组织中高水平表达，在肝脏中度表达[3-4]。Lindblom等研究显示在蛋白水平人组织中的ALT1主要表达于肝脏、骨骼肌、肾脏，心肌未检测出；ALT2主要在心脏和骨骼肌细胞[4-5]，虽然有一些相关的研究，但还没有从基因、蛋白水平和组织定位等方面对ALT同工酶进行系统全面的研究。
血清ALT的活性升高被认为是肝损伤的灵敏指标，然而血清ALT活性升高也会在非肝损伤时出现，例如多发性肌炎、肥胖、代谢性疾病以及健康受试者中[4-8]。反之，血清ALT在部分已确诊为肝损害的患者中并不升高，如非酒精性脂肪型肝炎、C型肝炎病毒[9]。因此，血清丙氨酸氨基转移酶数据的解释有时在临床诊断中具有挑战性，并且血清中丙氨酸氨基转移酶活性变化的分子机制尚不明确。一项研究表明在小鼠小肠中ALT1表达的水平极高，而无ALT2表达[10]。类似的一项研究已经观察到，临床上感染了轮状病毒(首先侵害小肠)而无肝损害的病人中血清ALT活性经常会升高[11]。Jadaho等在构建小鼠脂肪肝模型研究中发现，小鼠血清ALT1表达维持不变，ALT2基因表达却增加2倍，且ALT总活性增加了30%[12]。剧烈运动过后检测受试者血清，ALT2升高水平高于ALT1[13]，原因是骨骼肌损伤。一些研究显示ALT2是糖尿病的预测因子，因为在肥胖和胰岛素抵抗者中ALT2大量来自脂肪组织[13-14]。因此，提示ALT同工酶在不同临床条件下有不同的活性作用，它们的表达水平可能与多种病理情况有关，并且ALT1和ALT2共同影响着ALT总的活性。但目前临床上主要是检测血清总的ALT活性，不能区分同工酶ALT1和ALT2，不能准确判定ALT活性升高的来源，不能判断组织损伤的位置和程度。因此，本研究拟利用基因重组技术表达ALT1和ALT2重组蛋白，制备高特异性ALT1和ALT2同工酶单克隆抗体，其中，ALT1单克隆抗体已制备成功并已发表[15]，从基因水平和蛋白水平上分析人体组织丙氨酸氨基转移酶的分布和表达，为临床病理条件下血清丙氨酸氨基转移酶活性升高的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 人体组织和动物人体正常组织肝脏、肾脏、骨骼肌、心脏、胃、结肠、直肠、胰腺等来源于重庆医科大学附属第二院标本库。Balb/c小鼠购于重庆医科大学实验动物中心。
1.2 细胞和主要试剂大肠杆菌菌株BL21(DE3)和人类肝癌G2细胞(HepG2)由重庆医科大学生命科学院实验室保存。小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)由重庆医科大学附属第一医院表观遗传学实验室提供。ALT1抗体由本实验室制备，限制性内切酶EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ、PCR试剂盒、DNA回收试剂盒、RNA提取试剂盒购于TaKaRa公司，Ni-NTA亲和层析凝胶(Qiagen)，弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购于Sigma公司。
1.3 单克隆抗体制备及纯化 1.3.1 ALT2 cDNA克隆和质粒构建使用TRIzol试剂从肝癌细胞液中提取总RNA，用RT-PCR试剂盒将ALT2基因(1 569 bp)的完整编码序列进行扩增并逆转录为cDNA，引物基因序列如下ALT2 forward 5′-CACCATGCAG CGGGCGGCGGCGCT-3′，REVERSE 5′-TCACGC GTACTTCTCCAGGAAGTTG-3′，PCR产物和pET32a(+)质粒分别经过双酶切，酶切产物纯化后连接，获得重组表达质粒pET32a-ALT2。构建的质粒进行测序(上海嘉根生物科技有限公司)，验证质粒构建是否正确。
1.3.2 ALT2重组蛋白表达与纯化将质粒pET32a-ALT2转化至BL21(DE3)感受态细胞中，将增菌培养后的液体培养基于37 ℃振荡过夜，加入IPTG (终浓度1 mmol/L)诱导蛋白表达。ALT2重组蛋白经亲和层析柱进行纯化(1.5 mL填料，载量8 mg/mL带His-tag蛋白)，目的蛋白上清于咪唑洗脱缓冲液中洗脱，SDS-PAGE检测。
1.3.3 动物免疫取8只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，随机分成4组，将目的蛋白按照25 μg、50 μg、75 μg和100 μg的浓度梯度进行免疫。将目的蛋白与弗氏佐剂等比例乳化皮下多点注射，共免疫4次，末次免疫后7 d用间接ELISA法检测小鼠血清ALT2抗体效价，选择效价最高的小鼠脾细胞进行细胞融合。
1.3.4 细胞融合与杂交瘤细胞筛选将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:1[16]的比例充分混合，在0.8 mL PEG作用下融合，在含1% HAT培养基中进行选择性培养，将阳性杂交瘤细胞株用有限稀释法进行克隆化培养，稳定分泌ALT2抗体的细胞株进行扩大培养。
