多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一种恶性克隆性浆细胞大量增殖所致的血液系统恶性肿瘤，占血液系统恶性肿瘤的10%，主要发病年龄为63-70岁^[1]。近20年来，MM的传统治疗及新药疗法正在不断发展。在新药联合诱导的基础上，进行自体干细胞移植，使得MM病人的治疗疗效及存活时间得到明显改善，但仍不能完全治愈MM。在众多的免疫疗法中，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)免疫疗法已经发展成为一种潜在的抗癌疗法，特别是在复发/难治性多发性骨髓瘤中，表现出很高的缓解率和无进展生存期的延长^[2-6]。CAR是一种人工合成的新型受体，主要由识别并结合肿瘤细胞表面抗原的胞外单链抗体可变片段(Single chain antibody fragment，scFv)、跨膜段和胞内信号转导/激活域组成。其可以特异性识别肿瘤相关抗原，并以非主要组织相容复合物(Major histocompatibility complex，MHC)限制的方式消除肿瘤细胞，克服了肿瘤细胞人类淋巴细胞抗原(Human lymphocyte antigen，HLA)表达下调所致的免疫逃逸，解决了宿主免疫耐受所致的免疫治疗效果差的问题^[7]。第二代/第三代CAR-T细胞在第一代的基础之上加入一个/两个共刺激分子如CD28、4-1BB等从而增强了CAR-T细胞活化、增殖和生存能力。CAR-T疗法在目前的临床试验中已显示出了巨大的治疗潜力，成为肿瘤免疫治疗研究的热点。CAR-T疗法被认为是最具有前景的肿瘤治疗方法之一^[8]。

CS1 (CD2 subset 1)也称为信号淋巴细胞活化家族成员7 (Signalling lymphocytic activation molecule F7，SLAMF7)，是糖基化的细胞表面蛋白和信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族的成员，介导多发性骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞粘附。超过95%的骨髓瘤细胞以独立于细胞遗传学异常的方式表达CS1，而NK细胞、一些T细胞亚群和正常B细胞的表达仍然非常低，在骨髓细胞和大多数健康组织中几乎检测不到^[9-10]。重要的是，在多次化疗后或疾病复发，SLAMF7均只在肿瘤细胞上表达，在造血干细胞上却不表达^[11]，因此它可以作为有希望的肿瘤相关抗原。诱导型共刺激分子(Inducible costimulatory molecule，ICOS)是一种类似于CD28结构的B7受体家族成员，其在活化的T细胞上表达，可明显延长活化T细胞的凋亡周期^[12]。一些研究表明，ICOS的共刺激可提高细胞毒性并有利于Th1/Th2型细胞因子的产生^[12]。

本研究以抗CS1单链抗体为靶向分子，第三代慢病毒为载体来构建靶向CS1的第二代和第三代CAR-T细胞。通过CAR-T细胞表现出针对表达CS1的骨髓瘤细胞的特异且有效的细胞毒性，以此评估其对CS1阳性多发性骨髓瘤细胞免疫治疗的临床应用前景。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

慢病毒载体pLenti-EF1α-lucgfp质粒、包装质粒pMD2.G与psPAX2由本实验构建并保存；质粒抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司；限制性内切酶购自New England Biolabs公司；胶回收试剂盒和去内毒素质粒大提试剂盒购自美国Axygen公司；DNA连接酶购自日本TaKaRa公司；无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技公司；PE抗人CD3抗体、APC抗人CS1抗体、APC-SA流式抗体购自美国BioLegend公司；Bio-CS1蛋白购自ACRO公司；D-(-)-荧光素购自上海甄准生物科技有限公司；琼脂糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司；人肾上皮细胞系HEK293T细胞系购自大连宝生物工程有限公司；人T细胞白血病Jurkat细胞株和人骨髓瘤细胞U266系购自美国ATCC；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、细胞基础培养基DMEM-MEM、RPMI1640及细胞培养其他成分HEPES、D-PBS购自美国Gibco公司；聚凝胺(Polybrene)购自美国Sigma公司；磁珠(Dynabeads^TM Human T-Activator CD3/CD28)购自美国Gibco公司。

