2020, Vol. 36中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 付元芳, 何伟, 孙普, 杨林, 包慧芳, 曹轶梅, 白兴文, 李平花, 李冬, 陈应理, 刘磊, 卢曾军, 刘在新
- Fu Yuanfang, He Wei, Sun Pu, Yang Lin, Bao Huifang, Cao Yimei, Bai Xingwen, Li Pinghua, Li Dong, Chen Yingli, Liu Lei, Lu Zengjun, Liu Zaixin
- 口蹄疫病毒非结构蛋白3AB双抗体夹心ELISA方法的建立
- Development of a sandwich ELISA for detecting 3AB non-structural protein of foot-and-mouth disease virus
- 生物工程学报, 2020, 36(11): 2357-2366
- Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(11): 2357-2366
- 10.13345/j.cjb.200149
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文章历史
- Received: March 20, 2020
- Accepted: July 30, 2020
- Published: August 12, 2020
引用本文
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2. 甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070
2. College of Veterinary Sciences, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的高度接触性传染病，主要易感动物为家养和野生的偶蹄动物[1-2]。该病传播迅速，可形成世界性大流行，对养殖业和国际畜产品贸易具有严重影响，是一种典型的“政治经济病”[3-4]。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)将其列为必须报告的动物传染病，我国农业农村部也将其列为一类动物疫病。对于大多数发展中国家，接种FMD灭活疫苗是预防口蹄疫最为有效的手段，灭活疫苗的主要成分是FMDV结构蛋白，如果疫苗抗原的纯化工艺不过关，疫苗抗原中仍然会残留部分的非结构蛋白(NSP)，多次免疫后会造成NSP抗体的阳转，影响通过检测NSP抗体区分免疫动物与自然感染动物的准确性，不利于免疫背景下感染状况的评价[5-6]，影响口蹄疫免疫无疫区的国际认证，因此，口蹄疫疫苗抗原纯净度检验也就成为疫苗质量评价的一个重要内容[7] (OIE，2018)。
世界动物卫生组织(OIE) FMD诊断检测指南中推荐的FMD疫苗抗原纯净度检验评价方法是采用疫苗2次免疫至少8头牛后(OIE，2018)，检测NSP是否阳转，以此评价灭活疫苗免疫是否会对感染状况的检测评估产生干扰。该检验方法免疫动物时间长，并且耗费大量人力与物力，因此，疫苗生产企业希望有更简单、有效的标准化检测方法来代替动物免疫实验。Capozzo等[8]开发了一种化学发光免疫分析法，可以在生产过程中定量口蹄疫疫苗抗原中的非结构蛋白，进行疫苗质量控制；李永亮等[9]利用口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体，建立了一种定量检测病毒培养液中3B蛋白的液相阻断ELISA方法，但是在检测的灵敏度方面仍存在一些问题。双抗体夹心ELISA方法是一种简便、灵敏、特异的检测方法，已广泛应用于多种疫苗的质量控制[10-13]。本研究利用实验室制备的FMDV NSP 3A单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的3B单克隆抗体，建立了一种定量检测FMD疫苗抗原中NSP 3AB含量的双抗体夹心ELISA方法，以期为疫苗抗原纯净度检验提供一个可供参考的检测评价方法。
1 材料与方法 1.1 抗体、抗原与疫苗 1.1.1 抗体和质粒FMDV非结构蛋白3A单克隆抗体[14] (浓度为3 mg/mL)、HRP标记的3B单克隆抗体[15]和塞内卡病毒非结构蛋白3AB由本实验室制备并保存；重组质粒pET30a-3AB[16]由本实验室构建并保存。
1.1.2 主要试剂大肠杆菌E. coli BL21(DE3)pLysE为博大泰克公司产品，His标签蛋白纯化凝胶购自南京金斯瑞生物科技有限公司，蛋白定量试剂盒(Bradford)购自北京全式金生物技术有限公司。
1.1.3 FMDV全病毒灭活抗原未纯化的O/Mya98、O/CHA/99、O/HN/93、O/India/2001、A/SEA/97 FMDV灭活抗原，为本实验室制备，并经过灭活检验；来自疫苗生产企业的O/Mya/98、A/WH/09纯化后灭活抗原，Asia1/JS/05 FMDV灭活抗原为2016年生产保存的诊断用抗原。
1.1.4 成品灭活疫苗来自不同口蹄疫灭活疫苗企业的疫苗成品详见表 1。
| No. | Company | Vaccines | Batch No. |
| 1 | A | Bivalent inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O and A for pigs (Re-O/Mya98/JSCZ/2013 strain+Re-A/WH/09 strain) | A181241J |
| 2 | A181136J | ||
| 3 | Bivalent inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O and A for pigs (O/Mya98/BY/2010 strain+Re-A/WH/09 strain) | D181211J | |