1.3.5 腹水制备与纯化将0.5 mL杂交瘤细胞(约106个)接种于经降植烷(Sigma)预处理的Balb/c小鼠腹腔中，7-10 d后，小鼠腹部明显膨隆，采集腹水。用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定ALT2单克隆抗体的类别及亚型并进行特异性鉴定。在以前的研究中已经报道了细胞融合和抗体制备的详细过程，并且已经获得了抗ALT1的高质量单克隆抗体[15]。
1.4 RT-PCR检测将所有组织分别取100 mg，Trizol三步法提取组织RNA，反转录试剂盒进行逆转录，使用Real-time试剂盒，以cDNA为模板进行实时荧光PCR反应，检测各个组织中ALT1和ALT2基因的相对表达量。
1.5 Western blotting检测将提取的蛋白煮沸，制备10%胶进行SDS-PAGE，转膜1 h，5%脱脂奶粉37 ℃封闭抗原2 h，ALT1、ALT2一抗(1:400稀释) 4 ℃孵育过夜，PBST洗膜1 h，每10 min换一次液，羊抗鼠二抗(1:5 000稀释)室温孵育1 h，PBST再洗膜1 h，化学发光检测系统采集图像[17]。观察ALT1、ALT2在不同组织中蛋白水平的表达。
1.6 免疫组织化学检测石蜡切片经二甲苯脱蜡、酒精水化，3% H2O2孵育10 min，抗原热修复5 min，滴加一抗ALT1、ALT2室温孵育1 h，PBS洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min后用PBS洗3次，滴加辣根过氧化物酶孵育15 min，DAB显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片[17]。镜下观察黄色或棕褐色为阳性表达，判定组织中ALT1、ALT2抗体表达量及分布情况。
1.7 统计学方法采用SPSS19.0软件对实验数据进行统计学分析，两组间比较采用t检验和非参数检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 pET32a(+)-ALT2重组质粒的构建采用RT-PCR从肝癌细胞液中扩增出ALT2编码基因，约含1 569个碱基对(bp)，琼脂糖凝胶电泳鉴定显示在对应大小处有目的条带，且无杂带，结果如图 1所示。将EcoRⅠ/Hind Ⅲ双酶切后的ALT2和质粒PET32a(+)相连接，PET32a(+)-ALT2重组质粒构建成功。挑取单克隆进行序列测定，比对测序结果与理论相符。
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| 图 1 ALT2基因PCR扩增产物电泳图 Fig. 1 Electrophoretic map of PCR amplification products of ALT2 gene. M: DNA marker; 1: PCR products for ALT2 (1 569 bp). |
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pET32a(+)-ALT2重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达，超声破碎菌体上清液，重组蛋白带有His-tag标签，于大小70 kDa附近有明显的诱导条带，结果如图 2所示，重组蛋白经镍柱(Ni2+)亲和纯化，300 mmol/L咪唑洗脱峰为目的蛋白峰，经SDS-PAGE分析，纯化后的蛋白纯度明显提高(图 3)。
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| 图 2 SDS-PAGE检测ALT2重组蛋白 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the ALT2 recombinant protein. Lane M: protein marker; 1: pET32a(+) vector (IPTG induced); 2: pET32a(+) vector (non-induced); 3: pET32a(+)-ALT2(1 569 bp) vector (IPTG induced); 4: pET32a(+)-ALT2 (1 569 bp) vector (non-induced). |
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| 图 3 SDS-PAGE检测纯化后的ALT2重组蛋白 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified ALT2 recombinant protein. M: protein marker; 1: supernatant pET32a(+)-ALT2 (1 569 bp) (IPTG induced); 2-3: purified ALT2 (1 569 bp) recombinant protein. |