1.2 仪器与设备

FACS Aria流式细胞仪购自美国BD公司；PCR仪、电泳装置和凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；MACS分选架购自德国Miltenyi公司；DynaMag^TM-5磁力架购自北京明阳科华生物科技有限公司；细胞培养箱购自Thermo公司；超速离心机购自美国Beckman公司；荧光显微镜和台式高速离心机购自德国Eppendorf公司。

1.3 实验方法 1.3.1 质粒构建

由苏州金唯智生物科技有限公司合成Anti-CS1 scFv序列，将载体pLenti-EF1α-T2A- lucgfp (本实验室保存)用SmaⅠ/MluⅠ双酶切，利用无缝克隆技术将片段和载体连接，37 ℃连接1 h后，转化涂于氨苄抗性LB平板上，通过挑单克隆、抽提质粒、酶切验证后测序鉴定重组载体pLenti-EF1α-CS1 scFv-4-1BB、pLenti-EF1α-CS1 scFv-ICOS和pLenti-EF1α-CS1 scFv-ICOS-4-1BB。以CS1全长cDNA序列(由厦门大学韩家淮实验室赠送)为模板，CS1FOR和CS1REV为引物扩增CS1片段，将载体pLenti-EF1α-T2A-lucgfp (本实验室保存)用SmaⅠ/EcoRⅠ双酶切，利用无缝克隆技术将片段和载体连接，37 ℃连接1 h后，转化涂于氨苄抗性LB平板上，通过挑单克隆、抽提质粒、酶切验证后测序鉴定重组载体pLenti-EF1α-CS1-T2A-lucgfp质粒，用于CS1阳性靶细胞的制备。根据GenBank中基因序列设计PCR扩增引物，见表 1。

1.3.2 慢病毒包装与滴度检测

分别将以上3种质粒与辅助质粒pMD2.G与psPAX2通过磷酸钙试剂共转染至HEK293T细胞，转染后48 h换液，收取培养上清，72 h后再次收取培养上清，过0.45 μm MILLEX^®-HP针式滤器。将病毒原液4 ℃、32 000 r/min超速离心2 h，将沉淀溶解在X-VIVO培养液中。

96孔尖底板每孔铺0.5×10⁶个Jurkat细胞，200 μL/孔，将浓缩的病毒液稀释100倍，按1︰50、1︰500和1︰2 000的比例加入各孔400 μL、40 μL和10 μL。32 ℃、1 200×g离心90 min。4 h后用DPBS将细胞洗一次后铺于12孔板，转导48 h后用流式细胞术检测。圈出阳性细胞群后，计算病毒滴度。

病毒滴度T=(P×N)/(D×V)

T为滴度(TU/mL)，P为流式阳性细胞比例，N为转导的细胞数，D为稀释倍数，V为转导时的体积。

1.3.3 CAR-T细胞的制备和扩增

利用外周血淋巴细胞分离液Ficoll提取健康人外周血中单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，按照T细胞与磁珠数量之比为1︰1加入α-CD3/α-CD28抗体包被的磁珠分离人T细胞，并置于含10%血清和100 μg/mL IL-2的AIM-V培养基中培养。24 h后，计数活化的人CD3⁺ T细胞，于每个孔加入0.1×10⁶个T细胞和感染复数(Multiplicity of infection，MOI)=40的病毒浓缩液(pLenti-CS1CAR-4-1BB、pLenti- CS1CAR-ICOS和pLenti-CS1CAR-ICOS-4-1BB)，培养基补齐至200 μL，并于每孔加入polybrene (1︰2 000)，32 ℃、1 200 r/min离心90 min，结束后置于37 ℃细胞培养箱中，4 h后换液。离心换液后继续培养，每隔2-3 d补充培养基或者传代。取转导5 d后的T细胞，在DynaMag^TM-5磁力架上将磁珠脱掉，2 500 r/min离心3 min收集细胞。用FACS (由50 mL PBS加1 mL胎牛血清配制而成)洗涤细胞，离心弃上清液；用Biotin-CS1蛋白4 ℃孵育15 min后，用FACS洗2遍，然后加入APC-SA流式抗体4 ℃孵育15 min，用FACS洗2遍，弃掉上清，200 μL FACS重悬至流式管，用流式细胞仪检测T细胞表面CAR的表达情况。

