2020, Vol. 36中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 王蓝晨, 唐勤敏, 何宇锋, 王颖, 杨仕赛, 朱贵明
- Wang Lanchen, Tang Qinmin, He Yufeng, Wang Ying, Yang Shisai, Zhu Guiming
- Elovl5转基因果蝇产生更长链的脂肪酸
- Transgenesis of Drosophila melanogaster with an Elovl5 gene enables the production of longer-chain fatty acids
- 生物工程学报, 2020, 36(10): 2171-2180
- Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(10): 2171-2180
- 10.13345/j.cjb.200053
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文章历史
- Received: February 5, 2020
- Accepted: May 11, 2020
- Published: May 27, 2020
引用本文
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多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)为一独特的生物活性物质，因其特殊的分子结构及重要的生物学作用而受到广泛的关注和研究[1-2]。其生物学功能以及生物合成机制在哺乳动物中已有较深刻的阐释[3]，但在昆虫类生物中的研究较为稀缺，而实际上大多数昆虫所含有的多不饱和脂肪酸为C18-PUFAs，即亚油酸或α-亚麻酸，其含量最高可达到45%左右(如鞘翅目昆虫Oryctes owariensis等) [4-6]。因此，昆虫来源的脂肪酸具有潜在的开发优势。
果蝇Drosophila melanogaster作为一种经典的模式生物已经有100多年的历史，果蝇具有繁殖能力强、体积小、生命周期短(约两周)、易于培养以及便于作表型分析等特点，在发育生物学、遗传学、营养学和神经科学等领域研究中都得到了广泛的应用[7]。果蝇具有类似脂肪的身体组织和脂质运输系统，在生理上更接近人体，同时果蝇的脂肪体是一个代谢中心，类似于脊椎动物的肝脏[8-9]。因此，果蝇是研究多不饱和脂肪酸非常理想的模型[10]。相关研究表明，果蝇体内不需要也不合成18C以上的多不饱和脂肪酸[11]，但果蝇能从含有多不饱和脂肪酸的食物中吸收多不饱和脂肪酸并将其进行转化[12]。因此，利用果蝇研究PUFAs及其衍生物，或许可以提供新的视角，拓宽对PUFAs及其代谢产物对生物体生理功能的了解。
脂肪酸的碳链延长反应的一类延长酶，是参与C18-C22 PUFAs合成的关键酶，它催化供体的两个碳原子引入PUFAs碳链中增加其碳链长度。生物的膜脂与贮脂都包含有特定组成的脂肪酸，而其链长的不同就是由催化不同链长延伸反应的脂肪酸延长酶所控制的。哺乳动物的ELOVL基因家族高度保守，表达产物为微粒体酶[13]。在该基因家族中，Elovl5参与延长C16、C18单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acids，MUFAs)和C18、C20、C22 PUFAs的碳链，是高不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids，HUFAs)生物合成途径中的关键酶[14-15]。在昆虫中，迄今也没有发现这些与多不饱和脂肪酸合成代谢相关的去饱和酶和延长酶，故一般均认为昆虫自身并无代谢合成多不饱和脂肪酸的能力[10]。我们通过GenBank中现有的昆虫基因组测序数据分析，包括果蝇等昆虫体内都不存在这些去饱和酶和延长酶的编码基因。
本研究通过基因工程的方法，在果蝇中重新建立多不饱和脂肪酸生物合成代谢的途径，即利用转基因技术将Δ6-脂肪酸延长酶Elovl5基因(GenBank ID：68801)转移到果蝇体内，添加底物后使其不仅能够内源性合成亚油酸以及α-亚麻酸等短链多不饱和脂肪酸，也能够合成C20、C22等长链多不饱和脂肪酸，进而研究清楚转基因果蝇对C20及更长链PUFAs的代谢特性，可为果蝇及其他昆虫油脂资源尤其是多不饱和脂肪酸的开发利用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料研究所用果蝇为黑腹果蝇(W1118)，饲养、保种于本实验室昆虫人工气候箱中，培养条件为恒温25 ℃、湿度60%、光照周期12L︰12D。