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杂交瘤细胞经过3次有限克隆化稀释后，最终筛选出5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为AD7、BE5、BH4、DD2、HE2。用间接ELISA法分别测定杂交瘤细胞上清、腹水和纯化后ALT2单克隆抗体效价，结果显示腹水和纯化后抗体效价为106，HE2效价最高为8.8×106，而上清液中仅为103。亚类鉴定均为IgG1类，其中BE5为λ链，其余均为κ链。Kaff亲和常数均能达到109 (表 1)。
| Clone cell | Antibody titer | Isotype | Kaff (L/mol) | ||
| Supernatant | Ascites | Antibody | |||
| AD7 | 7.81×103 | 2.11×106 | 3.19×106 | IgG1 κ chain | 6.11×109 |
| BE5 | 5.65×103 | 1.57×106 | 2.28×106 | IgG1 κ chain | 4.37×109 |
| BH4 | 3.89×103 | 1.24×106 | 2.04×106 | IgG1 κ chain | 3.11×109 |
| DD2 | 4.11×103 | 1.27×106 | 2.07×106 | IgG1 κ chain | 3.36×109 |
| HE2 | 2.48×103 | 1.08×106 | 1.56×106 | IgG1 λ chain | 2.01×109 |
间接法ELISA测定显示5株杂交瘤细胞株分泌的mAb与商品化抗人ALT2单抗均能识别ALT2重组蛋白与血清中的ALT2，以1% BSA、ALT1重组蛋白(本课题组表达)、质粒pET32a(+)作为对照组，其结果显示为阴性(表 2)。以人血清样本(ALT活性为746 U/L)作为抗原，Western blotting检测显示5个抗体均能与血清中的ALT2发生免疫反应(图 4)。以ALT2重组蛋白、ALT1重组蛋白、1% BSA作为抗原进行鉴定，结果显示ALT2抗体仅在70 kDa处特异性识别ALT2重组蛋白，而不与ALT1、BSA发生交叉反应(图 5)。结果表明，纯化后的5个抗体均具有特异性。其中，BE5抗体特异性、灵敏度最强，AD7最弱。
| Sample | OD450 | ||||
| AD7 | BE5 | BH4 | DD2 | HE2 | |
| BL21(DE3) with pET32a (+) | 0.145 | 0.121 | 0.157 | 0.161 | 0.172 |
| Serum (ALT 746 U/L) | 1.631 | 0.841 | 0.640 | 0.969 | 1.424 |
| ALT1 protein | 0.153 | 0.134 | 0.152 | 0.146 | 0.112 |
| ALT2 protein | 2.424 | 2.188 | 1.208 | 1.556 | 1.257 |
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| 图 4 Western blotting分析ALT2单克隆抗体的特异性 Fig. 4 Western blotting analysis of the specificity of ALT2 mAb. 1: commercialized ALT2 mAb. |
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| 图 5 ALT2单克隆抗体特异性分析 Fig. 5 Specificity analysis of ALT2 mAb. 1: crude lysate of BL21(DE3) cells with pET32a(+) vector (IPTG); 2: ALT1 recombinant protein; 3: ALT2 recombinant protein. |
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我们检测了人体正常组织中丙氨酸氨基转移酶同工酶ALT1、ALT2的基因和蛋白的表达量及分布情况。通过定量PCR分析显示，ALT1、ALT2在人体正常组织中分布广泛，ALT1在肝脏中表达量最高，肾脏、骨骼肌表达量中等偏上，心肌、胃、小肠、结肠、直肠和脂肪组织中等表达，胰腺、肾上腺表达量低，食管、肺、胆囊组织中表达量最低(图 6)。相反的是，ALT2主要表达在脂肪、肝脏中，肾脏、骨骼肌、心肌表达量中等，肾上腺、肺、胆囊表达量较高，胃肠道平滑肌表达量最低。在蛋白水平上ALT1主要表达在肝脏、骨骼肌、肾脏中，胃、结肠和直肠表达量中等，心肌、脂肪、胰腺表达量低，肾上腺、甲状腺、乳腺、肺和胆囊表达量极低。ALT1集中分布在肝脏、肾脏、骨骼肌、胃肠道组织中，ALT2集中分布在脂肪、肾脏、骨骼肌、心肌中(图 7和图 8)。而不同的是，肝脏中ALT1表达量很高，而ALT2表达量极低，肾脏、骨骼肌中ALT1和ALT2的表达量相似，脂肪组织中ALT2的表达量最高，而ALT1的表达量很低，胃肠道组织中的ALT1的表达量高于ALT2。