1.3.4 靶细胞的构建

用本实验室现有的pLenti-EF1α-T2A-lucgfp质粒包装慢病毒，收取48 h病毒原液用于感染细胞。IM9细胞离心计数后用含10% FBS的RPMI-1640完全培养基稀释成1×10⁶/mL，96孔平底细胞培养板每孔铺0.2×10⁶细胞，200 μL/孔。按1︰5的比例每孔加入40 μL病毒，1 200×g、32 ℃离心90 min进行离心转导。37 ℃、5% CO₂培养箱培养4 h后将细胞转移至24孔板扩大培养。当细胞培养至足够数量时通过流式细胞仪分选出GFP阳性的细胞株扩大培养。

1.3.5 生物发光法检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力

基于生物发光的杀伤实验：①将转导后的T细胞培养5 d后，1 500 r/min离心5 min后用Buffer 1 (DPBS含5% FBS)重悬，置于DynaMag^TM-5磁力架上进行脱磁。② 2 min后将细胞悬液慢慢吸出，1 500 r/min离心5 min后用AIM-V完全培养基重悬，然后计数后取1/10流式检测其CAR-T表达率。③ IM9-lucgfp细胞离心后进行细胞计数，每孔按照0.1×10⁶的细胞铺板。④基于CAR的表达率计算了CAR-T细胞的数量，CAR-T细胞与IM9-lucgfp细胞的比例按照1︰1、2︰1、5︰1和10︰1的比例将CAR-T细胞加入到IM9-lucgfp细胞所在的孔中(对照组T细胞的数目与CAR-T细胞的数目相同)。⑤另设2个IM9-lucgfp细胞孔。一种在没有T细胞或CAR-T细胞的全培中培养。另一个孔用ddH₂O将IM9-lucgfp细胞重悬，分别用作荧光强度的最大和最小背景值(每个组设3个复孔)。⑥ 37 ℃培养箱共培4 h后，将96孔板取出，1 500 r/min离心5 min。⑦弃去上清，用新鲜完全培养基将细胞进行重悬。⑧ D-(-)-荧光素按照1︰200的比例加入，轻柔混匀，转入不透光的白色96孔板中。避光10 min后用酶标仪检测荧光值。⑨计算CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的裂解率。

裂解率=(Max-V)/(Max-Min)×100%

Max为不加T细胞的IM9细胞孔的荧光值；Min为ddH₂O重悬的IM9细胞孔的荧光值；V为实验孔测得的荧光值。

1.3.6 统计学处理

结果代表至少3次独立实验，数据统计分析和图表制作均采用GraphPad Prism 6.0，实验数据以x±s表示，数据统计使用非配对t检验分析进行，P < 0.05时差异被认为具有统计学意义(*：P < 0.05，**：P < 0.01，***：P < 0.001，****：P < 0.000 1)。

2 结果与分析 2.1 表达载体的构建与鉴定

本研究首先构建了靶向CS1的CAR分子，包括第二代和第三代CAR分子。其中第二代CAR分子由CD8信号肽、Anti-CS1单链可变片段、人CD8α的铰链和TM区、共刺激分子4-1BB或ICOS和CD3ζ链依次串联组成(图 1A-B)。第三代CAR分子则在第二代的基础上增加一个共刺激分子, 即同时含有4-1BB和ICOS共刺激因子(图 1C)。通过分子克隆技术，我们成功构建了pLenti-CS1CAR-4-1BB、pLenti-CS1CAR-ICOS和pLenti-CS1CAR-ICOS-4-1BB重组质粒，并通过NcoⅠ酶进行酶切鉴定，结果得到2条条带，符合预期结果(图 2)。

