兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)和兔粘液瘤病毒(Myxomavirus，MYXV)是严重危害家兔及其祖先欧洲野兔-穴兔(Oryctolagus cuniculus)的两种病毒^[1-3]。RHDV于1984年首次在我国发现，随后世界各地也相继有该病毒的相关报道，是导致兔出血症病(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)，俗称兔瘟的病原^[2-3]。该病属于烈性、致死性传染病，感染个体通常在48–72 h内死亡，致死率为100%^[3-4]。RHDV属于杯状病毒科(Caliciviridae)、兔病毒属(Lagovirus)，为单股正链RNA病毒，其基因组长度为7.4 kb。RHDV编码一257 kDa大小的多聚蛋白，后经自身编码的蛋白水解酶裂解，得到功能较成熟的p16、p60、p43、p72和VP60蛋白，其中VP60既构成病毒衣壳，也是制备抗病毒疫苗的主要抗原^[3-5]。MYXV属于痘病毒科(Poxviridae)野兔痘病毒属(Leporipoxvirus)，为双链DNA病毒，病毒基因组长度约为163 kb，病毒感染细胞后在细胞质内进行复制和装配，可引起兔粘液瘤病(Myxomatosis)^[1]。MYXV对家兔和欧洲野兔-穴兔(Oryctolagus cuniculus)易感，致死率可达95%以上，可通过吸血昆虫如蚊子、跳蚤等媒介传播，但是棉毛兔属(Sylvilagus)的美洲棉尾兔(S. brasiliensis)和林兔(S. bachmani)对该病毒不易感，是其自然宿主。除兔对MYXV易感外，其他动物和人类不易感^[1-2]。因此，RHDV和MYXV不仅对家兔养殖业造成了极大的经济损失，也导致了家兔的祖先穴兔在原产地数量大大减少，如葡萄牙和西班牙在近年已经分别把穴兔列为近危物种和易危物种，所以加强其疫苗的研发显得十分必要^[2]。

鉴于RHDV尚未有合适的体外细胞培养系统，这限制了减毒或灭活疫苗的开发。但是，针对RHDV的唯一结构蛋白基因vp60的亚单位疫苗和病毒载体疫苗的研发取得了很大的进展^[6-10]。本研究根据兔粘液瘤病毒具有的痘病毒特点，利用其胸腺激酶基因TK作为同源重组的靶基因进行重组痘病毒载体的构建，进而为后续疫苗的研发奠定基础^[11-14]。我们以MYXV病毒TK基因作为靶基因，首先构建含有TK上下游基因、MYXV病毒p7.5启动子、RHDV的衣壳蛋白VP60以及GFP筛选标记的穿梭载体p7.5-VP60-GFP；同时，选择毒力适宜的MYXV毒株为亲本病毒感染体外培养的RK13细胞，继而转染穿梭质粒p7.5-VP60-GFP，利用同源重组的原理，使野生型MYXV病毒的TK基因与穿梭质粒的TK基因进行同源重组，最后以插入的gfp基因为筛选标记，利用空斑筛选法，在荧光显微镜下筛选出在RK13细胞中表达GFP的重组病毒rMV-VP60-GFP。经PCR扩增和Western blotting法对重组病毒进行的鉴定表明，vp60基因成功插入MYXV基因组中，并且感染细胞后可以表达VP60。

兔肾细胞系RK13、大肠杆菌DH5α和质粒pEGFP-N1、pMAL-VP60 (vp60基因PCR片段，经EcoRⅠ/Hind Ⅲ酶切后，克隆入pMAL-c2X载体)、pBluescript Ⅱ SK(+)均为本实验室保存；兔粘液瘤病毒FS98/Lau和RHDVcDNA由法国Bio Espace公司提供；CsCl梯度离心后的VP60蛋白由本实验室保存；免疫用日本大耳白兔购自湖北省疾控中心。