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| 图 6 人体正常组织中ALT1和ALT2的mRNA相对表达量 Fig. 6 The mRNA relative expression of ALT1 and ALT2 in human normal tissues. *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001 compared with ALT2 in the same tissue. |
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| 图 7 ALT同工酶在人体正常组织中的蛋白相对表达量 Fig. 7 Quantitative analysis of human ALT isoenzyme tissue distribution. (A) Western blotting analysis of human ALT isoenzyme tissue distribution. (B) Protein expression of ALT isoenzyme in human tissues. Black column: ALT1; white column: ALT2. **: P < 0.01 versus ALT2 in the same tissue. |
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| 图 8 ALT同工酶在人体正常组织中的蛋白相对表达量 Fig. 8 Quantitative analysis of human ALT isoenzyme tissue distribution. (A) Western blotting analysis of human ALT isoenzyme tissue distribution. (B) Protein expression of ALT isoenzyme in human tissues. Black column: ALT1; white column: ALT2. *: P < 0.05, **: P < 0.01 versus ALT2 in the same tissue. |
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在肝脏组织中，ALT1和ALT2主要集中表达于肝细胞，ALT1表达强，ALT2表达弱(图 9a、b)。食管中ALT1中等表达，而ALT2低表达(图 9c、d)。胃中ALT1与ALT2分布类似，信号主要定位于壁细胞，在主细胞中仅观察到较弱的信号(图 9e、f)。空肠中ALT1和ALT2主要表达于肠壁上部区域黏膜，而相邻的平滑肌细胞未检测出，且ALT1和ALT2分布类似，中等表达(图 9g、h)。结肠中ALT1和ALT2也主要分布于肠壁上部区域黏膜，ALT1表达强，ALT2表达中等(图 9i、j)。直肠中分布同结肠，ALT1高表达，ALT2低表达(图 9k、l)。
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| 图 9 人体正常组织ALT1和ALT2免疫组化定位分布 Fig. 9 Immunohistochemical localization of ALT1 and ALT2 in human tissues. |
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肾脏中ALT1和ALT2均检测出，且表达相似，ALT1主要表达在髓质中，ALT2髓质和皮质均表达。放大倍数下，ALT1主要表达在髓质小管中，ALT2髓质和皮质小管中均有，表达中等偏高(图 9m、n)。骨骼肌中ALT1和ALT2主要表达于肌肉纤维内，分布相似，ALT1和ALT2表达中等(图 9o、p)。心肌中ALT1和ALT2均检测出，信号主要定位于心肌细胞中，ALT2表达水平高于ALT1 (图 9q、r)。脂肪中ALT2信号较强，主要定位于脂肪细胞边缘的胞质中，而ALT1信号极弱，甚至未检测出(图 9s、t)。肾上腺中ALT1和ALT2主要表达于皮质部分，髓质中未检测出，ALT1低表达至无表达，ALT2中等表达(图 9u、v)。
胰腺ALT1低表达于胰岛中，腺泡无表达，ALT2于胰岛中强表达，腺泡中低表达(图 9w、x)。肺组织ALT1和ALT2主要表达在肺泡上，ALT1表达极低，而ALT2强表达(图 9y、z)。胆囊ALT1和ALT2信号主要定位于肌层，胆囊壁和外膜无信号，ALT1表达极低甚至无表达，ALT2中等偏低表达(图 9a1、b1)。甲状腺、乳腺、脾脏、前列腺和膀胱组织中未检测出ALT1和ALT2，或者是表达极低。