| 4 | Inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O (OJMS strain) | F190101J | |
| 5 | B | Bivalent inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O and A (O/HB/HK/99 strain+AF/72 strain, suspension culture) | 1811004 |
| 6 | 1901003 | ||
| 7 | Inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O in pigs (O/Mya98/XJ/2010 strain+O/GX/09-7strain) | 1811002 | |
| 8 | 1906001 | ||
| 9 | 1907001 | ||
| 10 | Inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O (OS strain) | 1807001 | |
| 11 | 1810001 | ||
| 12 | 1907002 | ||
| 13 | 1906002 | ||
| 14 | 1907005 | ||
| 15 | 1907001 | ||
| 16 | C | Inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O for pigs (O/Mya98/XJ/2010 strain+O/GX/09-7 strain) | 20180318 |
| 17 | 20180317 | ||
| 18 | Bivalent inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O and A (OHM/02 strain+AKT-Ⅲ strain, suspension culture) | 20180516 | |
| 19 | 20180517 | ||
| 20 | D | Inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O for pigs (O/Mya98/XJ/2010 strain+O/GX/09-7 strain) | JH180110 |
| 21 | Bivalent inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O and A (OHM/02 strain+AKT-Ⅲ strain, suspension culture) | JH180309 | |
| 22 | JH180310 | ||
| 23 | JH190403 | ||
| 24 | Trivalent inactivated vaccines for foot-and-mouth disease type O, A and Asia 1 (OHM/02 strain+AKT-Ⅲ strain+Asia1KZ/03 strain, suspension culture) | JH170208 | |
| 25 | E | Bivalent inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O and A for pigs (Re-O/Mya98/JSCZ/2013 strain+Re-A/WH/09 strain，suspension culture) | 18392254 |
| 26 | 18392080 | ||
| 27 | Bivalent inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O and A (O/Mya98/BY/2010 strain+Re-A/WH/09 strain) | 18371420 | |
| 28 | Trivalent inactivated vaccines for foot-and-mouth disease type O, A and Asia 1 (O/Mya98/BY/2010 strain+Asia1/JSL/ZK/06 strain+Re-A/WH/09 strain) | 17351453 | |
| 29 | F | Inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O (OHM/02 strain) | 2019015 |
| 30 | Inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O and A (OHM/02 strain+AKT-Ⅲ strain, suspension culture) | 2019015 | |
| 31 | 2019016 | ||
| 32 | 2019010 | ||
| 33 | Inactivated vaccine against foot-and-mouth disease type O for pigs (O/Mya98/XJ/2010 strain+O/GX/09-7 strain, suspension culture) | 2019007 |