High Pure Viral Nucleic Acid Kit购自瑞士Roche公司；转染试剂Lipofectamine™均购于Invitrogen公司；限制性内切酶购自NEB公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自Proteintech公司；蛋白酶K购自Roche公司。

将本实验室保存的重组质粒pMAL-VP60转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落接种于含Amp的LB中，经过夜培养活化后；次日，取活化后菌液以1︰100加入新鲜LB培养基，并置于37 ℃、220 r/min继续培养约2 h，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37 ℃继续培养4 h，待SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达情况后，进行大规模诱导表达，超声波破碎，12 000 r/min离心后收集上清液，0.4 μm滤膜除杂，Amylose•Bind™树脂孵育并进行亲和层析。

取约1.5 mg重组蛋白MBP-VP60加入适量完全弗氏佐剂至4.5 mL，首次免疫(500 μg重组蛋白)采用腘窝淋巴结注射新西兰大白兔，然后，分别于2周和4周后采用背部皮下多点注射各加强免疫一次(500 μg重组蛋白/次)，并于第2次免疫后取血，利用本实验室保存的CsCl梯度离心纯化的VP60蛋白进行Western blotting鉴定，鉴定正确后一周内颈动脉取血，分装放于-80 ℃保存，成功制备多克隆抗体。

以pBluescript SK Ⅱ(+)为载体，利用BamHⅠ、EagⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、SmaⅠ和XhoⅠ这些酶切位点，分步构建同时插入了同源重组的两臂TK up和TK down以及痘病毒晚期启动子p7.5和RHDV结构蛋白VP60的重组型质粒p7.5-VP60，将酶切验证后的质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司测序进一步确证。运用重叠延伸法扩增出p7.5-GFP基因，利用酶切位点SacⅠ，在重组质粒p7.5-VP60中反向插入p7.5-GFP基因(相对于p7.5-VP60)。从而获得在同源臂TK up和TK down之间反向插入p7.5-GFP和p7.5-VP60的穿梭质粒p7.5-VP60-GFP，待酶切验证后，将构建的质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司测序进一步确证。

图 1 穿梭质粒p7.5-VP60-GFP的构建策略 Fig. 1 Construction strategy of the shuttle plasmid p7.5-VP60-GFP.

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利用空斑法^[15]测定MYXV病毒滴度，以MOI=1感染生长于24孔板中的单层RK13细胞，置于37 ℃、5% CO₂的条件下培养2 h，移除含病毒培养基，加入制备好的转染液(含2 μg p7.5-VP60-GFP和6 μL Lipofectamine)，具体操作按照Invitrogen操作手册，2–4 d后荧光显微镜观察转染结果并收集病毒液用于后续筛选纯化。

用经过同源重组得到的重组型病毒和野生型病毒的混合液感染六孔板中的单层细胞，2 h之后，移除培养基，加入含有0.6%琼脂糖的新鲜培养基，待其凝固之后，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养3–4 d后，利用筛选标志GFP (重组型病毒能够表达GFP，野生型病毒无GFP)在荧光显微镜下观察并圈定能够发出绿色荧光的空斑，挑取该空斑，用于新一轮的筛选。重复上面5次筛选步骤，以便得到纯的重组型rMV-VP60-GFP病毒。

将收集的重组型病毒rMV-VP60-GFP和野生型病毒分别感染RK13细胞，取一部分提取细胞总蛋白，Western blotting检测RHDV结构蛋白VP60的表达(一抗：VP60抗体)；同时，待细胞大量死亡后收集病毒液，利用High Pure Viral Nucleic Acid Kit提取的病毒基因组DNA (参照Roche公司的操作手册)作为模板进行vp60基因的PCR鉴定，所用引物为vp60-F2/R2 (表 1)用于扩增vp60的部分片段，大小为402 bp。

将制备好的重组病毒rMV-VP60-GFP (10⁵ PFU/mL)，注射日本大耳白兔(1 mL/只，共4只，雌雄各2只)，观察并记录注射重组病毒后兔粘液瘤病症出现及变化情况，待症状全部消失后，注射病毒毒力和致死率最强的MYXV病毒株Lau，观察重组病毒产生抗体的保护效果。