3 讨论血清丙氨酸氨基转移酶ALT活性的升高在临床被作为诊断肝损伤的一种灵敏指标，其机制可能是肝脏中富含ALT，肝损伤后肝细胞膜通透性增加，肝细胞中的ALT释放入血，导致血清ALT活性增高[18]。因此，在早期的研究中，ALT活性主要在肝脏组织中发现。然而，其他组织和器官也具有ALT活性，包括肾、骨骼肌、心肌、脂肪、心肌、胃、结肠、直肠等。因此，这些部位的任何器官损伤，如肾脏疾病、骨骼肌损伤、心肌梗塞、肥胖症和肠道疾病，都有可能导致血清丙氨酸氨基转移酶活性增加[19-21]。例如，临床上感染了轮状病毒(首先侵害小肠)而无肝损害的病人中血清ALT1活性经常会升高[11]，肥胖和糖尿病患者中ALT2升高[22-23]，极端的体力活动可以引起血清ALT短期地、可逆地增高，且ALT2升高幅度大于ALT1变化趋势[24-25]，可能是骨骼肌损伤引起的。多项研究表明ALT同工酶在组织和器官中的分布是不同的[5, 10, 26]。肝脏和肾脏中ALT1的表达尤其丰富，几乎没有检测到ALT2，而心脏和骨骼肌同时表达ALT1和ALT2。因此，我们推测血清中丙氨酸氨基转移酶的亚型特异性测定可能提供肝外器官损伤方面的额外信息，而不仅仅是丙氨酸氨基转移酶的总活性[5, 26]，区分两种酶在亚细胞中的定位和在病理条件下的表达水平有助于评估不同组织损伤的程度，血清丙氨酸氨基转移酶同工酶的测定可为肝损伤和肝外损伤提供更有用的临床诊断信息。
1975年分子生物学家Kohler和Milstein创建了杂交瘤技术，近几十年来，单克隆抗体技术快速发展，普遍应用于临床医学疾病诊断及治疗、生物医学学科的基础研究等多个领域。单克隆抗体具有高度特异性和均一性，仅针对某一特定的抗原决定簇发生免疫反应，本研究采用基因重组技术成功制备了ALT同工酶重组蛋白，我们选用具有高纯度高活性的ALT重组蛋白免疫雌性Balb/c小鼠，选取小鼠血清ALT抗体效价最高的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇(PEG)的作用下进行细胞融合，建立杂交瘤细胞株，采用有限稀释法和间接ELISA法进行亚克隆和筛选，选择能够稳定分泌ALT单克隆抗体的细胞株进行腹水制备，亲和层析柱法纯化单克隆抗体，并鉴定单克隆抗体的效价、亚型及其特异性[27-28]。为Western blotting和免疫组化分析ALT同工酶在人体组织中的定位分布和表达提供了必要条件。
本研究从基因、蛋白质和组织定位3个方面评价了人类正常组织中的ALT同工酶。根据不同正常组织的基因分析结果，我们发现ALT1基因在人类正常组织中的分布比ALT2基因更广泛。ALT1基因主要在肝脏、肾脏、骨骼肌、心肌、脂肪、结肠、直肠、小肠、胰腺和肾上腺中表达，从高到低依次为脂肪、肝脏、肾脏、骨骼肌、心肌、肾上腺、胰腺、肺和胆囊。Yang等的研究表明，ALT1在肾脏中高表达，在肝脏、肌肉和心脏中中等表达，而ALT2在脂肪、肌肉、肾脏和大脑中高表达，在肝脏中中等表达[3-4]，这与我们的研究大体一致。在组织裂解物的蛋白质印迹获得的蛋白质水平上发现了类似的结果，两种同工酶在人类正常组织中表达也存在差异[10]。这两种同工酶在蛋白水平上的表达也是不同的，本研究显示ALT1在肝脏、骨骼肌、肾脏、胃肠道组织表达高，心肌、脂肪和胰腺中等表达，肾上腺、甲状腺、肺和胆囊表达较低，而ALT2主要表达于脂肪、肾脏、骨骼肌、心肌和胰腺组织中，肝脏、胃肠道组织表达较低，Lindblom等研究显示在蛋白水平人组织中的ALT1主要表达于肝脏、骨骼肌、肾脏，心肌未检测出；ALT2主要在心脏和骨骼肌细胞[4]，与本研究较为一致。有趣的是，肺和胆囊中ALT2也呈中等表达，临床上某些肺部疾病和胆道系统疾病的ALT活性升高，很有可能是ALT2释放入血，从而导致总ALT活性升高。ALT1和ALT2主要表达部位受限，很有可能成为更具有特异性的血清标志物，Glinghammar等研究首次揭示，在3种不同的肝损伤情况下(非酒精性脂肪肝、丙型肝炎和肝手术期间)，血浆中ALT1活性的渗漏量大大超过ALT2，肝损伤时ALT1的测定值与总ALT活性的测定值相等。相反，在运动性骨骼肌损伤过程中，ALT2的渗漏量超过ALT1，循环中ALT1/ALT2的比例也存在相应改变[24]。血浆中ALT亚型的变化反映了肝脏和骨骼肌中ALT1和ALT2活性的相对含量。这些数据表明，用相同的标准分析平台评估ALT1和ALT2活性对血浆中ALT总活性的贡献率，可以区分肝损伤和肝外损伤，比如肝脏疾病、消化道系统疾病可能主要引起ALT1升高，而肥胖、骨骼肌损伤、心肌梗死、胰腺炎等可能会引起ALT2升高。
综上所述，我们从mRNA、蛋白和细胞水平检测了ALT同工酶在人体组织的定位分布和表达情况，为区别肝和非肝损伤引起的ALT活性变化提供了必要的理论依据。本实验室准备进一步深入研究不同病理条件下如骨骼肌损伤、肾脏疾病、胰腺炎等疾病中ALT同工酶的变化情况。因此，探讨人体组织中ALT同工酶的定位、分布及表达量，为更好地研究不同病理条件下ALT同工酶的变化机制提供可靠依据。
| [1] |