将重组质粒pET30a-3AB转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysE，挑取单克隆接种于LB (含100 μg/mL卡那霉素)培养基中，37 ℃培养过夜，第2天以1/100的接种量接入新鲜的LB培养液(含100 μg/mL卡那霉素)，培养至OD值约为0.6时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，28 ℃、200 r/min振荡培养5 h，最后离心收集菌体。用SDS-PAGE检测表达产物，同时以未诱导菌液作为对照；将表达产物用Invitrogen公司的Probond purification system kit纯化，纯化过程按照试剂盒说明书进行操作，用SDS-PAGE观察；同时用Easy protein quantitation kit (Bradford)进行蛋白定量，按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.2 夹心ELISA反应条件的确定用棋盘滴定法进行夹心ELISA抗体工作浓度的确定：用包被液(0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液)将3A单克隆抗体作3.0、1.0和0.6 μg/mL三个浓度稀释，横向加入酶标板各孔，100 μL/孔，4 ℃包被过夜；用含1%明胶的PBS溶液在37 ℃封闭1 h，用1×PBST连续洗板3遍，拍干；用1×PBS稀释标准3AB抗原至1.0 μg/mL，每孔加入100 μL，封板，室温振荡反应2 h，洗板，拍干；用1×PBST将HRP标记的3B单克隆抗体进行1︰50 000、1︰100 000、1︰200 000和1︰400 000稀释，纵向加入酶标板各孔，100 μL/孔，封板，室温振荡孵育1 h，洗板，拍干；加入TMB底物溶液避光反应15 min；0.3 mol/L H2SO4溶液终止反应，用酶标仪测定450 nm波长OD值。为了保证检测的敏感性，采用饱和浓度的3A单抗包被酶标板，以OD值变化较小时的3A单抗包被浓度为饱和包被浓度；以OD值达到2.0时的3B单抗最低浓度为其最适工作浓度。
确定3A与3B单抗的最适工作浓度之后，确定捕获3AB蛋白的最适反应时间。将标准品按5、10、15、20、25、30、35、40 ng/mL稀释，室温分别捕获2、6、12 h；洗涤后，加入工作浓度的3B单抗，室温作用1 h；PBST洗涤后，同前加入底物显色并终止反应；以样品OD值与PBS对照的比值大于2.0，且3AB蛋白浓度最低时，所用的时间为最适3AB蛋白捕获反应时间。
1.2.3 夹心ELISA操作流程包被：用包被缓冲液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释3A单克隆抗体至工作浓度，100 μL/孔加入酶标板，封板，4 ℃过夜(12–18 h)。用1×PBST连续洗板3遍，拍干。
封闭：加封闭液(含1%明胶的PBS溶液) 100 μL/孔，37 ℃封闭1 h，用1×PBST连续洗板3遍，拍干。
加待测样品：用1×PBS稀释待测样品和对照样品，每孔加入100 μL，对照加两孔。封板，室温振荡反应6 h，用1×PBST洗板3遍，拍干。
加酶标二抗：用1×PBST稀释HRP标记的3B单克隆抗体至工作浓度，每孔加入100 μL，封板，室温振荡孵育1 h，用1×PBST连续洗板5遍，拍干。
加底物液显色：加入TMB底物溶液100 μL/孔，室温避光反应15 min。
终止反应测定OD值：每孔加入100 μL终止液(0.3 mol/L H2SO4溶液)终止反应，用酶标仪测定450 nm波长OD值。
结果判定：样本OD值与PBS对照孔OD值的比值大于2.0，确定为有3AB蛋白的界限值，然后根据标准曲线的回归方程，即可计算出样品中所含3AB蛋白的浓度。
1.2.4 标准曲线的绘制用1×PBS (0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4) 2倍系列稀释3AB蛋白标准品，浓度依次为600.0、300.0、150.0、75.0、37.5、18.8、9.4、4.7 ng/mL，采用上述夹心ELISA程序检测不同浓度3AB标准品的OD值，重复检测6次，通过计算每个浓度的平均值、标准差，并进行差异显著性分析(t检验)，从而确定该方法的检测范围；再以不同浓度3AB蛋白标准品所对应的OD值作为横坐标、以标准品的不同浓度作为纵坐标建立标准曲线，利用Excel软件中的LINEST函数进行线性回归分析，推导回归方程。
1.2.5 3AB定量检测ELISA特异性评价使用上述3AB定量ELISA方法检测1×PBS、BHK细胞培养液、胎牛血清(FBS)和塞内卡病毒非结构蛋白3AB等，评价该定量检测ELISA方法的特异性。
1.2.6 不同来源FMDV灭活抗原中3AB含量的检测应用此方法分别检测纯化前后的不同血清型FMDV灭活抗原；检测来自6个FMD全病毒灭活疫苗生产企业的33个批次的口蹄疫全病毒灭活疫苗，先进行破乳处理，分别取疫苗和正戊醇按9:1混合，4 ℃静置2 h后8 000 r/min离心10 min，破乳后取水相用于3AB含量检测，对比分析不同厂家不同批次疫苗中3AB蛋白的残留量。
1.2.7 标准品与灭活疫苗抗原中3AB蛋白Western blotting免疫印迹检测将200倍浓度的标准品(120 μg/mL)用PBS缓冲液2倍系列稀释后，取50 μL加等量上样缓冲液，煮沸约5 min，取10 μL/孔加入凝胶中，进行SDS-PAGE；然后将分离后的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜(NC)，将膜放入含10%脱脂奶粉的PBST缓冲液中室温封闭1 h；PBST洗3次后，加入工作浓度的HRP-3B单抗(0.5 μg/mL)，室温孵育1 h；PBST洗涤5次，然后加入ECL化学发光底物显色，暗室中压X光片曝光，观察条带显色情况，以眼观有明显条带者判为阳性。
2 结果与分析 2.1 3AB融合蛋白的诱导表达与纯化收集诱导表达后菌体进行SDS-PAGE，结果与未诱导的阴性对照相比有明显的融合蛋白表达带，分子质量约为33 kDa，与理论值相符(图 1)；纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE分析，只有1条约33 kDa的蛋白带(图 1)，纯度为99%，蛋白定量测得浓度为1.5 mg/mL。