按照方法1.2中的步骤，表达与纯化MBP-VP60融合蛋白，同时进行SDS-PAGE和Western blotting分析验证。如图 2所示，成功纯化到重组MBP-VP60蛋白。

图 2 融合蛋白MBP-VP60的表达纯化(A)与Western blotting鉴定(B) Fig. 2 Expression and purification of the MBP-VP60 fusion protein (A) and Western blotting analysis (B). 1: protein marker; 2: pMAL-c2X (induced); 3: pMAL-VP60 (non-induced); 4: pMAL-VP60 (induced); 5: purified MBP-VP60.

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为了验证制备的MBP-VP60多抗血清的特异性，利用本实验室保存的来源于重组VP60杆状病毒制备的并经过CsCl梯度离心后的VP60蛋白进行Western blotting分析，结果如图 3所示，制备的多抗血清成功检测到纯化的VP60蛋白。

图 3 VP60抗血清的验证 Fig. 3 Identification of anti-VP60 sera. 1–5: purified VP60 protein with CsCl gradient centrifugation.

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利用亲本病毒MYXV感染RK13细胞2 h后，将穿梭质粒p7.5-VP60-GFP转染RK13细胞，24 h后荧光显微镜观察GFP表达情况，收集荧光最强孔内的混合病毒液，用于空斑筛选纯化，反复进行5次空斑筛选之后得到的病毒进行空斑检测，发现所有的空斑均能检测到绿色荧光，最后挑选荧光强的空斑，重新感染RK13细胞进行后续的重组病毒扩大和鉴定。结果表明，成功筛选并纯化到重组型病毒rMV-VP60-GFP (图 4)。

图 4 重组病毒空斑形成的荧光显微镜观察鉴定 Fig. 4 Identification of the recombinant virus plaque formation by fluorescence microscopy. Left: white light; right: blue excitation.

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为了验证vp60基因是否也被成功插入重组病毒基因组中，以病毒液中提取病毒基因组DNA为模板，利用vp60检测引物(vp60-F2/R2)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测显示，PCR扩增出约400 bp的目的条带，与阳性对照(p7.5-VP60-GFP为模板)结果一致，而阴性对照(以野生型MYXV FS98基因组DNA为模板)没有检测到任何条带(图 5)。该结果表明，重组型病毒rMV-VP60-GFP的基因组中插入了vp60。

图 5 重组病毒的PCR鉴定 Fig. 5 PCR identification of the recombinant virus. 1: 100 bp DNA marker; 2: recombinant virus; 3: FS98 (WT); 4: p7.5-VP60-GFP.

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为了进一步分析插入重组病毒基因组的vp60能否顺利表达，利用制备的抗VP60多抗血清针对VP60的表达情况进行Western blotting检测，结果显示，重组病毒感染RK13细胞后VP60蛋白得到了表达(图 6)。

图 6 Western blotting检测VP60在重组病毒感染的RK13中的表达 Fig. 6 Western blotting analysis of the VP60 expression in infected RK13 cells with recombinant virus. rMV-VP60-GFP. 1: protein marker; 2–8: recombinant virus rMV-VP60-GFP; 9: FS98 (WT).

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由于缺乏野生型RHDV病毒，本研究只检测了重组病毒抵抗MYXV的动物保护效果。我们将制备好的重组病毒rMV-VP60-GFP (10⁵ PFU/mL)，注射日本大耳白兔(雌雄各2只)，注射重组病毒后，第4天全部兔背部出现兔粘液瘤病症状出现，出现小包(图 7A)，第7天后小包变大变红，兔耳朵和眼睛无分泌物(图 7B)，第20天后兔粘液瘤症状全部消失(图 7C)。

图 7 MYXV的动物保护试验 Fig. 7 Protection against MYXV challenge.