Díaz-Juárez J, Rivera-Valerdi L, Bernal-Cerrillo DE, et al. Predominance of released mitochondrial enzymes by partial hepatectomy-induced rat regenerating liver is controlled by hemodynamic changes and not related to mitochondrial damage. Scand J Gastroenterol, 2006, 41(2): 223-233. DOI:10.1080/00365520510024142 |
| [2] |
Yagura M, Tanaka A, Kamitsukasa H, et al. Re-evaluation of the serum alanine aminotransferase upper normal limit in chronic hepatitis C patients. Intern Med, 2010, 49(6): 525-528. DOI:10.2169/internalmedicine.49.2653 |
| [3] |
Yang RZ, Blaileanu G, Hansen BC, et al. cDNA cloning, genomic structure, chromosomal mapping, and functional expression of a novel human alanine aminotransferase. Genomics, 2002, 79(3): 445-450. DOI:10.1006/geno.2002.6722 |
| [4] |
Liu L. The molecular mechanism of serum ALT elevation in mice treated with carbon tetrachloride and human ALT isoenzymes: molecular cloning, protein expression and purification and relater study[D]. Shenyang: China Medical University, 2008 (in Chinese). 刘莉.四氯化碳引起小鼠血清ALT升高的分子机制及人ALT同工酶分子克隆、蛋白表达、纯化及相关研究[D].沈阳: 中国医科大学, 2008. |
| [5] |
Lindblom P, Rafter I, Copley C, et al. Isoforms of alanine aminotransferases in human tissues and serum-differential tissue expression using novel antibodies. Arch Biochem Biophys, 2007, 466(1): 66-77. DOI:10.1016/j.abb.2007.07.023 |
| [6] |
Saxena S, Korula J, Shulman IA. A review of donor alanine aminotransferase testing. Implications for the blood donor and practitioner. Arch Pathol Lab Med, 1989, 113(7): 767-771. |
| [7] |
Giboney PT. Mildly elevated liver transaminase levels in the asymptomatic patient. Am Fam Physician, 2005, 71(6): 1105-1110. |
| [8] |
Chen CH, Huang MH, Yang JC, et al. Prevalence and etiology of elevated serum alanine aminotransferase level in an adult population in Taiwan. J Gastroenterol Hepatol, 2007, 22(9): 1482-1489. DOI:10.1111/j.1440-1746.2006.04615.x |
| [9] |
Bhatty SA, Shaikh NA, Akhter SS. Liver histology in hepatitis C virus positive patients with normal and elevated alanine amino transferase levels. J Pak Med Assoc, 2009, 59(12): 832-834. |
| [10] |
Yang RZ, Park S, Reagan WJ, et al. Alanine aminotransferase isoenzymes: Molecular cloning and quantitative analysis of tissue expression in rats and serum elevation in liver toxicity. Hepatology, 2009, 49(2): 598-607. DOI:10.1002/hep.22657 |