Q5®超保真2×预混液、限制性内切酶、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)、T4 DNA连接酶购自NEB。DNA Marker、2×Taq PCR MasterMix Ⅱ、纯化回收试剂盒、DNA/RNA共提试剂盒、质粒提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、大肠杆菌Escherichia coli DH5α、氨苄青霉素(Ampicillin)购于天根生化科技(北京)有限公司。14%三氟化硼(BF3)、正己烷、丙酸购于Sigma-ALDRICH。氯化钠、酵母粉及胰蛋白胨购于Oxoid公司。琼脂糖购于Biosharp公司，果蝇培养基购于海博生物。脂肪酸甲酯标准品PUFA No.3、Supelco 37 Component FAME Mix等购于Sigma-Aldrich公司，α-亚麻酸使用紫苏籽油(α-亚麻酸含量为66.7%)代替，购于长春长白工坊。二氧化碳、氮气购于市场供应商。引物合成及基因测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
果蝇培养基配制：称取海博生物果蝇培养基20.87 g，加热溶解于100 mL蒸馏水中，待稍冷加入0.65 mL丙酸混匀，趁热将培养基装入已灭菌的培养瓶中，备用。
1.2 方法 1.2.1 Elovl5基因表达载体构建构建含有来源于小鼠的Δ6-脂肪酸延长酶基因(Elovl5，编码300个氨基酸)表达载体，利用PCR技术从本实验室保存的pcDNA3.1-Elovl5质粒中扩增其Elovl5基因片段，以E5-s/E5-a为引物，片段大小为900 bp，程序为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，进行30个循环；最后72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。扩增产物经凝胶电泳检测后进行回收，回收后使用SmaⅠ与SalⅠ进行双酶切，T4 DNA连接酶连入由本实验室前期构建的中间质粒pUC57-Prom A4-SV40 polyA，该载体含有家蚕BmActin启动子，可用于克隆各个待表达的目的基因。连接后得到pUC57-Prom A4-Elvol5-SV40 polyA，酶切并测序，Blast程序比对后再从该片段中扩增其PromA4-Elvol5-SV40 polyA片段，以pBA-s/pBA-a为引物，扩增程序为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s；60 ℃退火20 s，72 ℃延伸50 s，进行30个循环；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。扩增产物经凝胶电泳检测后纯化回收，AscⅠ单酶切后使用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸化，连入带有绿色荧光蛋白的转座子载体piggyBac-[3×P3-EGFP]，得到果蝇转座子载体pBac[3×P3-EGFP]-Prom A4-Elovl5-SV40 polyA，经筛选和酶切鉴定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列分析利用Blast程序完成。引物序列见表 1。
| Primer name | Primer sequence (5′-3′) |
| E5-s | ATTCCCGGGATGGAACATTTTGATGCATCACTTAG |
| E5-a | TTAGTCGACTCAATCCTTCCGCAGCTTCC |
| pBA-s | TTAGGCGCGCCTCATCTTGTCACACCTACATCTTACTA |
| pBA-a | TTAGGCGCGCCATTTACGCGTTAAGATACATTGATG |
| mGapd-s | CTTGAACGGTAAACTCACTGGTATGG |
| mGapd-a | TGGAGACGACTTCTTCATCGGTGTAG |