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| 图 1 表达产物和纯化后蛋白的SDS-PAGE分析 Fig. 1 Analysis of expressed products and purified recombinant proteins by SDS-PAGE.Lane M is protein molecular weight marker; lane 1 shows 3AB recombinants induced with IPTG; lane 2 shows recombinants before induced with IPTG; lane 3 shows purified fusion proteins of 3AB. |
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用不同浓度3A单克隆抗体和HRP标记3B单克隆抗体进行棋盘滴定，以抗原孔OD值接近2.0、未加抗原孔OD值< 0.1为判定标准，结果显示，3A单克隆抗体的饱和包被浓度为3.0 μg/mL，此时对应的HRP标记3B单克隆抗体的最适工作浓度为1:100 000 (表 2)。
| HRP-3B Mab | 3A Mab (μg/mL) | |||
| 3.0 | 1.0 | 0.6 | 0.0 | |
| 1:50 000 | 3.38 | 3.33 | 3.01 | 0.08 |
| 1:100 000 | 2.49 | 2.44 | 2.17 | 0.07 |
| 1:200 000 | 1.57 | 1.56 | 1.30 | 0.06 |
| 1:400 000 | 0.88 | 0.87 | 0.73 | 0.07 |
对比了3A单抗捕获3AB蛋白2、6与12 h的检测敏感性，以3AB蛋白的浓度作为横坐标、以不同浓度3AB蛋白测得OD值与阴性对照OD值的比值作为纵坐标绘制曲线，结果见图 2所示。以最低检测浓度对应的OD值与阴性对照OD值的比值≥2.0时，所对应的3AB标准品浓度为最低检测限，以此确定可达最低检测限的反应条件。由图 2可见，3A单抗的包被浓度为3.0 μg/mL，捕获3AB蛋白的时间为6 h时，标准品最低浓度对应的OD值与阴性对照OD值的比值为2.0，捕获6 h与12 h的结果没有明显差异，由此确定该ELISA方法的最佳反应条件为3.0 μg/mL 3A单克隆抗体包被酶标板，室温捕获6 h进行定量检测，确定为该夹心ELISA的最佳反应条件。在此条件下的3AB蛋白的最低检测限为4.7 ng/mL。
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| 图 2 不同反应条件下检测3AB蛋白的最低浓度 Fig. 2 The lowest detectable limit of 3AB protein under different reaction condition.P/N value is the ratio of OD sample to OD negative control. (A) 3A Mab 3 μg/mL. (B) 3A Mab 1 μg/mL. (C) 3A Mab 0.6 μg/mL. |
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采用双抗体夹心ELISA检测不同浓度的3AB蛋白标准品，6次重复检测结果见表 3。对每个浓度标准品的6次检测数据进行差异显著性检验显示，每组检测数据的标准差都在0.05以内，t检验的P值都大于0.05，说明6次检测数值之间差异不显著。根据6次重复检测值的平均值绘制标准曲线(图 3)，推导出的回归方程为y=260.26x−27.094，相关系数R2值为0.995 7，根据标准品的检测值，确定3AB蛋白含量的检测范围为4.7–600.00 ng/mL。
| 3AB standards (ng/mL) | T1 | T2 | T3 | T4 | T5 | T6 | M | SD | P value |
| 600.0 | 2.51 | 2.18 | 2.25 | 2.32 | 2.38 | 2.47 | 2.35 | 0.10 | P > 0.05 |
| 300.0 | 1.30 | 1.32 | 1.27 | 1.31 | 1.39 | 1.26 | 1.31 | 0.03 | P > 0.05 |
| 150.0 | 0.76 | 0.81 | 0.78 | 0.70 | 0.67 | 0.79 | 0.75 | 0.04 | P > 0.05 |
| 75.0 | 0.47 | 0.38 | 0.45 | 0.46 | 0.45 | 0.47 | 0.46 | 0.02 | P > 0.05 |
| 37.5 | 0.25 | 0.20 | 0.21 | 0.26 | 0.22 | 0.23 | 0.24 | 0.03 | P > 0.05 |
| 18.8 | 0.16 | 0.14 | 0.15 | 0.15 | 0.13 | 0.16 | 0.15 | 0.01 | P > 0.05 |
| 9.4 | 0.12 | 0.11 | 0.12 | 0.13 | 0.12 | 0.11 | 0.12 | 0.01 | P > 0.05 |
| 4.7 | 0.10 | 0.09 | 0.09 | 0.10 | 0.09 | 0.09 | 0.10 | 0.01 | P > 0.05 |
| 0.0 | 0.05 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.01 | P > 0.05 |
| Notes: T1–T6 shows OD value; M: mean; SD: standard deviation. | |||||||||
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| 图 3 3AB蛋白定量检测的标准曲线与回归分析 Fig. 3 Standard curve and regression analysis for quantification of 3AB protein. |