| [11] |
Teitelbaum, J E, Daghistani R. Rotavirus causes hepatic transaminase elevation. Dig Dis Sci, 2007, 52(12): 3396-3398. DOI:10.1007/s10620-007-9743-2 |
| [12] |
Jadaho SB, Yang RZ, Lin Q, et al. Murine alanine aminotransferase: cDNA cloning, functional expression, and differential gene regulation in mouse fatty liver. Hepatology, 2004, 39(5): 1297-1302. DOI:10.1002/hep.20182 |
| [13] |
Thulin P, Rafter I, Stockling K, et al. PPARα regulates the hepatotoxic biomarker alanine aminotransferase (ALT1) gene expression in human hepatocytes. Toxicol Appl Pharmacol, 2008, 231(1): 1-9. DOI:10.1016/j.taap.2008.03.007 |
| [14] |
Anemaet IG, Meton I, Salgado MC, et al. A novel alternatively spliced transcript of cytosolic alanine aminotransferase gene associated with enhanced gluconeogenesis in liver of Sparus aurata. Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40(12): 2833-2844. DOI:10.1016/j.biocel.2008.05.018 |
| [15] |
Hu XM, Cheng SL, Liu XF, et al. Development of monoclonal antibodies and immunochromatographic lateral flow device for rapid test of alanine aminotransferase isoenzyme 1. Protein Expr Purif, 2016, 119: 94-101. DOI:10.1016/j.pep.2015.11.016 |
| [16] |
Chen J, Dai LN, Wang H, et al. Preparation and identification of a monoclonal antibody against human PD-L1. J Sichuan Univ: Med Sci Ed, 2011, 42(1): 5-9 (in Chinese). 陈娇, 戴丽娜, 王辉, 等. 鼠抗人PD-L1单克隆抗体的制备及鉴定. 四川大学学报:医学版, 2011, 42(1): 5-9. |
| [17] |
Li BW, Li X, Zhang ZC, et al. Study on the Notch-Hif-1α signaling pathway in liver regeneration. Prog Mod Biomed, 2016, 16(15): 2806-2810 (in Chinese). 李博伟, 李霄, 张卓超, 等. Notch-Hif-1α信号通路参与调控大鼠肝再生过程的研究. 现代生物医学进展, 2016, 16(15): 2806-2810. |
| [18] |
Shi Q, Yang X, Mattes WB, et al. Circulating mitochondrial biomarkers for drug-induced liver injury. Biomark Med, 2015, 9(11): 1215-1223. DOI:10.2217/bmm.15.59 |
| [19] |
Giesen PL, Peltenburg HG, de Zwaan C, et al. Greater than expected alanine aminotransferase activities in plasma and in hearts of patients with acute myocardial infarction. Clin Chem, 1989, 35(2): 279-283. DOI:10.1093/clinchem/35.2.279 |
| [20] |