将构建成功的带有Elvol5片段的转座子载体pBac[3×P3-EGFP]-Prom A4-Elovl5-SV40 polyA、转座酶辅助质粒pH A3PIG，送至中国科学院生物化学与细胞生物学果蝇资源与技术平台在果蝇胚胎中进行显微注射。孵化后为G0代转基因果蝇，将其分出单只雌、雄蝇与野生型果蝇杂交，产生杂交的转基因果蝇，培育至稳定遗传。随机挑取上述Elovl5转基因果蝇的卵、幼虫及成蝇，成蝇期果蝇使用CO2麻醉，使用倒置荧光显微镜，采用波长460-490 nm的激发光，筛选出在眼睛或其他部位特异激发绿色荧光的转基因阳性个体，并观察果蝇各个时期的荧光表达，对基因的转入与否进行初步分析。同时将转基因果蝇与对照组果蝇培养基中均添加含有浓度为0.5%的α-亚麻酸(ALA，C18-PUFAs)的紫苏籽油作为底物，经果蝇摄食后进行后续多不饱和脂肪酸GC检测。
1.2.3 RT-PCR鉴定目的基因表达收集转基因果蝇与对照组果蝇各100只用于RT-PCR实验。总DNA/RNA提取按照天根生化科技(北京)有限公司相关说明书进行。果蝇RNA提取后先进行定量，再将RNA中的mRNA反转录成cDNA，取1 μL反转录产物与果蝇总DNA进行PCR检测，使用引物为E5-s/E5-a，扩增程序为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，64 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，进行30个循环；最后72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。RNA内参引物为mGapd-s/mGapd-a，扩增程序同上，PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察目的基因的整合情况及其表达。引物序列见表 1。
1.2.4 果蝇多不饱和脂肪酸的提取和甲脂化取摄食4周0.5%的α-亚麻酸(ALA，C18-PUFAs)的果蝇，未进行性别区分，Elvol5转基因型果蝇与对照组果蝇各150只，置于微量反应瓶，进行组织匀浆。加入1 mL 14%的三氟化硼(含0.005% BHT)，充分混匀并充入氮气，盖紧盖子100 ℃加热反应1 h，冷却后加1 mL双蒸水和1 mL正己烷，充分混匀，将反应瓶中液体转移至5 mL玻璃离心管中，3 000 r/min离心5 min，吸取上清，使用氮气吹干浓缩，-20 ℃保存，每组进行3次重复试验。
1.2.5 GC分析本研究使用的分析仪器为HP5890气相色谱仪，色谱柱为Omegawax毛细管柱(Supelco 30 m× 0.25 mm I.D.)，检测器：FID；进样器：分流进样分流比为20︰1；柱温：200 ℃；进样器温度：260 ℃；检测器温度为280 ℃。运行程序升温条件，初始炉温为200 ℃，以1.5 ℃/min升温至260 ℃，载气为氮气(99.999%)。进样量：1 μL；将样品与标准品在同一根色谱柱上用相同色谱条件进行分析，获得二者色谱图后进行对照定性定量分析，单个样品检测运行时间约为40 min，检测使用参数参考Kang等的报道[16]。
1.2.6 图像采集及统计分析图像采集处理：用N2000色谱工作站采集图谱，并处理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用多不饱和脂肪酸甲酯标准样品来进行鉴定。采用面积归一法求各色谱法的面积，得出样品中各脂肪酸的含量，每一种脂肪酸百分含量按其峰面积比所有脂肪酸面积总和而计算获得。脂肪酸含量等结果采用x±s(算术平均值±标准方差)表示。组间数据比较采用Student’s t-test，以P < 0.05作为统计学差异显著性的判断标准。
2 结果与分析 2.1 Elovl5表达载体的构建如图 1所示，从本实验室保存的pcDNA3.1- Elvol5质粒中扩增出Elovl5目的片段，PCR产物长度900 bp (图 2A)。纯化回收后同本实验室前期构建的中间质粒pUC57-Prom A4-SV40 polyA同时使用SmaⅠ与SalⅠ进行双酶切，后连接得到pUC57-Prom A4-Elvol5-SV40 polyA，大小为4 594 bp，经双酶切、测序鉴定，后将其Prom A4-Elvol5- SV40 polyA扩增出来，PCR产物小大为1 884 bp，纯化回收先进行AscⅠ单酶切后用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化，连入转座子表达载体piggyBac-[3×P3-EGFP]，经过筛选和酶切鉴定获得阳性克隆，测序比对目的基因未发生突变，最终得到piggyBac-[3×P3-EGFP]-Prom A4-Elovl5-SV40 polyA，该载体大小为8 384 bp (图 2B)。