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夹心ELISA定量检测1×PBS缓冲液、BHK细胞培养液、含2%胎牛血清的细胞维持液和塞内卡病毒非结构蛋白3AB，重复检测10次以上其OD值均小于0.05，说明常规的病毒培养液对检测结果没有干扰，与塞内卡病毒的3AB蛋白没有交叉反应，证明该检测方法特异性好。
2.5 夹心ELISA定量检测方法的实际应用夹心ELISA定量检测12份未纯化灭活FMDV抗原、2份纯化的灭活FMDV抗原，33份来自不同疫苗企业提供的口蹄疫灭活疫苗破乳后抗原，结果见表 4。12份未纯化灭活FMDV抗原中3AB蛋白量介于9.3–200.0 ng/mL之间；而纯化后的2份FMDV抗原中3AB蛋白含量低于最低检测限。检测33份灭活疫苗抗原中的3AB含量，其中有9份抗原中的3AB含量大于10 ng/mL (表 4，灭活疫苗编号为5–7，10–15)，其他24份疫苗抗原中3AB蛋白含量低于4.7 ng/mL的最低检测限(表 4中省略)。
| Antigen | Strain | No. | T1 | T2 | T3 | T4 | T5 | M | SD |
| Unpurified inactivated antigen | O/Mya/98 | 171108 | 19.8 | 16.4 | 18.3 | 17.9 | 18.6 | 18.2 | 0.7 |
| 180524 | 9.6 | 8.7 | 10.9 | 8.6 | 9.3 | 9.4 | 0.6 | ||
| 180612 | 14.6 | 12.4 | 15.1 | 13.5 | 14.4 | 14.0 | 0.7 | ||
| 180720 | 15.8 | 18.6 | 17.4 | 16.2 | 17.9 | 17.2 | 0.8 | ||
| O/CHA/99 | 181229 | 15.9 | 14.1 | 13.9 | 15.3 | 14.8 | 14.8 | 0.5 | |
| O/HN/93 | 181229 | 9.9 | 10.6 | 12.7 | 11.8 | 10.4 | 11.1 | 0.8 | |
| O/India/2001 | 190218 | 15.4 | 13.1 | 14.6 | 15.5 | 16.2 | 15.0 | 0.7 | |
| A/Sea/97 | 170330 | 74.7 | 70.1 | 72.6 | 69.8 | 71.4 | 71.7 | 1.3 | |
| 180525 | 32.5 | 33.1 | 31.3 | 30.5 | 32.1 | 31.9 | 0.7 | ||
| 180623 | 53.0 | 50.7 | 51.9 | 51.0 | 52.4 | 51.8 | 0.6 | ||
| 190218 | 21.8 | 19.9 | 22.3 | 20.4 | 21.0 | 21.1 | 0.6 | ||
| Asia1/JS/05 | 161118 | 201 | 202.1 | 199.5 | 197.4 | 200 | 200.0 | 1.0 | |
| Purified inactivated antigens | O/Mya/98 | 181022 | < 4.7 | < 4.7 | < 4.7 | < 4.7 | < 4.7 | < 4.7 | 0.0 |
| A/WH/09 | 181022 | < 4.7 | < 4.7 | < 4.7 | < 4.7 | < 4.7 | < 4.7 | 0.0 | |
| Antigens in commercial vaccines | 5 | 49.0 | 35.0 | 57.0 | 72.0 | 50.0 | 52.6 | 9.5 | |
| 6 | 55.0 | 45.0 | 67.0 | 74.0 | 40.0 | 56.2 | 11.4 | ||
| 7 | 45.0 | 30.0 | 23.0 | 41.0 | 25.0 | 32.8 | 8.1 | ||
| 10 | 70.1 | 70.7 | 75.5 | 74.5 | 63.5 | 70.86 | 4.7 | ||
| 11 | 81.5 | 81.4 | 87.2 | 86.0 | 84.2 | 84.06 | 2.6 | ||
| 12 | 61.7 | 62.4 | 66.4 | 65.5 | 71.4 | 65.48 | 3.9 | ||
| 13 | 76.4 | 77.0 | 82.4 | 81.2 | 75.8 | 78.56 | 3.0 | ||
| 14 | 85.8 | 86.2 | 92.5 | 91.1 | 89.6 | 89.04 | 3.0 | ||
| 15 | 53.0 | 53.8 | 57.0 | 56.3 | 44.4 | 52.9 | 5.0 | ||
Western blotting结果显示，标准蛋白上样量依次为600.0、300.0、150.0、75.0、37.5、18.8、9.4和4.7 ng时均出现特异性条带，上样蛋白量为2.4 ng时未出现条带(图 4A)；33份来自不同厂家的成品疫苗抗原中编号为5、6、7、10、11、12、13、14和15的9份疫苗出现了特异性条带(图 4B)，说明有3AB蛋白残留，其余24份疫苗均未出现条带(图 4B)。
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| 图 4 标准品(A)与不同厂家灭活疫苗(B)中3AB蛋白Western blotting分析 Fig. 4 Analysis of 3AB contents in standard samples and vaccine antigens by Western blotting.M is the protein molecular weight marker; lanes 1-9 in Figure A show the results for standard samples of 600, 300, 150, 75, 37.5, 18.8, 9.4, 4.7 and 2.4 ng per well of 3AB protein; lanes 1-33 in Figure B show the results for detection of 3AB protein in 33 batches of vaccine antigens. |