Pettersson J, Hindorf U, Persson P, et al. Muscular exercise can cause highly pathological liver function tests in healthy men. Br J Clin Pharmacol, 2008, 65(2): 253-259. DOI:10.1111/j.1365-2125.2007.03001.x |
| [21] |
Hanley AJG, Karter AJ, Williams K, et al. Prediction of type 2 diabetes mellitus with alternative definitions of the metabolic syndrome: the insulin resistance atherosclerosis study. Circulation, 2005, 112(24): 3713-3721. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.105.559633 |
| [22] |
Qian K, Zhong S, Xie KM, et al. Hepatic ALT isoenzymes are elevated in gluconeogenic conditions including diabetes and suppressed by insulin at the protein level. Diabetes Metab Res Rev, 2015, 31(6): 562-571. DOI:10.1002/dmrr.2655 |
| [23] |
Thulin P, Bamberg K, Buler M, et al. The peroxisome proliferator-activated receptor α agonist, AZD4619, induces alanine aminotransferase-1 gene and protein expression in human, but not in rat hepatocytes: Correlation with serum ALT levels. Int J Mol Med, 2016, 38(3): 961-968. DOI:10.3892/ijmm.2016.2681 |
| [24] |
Rafter I, Gråberg T, Kotronen A, et al. Isoform-specific alanine aminotransferase measurement can distinguish hepatic from extrahepatic injury in humans. Int J Mol Med, 2012, 30(5): 1241-1249. DOI:10.3892/ijmm.2012.1106 |
| [25] |
Saengsirisuwan V, Phadungkij S, Pholpramool C. Renal and liver functions and muscle injuries during training and after competition in Thai boxers. Br J Sports Med, 1998, 32(4): 304-308. DOI:10.1136/bjsm.32.4.304 |
| [26] |
Walle P, Takkunen M, Männistö V, et al. Fatty acid metabolism is altered in non-alcoholic steatohepatitis independent of obesity. Metabolism, 2016, 65(5): 655-666. DOI:10.1016/j.metabol.2016.01.011 |
| [27] |
Ge C, Xian YL, Liao HM, et al. Expression of recombinant human alanine aminotransferase (ALT) isoenzyme 2 and preparation of anti-ALT2 monoclonal antibody. Chin J Cell Mol Immunol, 2010, 26(12): 1232-1234, 1237 (in Chinese). 葛翠, 鲜阳凌, 廖红梅, 等. 人丙氨酸氨基转移酶(ALT2)的表达、单克隆抗体制备及鉴定. 细胞与分子免疫学杂志, 2010, 26(12): 1232-1234, 1237. |
| [28] |
Liu L, Zhong S, Yang RZ, et al. Expression, purification, and initial characterization of human alanine aminotransferase (ALT) isoenzyme 1 and 2 in high-five insect cells. Protein Expr Purif, 2008, 60(2): 225-231. DOI:10.1016/j.pep.2008.04.006 |