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| 图 1 Elovl5表达载体构建示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the construction of Elovl5 transgene expression vector. |
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| 图 2 Elovl5转基因表达载体构建电泳图 Fig. 2 Elovl5 transgenic expression vector construction gel electrophoresis. (A) M: marker Ⅲ; 1: PCR amplification of Eovl5 gene; 2: extracted plasmid recombinant; 3: restriction analysis by double cut with SmaⅠand SalⅠ. (B) M: marker Ⅳ; 1: PCR amplification of Prom A4-Elvol5-SV40 polyA gene; 2: extracted plasmid recombinant; 3: restriction analysis by AscⅠ. |
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将构建的piggyBac转座子载体pBac[3×P3-EGFP]-Prom A4-Elovl5-SV40 polyA与辅助质粒pHA3PIG送至果蝇资源与技术平台进行显微注射后，共获得9个转基因果蝇品系(A0711-A0719)，将其培育至稳定遗传后，分别挑选阳性果蝇个体，于胚胎发育后期开始进行连续的荧光检测，该载体中含有眼部特异性表达3×P3启动子，观察发现在果蝇胚胎期时整个果蝇卵发出明显的绿色荧光(图 3A、E)，幼虫的整个时期均有绿色荧光的表达(图 3B、C、F、G)，到达果蝇成蝇期时只在其眼部观察到明显的绿色荧光(图 3D、H)，结果表明该表达载体中增强型绿色荧光蛋白可在果蝇的整个生长阶段表达。
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| 图 3 转基因果蝇的绿色荧光蛋白检测 Fig. 3 Green fluorescent protein detection of transgenic fruit flies. A-D (under white light): Transgenic Drosophila eggs; transgenic Drosophila larva; transgenic Drosophila 3rd instar larva; transgenic Drosophila adult fly. E-H (under fluorescence): Transgenic Drosophila eggs; Transgenic Drosophila larva; Transgenic Drosophila 3rd instar larva; Transgenic Drosophila adult fly. |
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将果蝇培育至稳定遗传后，在荧光显微镜下已观察到明显的绿色荧光，说明表达载体已成功转入果蝇体内，此时收集9个品系转基因果蝇(A0711-A0719)与对照组果蝇(野生黑腹果蝇W1118)各取100只，同时提取总DNA与RNA，用于RT-PCR分析。结果表明，在9个转基因品系中，DNA水平全部检测到目的基因，大小为900 bp (图 4A)，同阳性对照一致，外源基因已成功整合进入果蝇体内，由于昆虫转座系统的遗传效果存在不稳定性，本试验中在RNA水平只有2个转基因品系果蝇(A0712、A0718)成功表达目的基因，凝胶电泳检测与阳性对照大小一致(图 4B)。