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在灭活疫苗免疫背景下，口蹄疫感染状况的监测依赖于检测NSP抗体，因此，OIE口蹄疫诊断标准中明确要求，在申请认可口蹄疫免疫无疫区的国家或地区，必须使用对NSP抗体检测没有干扰的抗原纯化灭活疫苗，从而能够通过检测NSP抗体，准确评价区域内免疫动物群体FMD的感染情况。目前，评价灭活疫苗抗原纯净度的方法是通过两次动物免疫试验，以NSP抗体是否阳转来进行判定。已有许多实验室对FMDV NSP 3A、3B、3D、2C和3ABC等非结构蛋白抗体的应答规律进行了研究，并建立了对应的非结构蛋白抗体检测方法[17-21]，其中检测NSP 3AB或3ABC抗体是鉴别感染与免疫动物的国际通用方法[22-26]，所以检测疫苗抗原中3AB或3ABC蛋白的含量，可以直接反映疫苗抗原的纯化程度，指导疫苗的选择和使用，也可为疫苗的质量控制提供参考方法。
本研究通过优化ELISA反应条件，在3A单抗饱和浓度(3 μg/mL)包被酶标板，6 h捕获3AB蛋白，达到了最高的检测灵敏度，可检测标准品3AB蛋白的最低量为4.7 ng/mL，低于这一最低检测限时，则与空白对照没有差异。采用原核表达纯化的3AB蛋白为标准品，通过多次重复试验建立了相对稳定的标准曲线，样品浓度与OD值呈线性相关，多次重复检测标准曲线R值大于0.99；由于检测样品的成分主要为细胞培养抗原，成分相对稳定，检测特异性好，结果准确。应用本方法检测成品疫苗抗原中3AB蛋白的含量时，检出一些批次的疫苗抗原中残留有3AB蛋白，通过免疫印迹试验也检测出3AB蛋白条带，说明所建立的3AB蛋白定量ELISA方法检测结果准确可靠，但免疫印迹试验不能定量，只能定性判断这些批次的疫苗抗原纯化不完全。这种未完全去除NSP 3AB蛋白的疫苗多次使用会造成免疫动物3AB抗体的阳转，对感染与免疫动物的鉴别诊断产生干扰。至于3AB蛋白残留量与免疫次数和抗体阳转率之间的关系，还需要进一步研究。
本研究中也发现，不同毒株的未纯化灭活抗原中3AB含量存在较大的差异，这可能与病毒的复制滴度、前体蛋白的加工程度有关，Asia1型病毒的灭活抗原中检测到的3AB含量达200 ng/mL，在3个血清型抗原中最高，这可能与Asia1型病毒抗原产量高有关系。
本研究建立的定量检测3AB蛋白的ELISA方法，可以准确检测FMDV疫苗抗原中3AB蛋白的残留量，可以为疫苗抗原纯净度评价提供一定的参考，具有一定的应用价值。
致谢 感谢中农威特生物科技股份有限公司、中牧股份兰州生物药厂、天康生物股份有限公司制药一分公司、金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古必威安泰生物科技有限公司、杨凌金海生物技术有限公司为本研究提供了口蹄疫病毒灭活疫苗，并提供了宝贵的建议，在此谢忱。
| [1] |
Paton DJ, Gubbins S, King DP. Understanding the transmission of foot-and-mouth disease virus at different scales. Curr Opin Virol, 2018, 28: 85-91. DOI:10.1016/j.coviro.2017.11.013 |
| [2] |
Lyons NA, Ludi AB, Wilsden G, et al. Evaluation of a polyvalent foot-and-mouth disease virus vaccine containing A Saudi-95 against field challenge on large-scale dairy farms in Saudi Arabia with the emerging A/ASIA/G-VⅡ viral lineage. Vaccine, 2017, 35(49): 6850-6857. DOI:10.1016/j.vaccine.2017.10.029 |
| [3] |
Zheng YM, Jit M, Wu JT, et al. Economic costs and health-related quality of life for hand, foot and mouth disease (HFMD) patients in China. PLoS ONE, 2017, 12(9): e0184266. DOI:10.1371/journal.pone.0184266 |
| [4] |
Knight-Jones TJD, Rushton J. The economic impacts of foot and mouth disease — what are they, how big are they and where do they occur?. Prev Vet Med, 2013, 112(3/4): 161-173. |
| [5] |
Chénard G, Selman P, Dekker A. Cedivac-FMD can be used according to a marker vaccine principle. Vet Microbiol, 2008, 128(1/2): 65-71. |
| [6] |