2.2 CS1-CAR-T细胞的成功制备

将pLenti-CS1CAR-4-1BB、pLenti-CS1CAR- ICOS和pLenti-CS1CAR-ICOS-4-1BB重组质粒包装成慢病毒后感染人CD3⁺ T细胞，未感染组作为对照组，5 d后收集细胞并用流式细胞术检测各组细胞中CAR的阳性表达率，所得结果显示，Anti-CS1-4-1BB、Anti-CS1-ICOS、Anti-CS1-ICOS- 4-1BB慢病毒载体转导效率分别为82.6%、78.8%和41.9%，并对表达情况进行分析，结果有统计学意义(图 3A)。含Anti-CS1-4-1BB、Anti-CS1- ICOS、Anti-CS1-ICOS-4-1BB慢病毒感染人CD3⁺ T细胞后，记录其在感染后的细胞扩增情况(图 3B)。

2.3 靶细胞的构建

为了验证CAR-T细胞对于CS1阳性肿瘤细胞的杀伤能力，用pLenti-EF1α-T2A-lucgfp质粒包装慢病毒感染人骨髓瘤细胞IM9，未感染组作为对照组，构建高表达CS1的IM9-lucgfp靶细胞，通过流式细胞术检测靶细胞IM9-lucgfp表达CS1抗原和GFP的情况，结果分别为80%和93% (图 4)。

2.4 CAR-T细胞对阳性靶细胞的体外杀伤效果

以3种不同的CAR-T细胞(Anti-CS1-4-1BB、Anti-CS1-ICOS、Anti-CS1-ICOS-4-1BB)和对照T细胞作为效应细胞，通过不同效靶比(效应细胞︰肿瘤靶细胞)，利用生物发光方法检测它们对高表达CS1的IM9-lucgfp靶细胞的杀伤作用。如图 5所示，在不同效靶比条件下，以ICOS为共刺激因子及以4-1BB为共刺激因子的第二代CAR-T抗肿瘤活性相似。在效靶比为1︰1时，Anti-CS1-ICOS CAR-T细胞比Anti-CS1-4-1BB CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的杀伤比例高11%，且两者之间有显著差异(P < 0.05)，故在特定条件下，以ICOS作为共刺激分子的靶向CS1的CAR-T细胞可能比以4-1BB作为共刺激分子的更具有杀伤潜力。在相同效靶比情况下，靶向CS1的第三代CAR-T细胞比第二代CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的杀伤比例低，且在效靶比1︰1、2︰1和5︰1时两者之间都有显著性差异(P < 0.05)。3种Anti-CS1 CAR-T细胞在效靶比为10︰1时能有效杀伤IM9-lucgfp细胞并且杀伤比例在85%以上，显著高于对照组(P < 0.000 1)。随着效靶比的不断提高，Anti-CS1-ICOS CAR-T细胞杀伤优势并未再显示出来，这可能和靶细胞的裂解率已至饱和有关。以上结果表明靶向CS1的第二代和第三代CAR-T细胞，都可高效杀伤高表达CS1的肿瘤细胞，且在本研究中，靶向CS1的第二代CAR-T细胞较第三代对肿瘤细胞的杀伤效力更强。

3 讨论

基于CAR-T细胞的免疫过继疗法治疗恶性肿瘤有着巨大的潜力，CAR-T细胞治疗在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗中展现出良好的治疗效果。但这种临床的成功性较难应用到实体瘤上，有两点原因：第一，缺乏特异性抗原，找不到特异性的靶点，CAR-T在发挥作用时就会侵害正常组织。第二，不同于血液肿瘤，CAR-T必须侵入实体瘤内部才能发挥作用。而且进入肿瘤后，由于实体瘤异质性和肿瘤微环境的存在，可能抑制免疫细胞发挥作用^[13-14]。