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| 图 4 目的基因在果蝇中的整合情况及其表达 Fig. 4 Integration and expression of target genes in Drosophila. (A) M: DNA marker D2000; 1: negative control; 2: positive control; 3: wild-type Drosophila DNA; 4: genetically modified Drosophila (A0712) DNA. (B) M: DNA marker D2000; 1: negative control; 2: positive control; 3: wild-type Drosophila RNA; 4: genetically modified Drosophila (A0712) RNA. (C) M: DNA marker D2000; 1: negative control; 2: wild-type Drosophila internal control; 3: transgenic Drosophila (A0712) internal control. |
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在分子水平通过RT-PCR的检测后，确认Elovl5基因在转基因果蝇体内获得表达。提取摄食4周0.5%的α-亚麻酸(C18-PUFAs)的转基因果蝇与对照组果蝇脂肪酸，不分性别随机挑选，利用GC进行检测并统计分析。结果如图 5所示，色谱图中横坐标为各种脂肪酸出现的保留时间，不同的脂肪酸出现的时间不一样，由此可将每种脂肪酸在GC图谱中区分开来(图 5)，通过与标准样品对比就可以准确判定各个色谱峰所代表的不同脂肪酸的具体种类。GC检测需具备已知标准品，将样品与标准品在同一根色谱柱上用相同色谱条件进行分析，获得二者色谱图后进行对照定性定量分析，每种色谱峰的高低则表明该脂肪酸的含量，按照峰面积计算出它的含量，进而可计算出每一种脂肪酸的百分含量(表 2)。表中这些数据表明，转基因果蝇(A0712)与野生型果蝇(A0772)相比，转基因型果蝇(A0712)体内的18C-PUFAs相对减少3%-4%，而C20-PUFAs与更长链的22C-PUFAs出现从无到有的改变，分别较对照组增加2.8%、1.94%，该结果表明在转基因果蝇中Elovl5基因的表达显著地促使其体内18C多不饱和脂肪酸向着更长链多不饱和脂肪酸的生物合成方向转化。
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| 图 5 Elovl5转基因果蝇体内脂肪酸GC分析 Fig. 5 GC analysis of fatty acids in Elovl5 transgenic Drosophila. (A) Wild-type Drosophila (0.5% ALA) active. (B) A0712 Elovl5 transgenic Drosophila (0.5% ALA) active. |
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| PUFAs | Control group | Test group |
| 12:00 | 3.18±0.23b | 3.85±0.27a |
| 14:00 | 12.17±0.72 | 11.83±0.55 |
| 16:00 | 19.29±1.04 | 19.12±0.98 |
| 16:1n-7 | 15.16±0.62a | 13.38±0.57b |
| 18:00 | 1.74±0.16b | 2.39±0.21a |
| 18:1n-9 | 21.38±1.32 | 19.68±1.03 |
| 18:2n-6 | 14.24±0.81b | 16.31±0.85a |
| 18:3n-3 | 12.85±0.65a | 8.70±0.59b |
| 20:1n-9 | 0 | 1.60±0.22a |
| 20:2n-6 | 0 | 0.68±0.21a |
| 20:3n-3 | 0 | 0.52±0.09a |
| 22:2n-6 | 0 | 0.15±0.05a |
| 22:3n-3 | 0 | 1.79±0.24a |
| Notes: values are means of three measurements; values for each fatty acid with different superscript differ significantly (P < 0.05) between wild-type Drosophila (Control group) and A0712 Elovl5 transgenic Drosophila (Test group). | ||