Paton DJ, de Clercq K, Greiner M, et al. Application of non-structural protein antibody tests in substantiating freedom from foot-and-mouth disease virus infection after emergency vaccination of cattle. Vaccine, 2006, 24(42/43): 6503-6512. |
| [7] |
OIE (Office International des Epizooties/World Organization for Animal Health). Foot and mouth disease//OIE Standards Commission, Ed. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 8th ed. 2018. https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.08_FMD.pdf.
|
| [8] |
Capozzo AV, Martínez MR, Schielen WJG. Development of an in process control filtration-assisted chemiluminometric immunoassay to quantify foot and mouth disease virus (FMDV) non-capsid proteins in vaccine-antigen batches. Vaccine, 2010, 28(40): 6647-6652. DOI:10.1016/j.vaccine.2010.05.049 |
| [9] |
Li YL, Lu ZJ, Yang SZ, et al. The establishment of quantitative ELISA of foot-and-mouth disease virus non-structural protein 3B. China Biotechnol, 2009, 29(11): 70-73 (in Chinese). 李永亮, 卢曾军, 杨苏珍, 等. 口蹄疫病毒非结构蛋白定量检测ELISA方法的建立. 中国生物工程杂志, 2009, 29(11): 70-73. |
| [10] |
Niu YJ, Zhang P, Wang LY, et al. Development of double-antibody sandwich ELISA for rapidly quantitative detection of antigen concentration in inactivated SCRV vaccine. Aquaculture, 2020, 520: 734671. DOI:10.1016/j.aquaculture.2019.734671 |
| [11] |
Morgeaux S, Poirier B, Ragan CI, et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA-results of an international collaborative study. Vaccine, 2017, 35(6): 966-971. DOI:10.1016/j.vaccine.2016.12.039 |
| [12] |
Wang ZJ, Sun Y, Wu XF, et al. Development of a relative potency test using ELISA for human rabies vaccines. Biologicals, 2018, 55: 59-62. DOI:10.1016/j.biologicals.2018.06.003 |
| [13] |
Ming F, Cheng YQ, Ren CW, et al. Development of a DAS-ELISA for detection of H9N2 avian influenza virus. J Virol Methods, 2019, 263: 38-43. DOI:10.1016/j.jviromet.2018.10.014 |
| [14] |
Fu YF, Li PH, Cao YM, et al. Development of a blocking ELISA using a monoclonal antibody to a dominant epitope in non-structural protein 3A of foot-and-mouth disease virus, as a matching test for a negative-marker vaccine. PLoS ONE, 2017, 12(1): e0170560. |
| [15] |
Fu YF, Lu ZJ, Li PH, et al. Development of a blocking ELISA based on a monoclonal antibody against a predominant epitope in non-structural protein 3B2 of foot-and-mouth disease virus for differentiating infected from vaccinated animals. PLoS ONE, 2014, 9(11): e111737. DOI:10.1371/journal.pone.0111737 |
| [16] |
Zhu XM, Lu ZJ, Hu YH, et al. Expression of nonstructural protein 3AB gene of foot-and-mouth disease virus and analysis of its bioactivity. J Agric Biotechnol, 2008, 16(1): 15-19 (in Chinese). 祝秀梅, 卢曾军, 胡永浩, 等. 口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的可溶性表达与反应原性的鉴定. 农业生物技术学报, 2008, 16(1): 15-19. |