CAR-T的功能受所选scFv的亲和力、铰链区的大小、信号传导结构域的组合方式、修饰的T细胞亚群等诸多因素的影响^[15]。有研究探讨了CAR-T胞内域嵌入的共刺激分子在协调抗肿瘤免疫中的作用，研究结果表明，B7受体家族的共刺激分子(CD28或ICOS)和TNF受体家族的共刺激分子(OX40或4-1BB)能够促进IFN-γ、TNF-γ和GM-CSF的产生^[16]。Finney等^[12]证明，诱导型共刺激分子ICOS增强了TCR介导的抗原特异性靶细胞裂解。我们的研究结论与该发现一致，将ICOS插入CAR中有利于CAR-T细胞裂解靶细胞。CAR-T细胞的主要关注点是CAR-T细胞可能会识别正常细胞表达的抗原，这种非特异的靶向免疫损伤可能会引起不良反应，甚至是致命的。因此，选择在肿瘤细胞中特异性表达但不在正常细胞中表达的靶抗原是极其重要的。CS1在原发性骨髓瘤细胞和大多数骨髓瘤细胞系中均呈高水平表达，并且在正常的固体组织中缺乏表达^[17]。目前针对CS1制备的CAR-T，治疗复发/难治性MM具有极好的应用前景，但将ICOS作为共刺激分子的报道很少。本研究比较了第二代和第三代CAR-T细胞的杀伤功能。研究结果表明，相同效靶比下，第三代CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的能力较第二代弱。在第二代CAR-T细胞中，以ICOS作为共刺激分子的CAR-T细胞与已经报道过的以4-1BB作为共刺激分子的CAR-T细胞都能有效地杀伤肿瘤细胞，并且在效靶比为1:1时，两者间有显著性差异(P < 0.05)。这说明，以ICOS作为共刺激分子的CAR-T细胞更具杀伤潜力。

理论上，第三代CAR-T细胞在第二代的基础上增添了一个共刺激分子，会进一步加强TCR/CD3信号，对其靶细胞的杀伤能力越强。我们的研究结果表明，在相同效靶比情况下，靶向CS1的第三代CAR-T细胞比第二代CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的杀伤比例低，且在效靶比1︰1、2︰1、5︰1和10︰1时两者之间都有显著性差异(P < 0.05)。最近，有研究团队^[18]比较了不同的CAR-T细胞，它们的靶抗原一致，但是CAR的胞内结构和抗肿瘤活性不同。结果显示，只有第二代CAR-T能够刺激类似于天然受体的CD3ζ的表达。而且，CD3ζ受体的活性取决于T细胞胞内结构域的大小，而不是依赖于共刺激分子的选择或者细胞外结构域的设计，该研究表明，第二代CAR与第三代CAR相比，可以激活其他CD3信号传导源，这可能有助于提供更强烈的信号传导和更高的抗肿瘤效果^[18]。目前关于第二代CAR-T和第三代CAR-T孰强孰弱尚无一致定论，增加的共刺激分子可能可以联合各自的信号转导通路从而增强CAR-T细胞抗肿瘤效应。增加多个共刺激因子也可能因为改变CAR-T细胞胞内段结构域长度，导致原有的信号减弱或不能传递，从而减弱第三代CAR-T的抗肿瘤效应。相同的共刺激分子在不同靶向CAR-T细胞中呈现的效应也可不同，例如有研究人员用共刺激分子CD28和4-1BB构建靶向前列腺干细胞抗原(Prostate stem cell antigen，PSCA)的CAR-T，研究显示，第二代CAR-T比第三代CAR-T更有效^[19]。另一研究团队同样通过CD28和4-1BB构建靶向CD19的CAR-T细胞对非霍奇金淋巴瘤进行临床试验，研究结果显示，第三代CAR-T较第二代效果更好^[20]。故第二代和第三代CAR-T的比较，需要根据其疗效决定取舍，这些研究结果对CAR-T细胞临床治疗有较好的指导和借鉴意义。具体特定的第二代和第三代CAR-T所致的抗肿瘤效应不同，其机制仍有待进一步探究，这对未来提高CAR-T的免疫治疗有着非常重要的意义。

本研究成功构建了靶向CS1的CAR-T细胞，比较了第二代CAR-T和第三代CAR-T杀伤肿瘤细胞的能力，证明了CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤的可行性和有效性，下一步本研究拟进行动物实验验证Anti-CS1-CAR-T在体内的杀瘤效果。