多不饱和脂肪酸是人体生命活动中不可或缺的重要物质，尽管人体自身能够利用食物中的亚油酸(18︰2n-6)和α-亚麻酸(18︰3n-3)分别合成花生四烯酸(Arochidonic Acid，ARA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)以及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)等长链PUFAs，但合成效率极低，仅能满足人体最基本的需求[17-18]。在当今广泛的、不当的食物结构模式(即摄入过多的高度饱和的动物油脂和富含亚油酸的植物油脂)下，人体中ω-3PUFAs尤其是DHA以及EPA成为了营养短板，从食物来源中补充DHA、EPA对于健康如防止心血管疾病、大脑的保健、防癌、抗炎症等非常重要[19-20]。此外，加上在婴幼儿食品中添加应用这个广大的市场需要，DHA、EPA以及ARA等长链多不饱和脂肪酸的资源开发已成为研究的热点[21]。目前，C20-PUFAs及更长链的多不饱和脂肪酸主要来源是深海鱼油，由于渔业资源正在逐步耗竭，海洋污染加剧，从鱼油中获得的方法已经不能满足市场和食品安全的需求。
随着世界人口的不断增长，食物的生产速度已经开始落后于人口的增长速度。可食性昆虫的高营养和高生物量使其成为了一种优良的可再生自然资源。以昆虫作为食品已经在一些国家和地区被人们所接受[22-23]。目前，昆虫食品的关注点往往在于其高含量的蛋白质，而忽视了其中所含有的人体必需的另一种营养成分——不饱和脂肪酸[24]。研究表明，昆虫含有丰富的不饱和脂肪酸，尤其是碳链长度为18的亚油酸、亚麻酸等[6]。由于昆虫体内缺乏合成类固醇类物质的酶，昆虫脂肪所含的类固醇类物质很少，其脂肪酸组成非常接近于鱼油，可作为天然的优质营养调和食用油。同样，昆虫体内缺少催化合成18C以上脂肪酸的延长酶以及相应的延长酶[11]，因此昆虫中脂肪酸的合成同高等植物中一样止于C18-PUFAs，而不能继续合成EPA和DHA等[25-26]。随着转基因技术的出现，果蝇等昆虫由于具有独特的生物学优势以及在转基因技术操作上的优势[27]，昆虫中缺少其他生物来源的多不饱和脂肪酸生物合成相关基因(包括数种脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶)将会得到解决。
自从1982年转基因果蝇首次成功以来，转基因昆虫的研究已经取得了很大的进展，随着转座子、遗传标记以及转基因技术的进步，研究领域也由传统的经济昆虫饲养、农林害虫和致病的媒介昆虫的防治扩展到物种进化分析、基因功能分析、昆虫生理学、昆虫生物反应器等方面[28]。研究表明昆虫中的脂肪酸含量尤其是18C-PUFAs含量丰富，昆虫来源的脂肪酸具有潜在的开发优势[10]。与此同时，与昆虫脂肪酸代谢有关的去饱和酶基因与延长酶的鉴定、克隆和功能研究也取得了一定的进展[24]。本研究则将果蝇作为生物模型，通过将来源于小鼠的Δ6脂肪酸延长酶Elovl5基因进行克隆、优化连接到piggyBac转座子载体上，再进行显微注射转移到果蝇胚胎中，成功获得转基因果蝇品系。因载体上的眼部特异性启动子3×P3整合进入果蝇体内，在转基因果蝇成蝇期眼部会出现明显的增强型绿色荧光，观察到在果蝇的胚胎期与幼虫期也显示出绿色荧光蛋白基因的表达，可使CO2麻醉筛选转基因成蝇果蝇的方法更为简便。然而，在昆虫转基因技术中，目前存在着不容忽视的问题。由于昆虫转基因技术通常是通过转座子介导的转座作用实现的，所以不可避免地存在着转基因遗传稳定性的问题，本实验共获得9个转基因果蝇品系，通过RT-PCR检测其转录情况最终只有2个品系成功表达目的基因。
由于酶的催化作用具有高效性，在本研究中，较对照组果蝇相比，GC检测Elovl5转基因果蝇多不脂肪酸的含量有着很大的变化，从只有18C-PUFAs延长到出现20C甚至22C高不饱和长链脂肪酸，结果显示C20-PUFAs含量增加2.8%，C22-PUFAs含量增加1.94%，使得利用果蝇转基因技术生产18C以上的多不饱和脂肪酸成为可能。进而以此种转基因果蝇为模型动物，既可以用于研究多不饱和脂肪酸对果蝇的生长发育、繁殖、变态及PUFAs增多引起的免疫反应等生物学特性的影响，也可以用于研究该模型在C20、C22-PUFAs水平中脂肪酸合成的作用及调控模式、机制，使直接利用哺乳动物来研究多不饱和脂肪酸代谢和调控的传统做法大大简化，也为蝇类及其他资源型昆虫多不饱和脂肪酸功能研究提供一定的参考。
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