| [17] |
Shao JJ, Chang HY, Lin T, et al. Expression and utilization of 3AB nonstructural protein of foot-and-mouth disease virus in Escherichia coli. Chin J Biotech, 2011, 27(2): 180-184 (in Chinese). 邵军军, 常惠芸, 林彤, 等. 口蹄疫病毒非结构蛋白3AB的原核表达及应用. 生物工程学报, 2011, 27(2): 180-184. |
| [18] |
Colling A, Morrissy C, Barr J, et al. Development and validation of a 3ABC antibody ELISA in Australia for foot and mouth disease. Aust Vet J, 2014, 92(6): 192-199. DOI:10.1111/avj.12190 |
| [19] |
Hosamani M, Basagoudanavar SH, Tamil Selvan RP, et al. A multi-species indirect ELISA for detection of non-structural protein 3ABC specific antibodies to foot-and-mouth disease virus. Arch Virol, 2015, 160(4): 937-944. DOI:10.1007/s00705-015-2339-9 |
| [20] |
Sharma GK, Mohapatra JK, Pandey LK, et al. Immunodiagnosis of foot-and-mouth disease using mutated recombinant 3ABC polyprotein in a competitive ELISA. J Virol Methods, 2012, 185(1): 52-60. DOI:10.1016/j.jviromet.2012.05.029 |
| [21] |
Ma JT, Lu ZJ, Cao YM, et al. Secreted expression of nonstructural protein gene 3ABC of foot-and-mouth disease virus in Sf9 cells and activity analysis. Chin J Biotech, 2007, 23(3): 540-545 (in Chinese). 马江涛, 卢曾军, 曹轶梅, 等. 口蹄疫病毒NSP 3ABC基因在昆虫细胞中的分泌表达及其活性检测. 生物工程学报, 2007, 23(3): 540-545. |
| [22] |
Sharma GK, Mohapatra JK, Mahajan S, et al. Comparative evaluation of non-structural protein-antibody detecting ELISAs for foot-and-mouth disease sero-surveillance under intensive vaccination. J Virol Methods, 2014, 207: 22-28. DOI:10.1016/j.jviromet.2014.06.022 |
| [23] |
Fukai K, Morioka K, Onozato H, et al. Comparative evaluation of three commercial ELISA kits for detection of antibodies to a nonstructural protein of foot-and-mouth disease virus. J Vet Med Sci, 2013, 75(6): 693-699. |
| [24] |
Bergmann IE, Neitzert E, Malirat V, et al. Development of an inhibition ELISA test for the detection of non-capsid polyprotein 3ABC in viral suspensions destined for inactivated foot-and-mouth disease vaccines. Dev Biol (Basel), 2006, 126: 241-250. |
| [25] |
Robiolo B, Seki C, Fondevilla N, et al. Analysis of the immune response to FMDV structural and non-structural proteins in cattle in Argentina by the combined use of liquid phase and 3ABC-ELISA tests. Vaccine, 2006, 24(7): 997-1008. |
| [26] |
Brocchi E, Bergmann IE, Dekker A, et al. Comparative evaluation of six ELISAs for the detection of antibodies to the non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus. Vaccine, 2006, 24(47/48): 6966-6979. |