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然后，注射病毒毒力和致死率最强的MYXV病毒株Lau，观察重组病毒产生抗体的保护效果。结果显示，注射了重组病毒的兔子无病症，但是对照组的兔子全部死亡。虽然本实验未检测产生抗体的效价，但是根据上述兔粘液瘤病症出现和变化情况，可以判断本研究中筛选的重组病毒毒力合适，注射家兔后能产生抵抗MYXV的特异性抗体。

RHDV和MYXV作为两种对家兔及其祖先欧洲野兔-穴兔致死性极强的病毒，是造成家兔极大经济损失和欧洲野兔-穴兔在其原产地逐渐成为近危或易危物种的重要原因^[2]。目前，鉴于RHDV尚未有合适的体外细胞培养系统，在其灭活疫苗开发过程中只能从自然或人工感染致死的兔肝或肺组织中分离病毒，增加了实验周期和成本^[16]。目前，针对RHDV的唯一结构蛋白VP60的亚单位疫苗和病毒载体疫苗的研发取得了很大的进展，如利用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞以及马铃薯等表达系统的亚单位疫苗；利用重组牛痘病毒、黏液瘤病毒等的活载体疫苗^[6-10]。鉴于野兔的分布和习性，普通的疫苗虽然可以适用于家兔，但是却无法适用于野兔^[17]。因此，开发一种适用范围更广泛，尤其能方便应用于穴兔的野生种群保护的疫苗就显得非常必要。基于此，本研究中我们首次将RHDV的结构蛋白基因vp60通过同源重组插入兔粘液瘤病毒MYXV的非必需基因TK中，经过几轮重组病毒筛选和纯化，成功制备了插入VP60和带有筛选标记GFP的重组型病毒rMV-VP60-GFP，并且初步动物实验表明，该重组型病毒能诱发家兔产生抵抗MYXV的特异性抗体。由于缺乏必要的RHDV病毒，我们未能检测该重组病毒是否能产生抵抗RHDV的特异性抗体，但是该重组型病毒的成功制备，为后续开发可同时保护家兔和欧洲野兔-穴兔受兔瘟和粘液瘤病侵袭的二价疫苗成为可能。此外，动物攻毒保护试验显示，兔粘液瘤病症状可以持续十几天左右，可方便跳蚤等吸血昆虫叮咬并携带重组病毒，并在穴兔群中传播，起到有效保护穴兔原产地野生穴兔群免受兔粘液瘤病及兔出血症病的侵袭，起到缓解穴兔原产地被列为易危或近危物种的不利局面^[18-19]。

在重组痘病毒的构建和筛选过程中，传统上通常利用lacZ基因作为筛选标记。在本研究中，我们也尝试用lacZ基因作为筛选标记，但同源重组效果不理想，导致X-gal显色不明显，无法与野生型病毒形成的空斑区分开，进而难以成功筛选到重组型病毒^[20]。但当我们采用gfp基因作为筛选标记时，则能顺利获得正确的重组型病毒。其原因在于lacZ基因约为3 500 bp，但gfp基因大小为714 bp远小于lacZ基因，因此其同源重组效果较好。同时，TK基因作为同源重组构建重组病毒载体的靶基因，该基因的缺失被证明不影响病毒的增殖，但会降低重组病毒毒力，较易获得减毒株，故常应用于疫苗研发^[21-24]。不过，本研究的重要目的之一是应用于穴兔野生种群在原产地的生态保护，因此，为了避免连续传代导致病毒毒力降低，影响兔粘液瘤病的症状，进而不利于跳蚤等叮咬和传播，必须选取合适病毒毒力的毒株用于重组病毒筛选。此外，由于痘病毒在宿主细胞的细胞质内复制和装配，不插入到宿主细胞的基因组中，因此，在以痘病毒为亲本病毒时，穿梭载体中相应基因只有在痘病毒启动子作用下才能成功表达。本研究中，我们通过痘病毒启动子的优化，发现p7.5启动子为最适启动子(实验数据未发表)。鉴于此，本研究中的GFP筛选标记以及p7.5启动子是rMV-VP60-GFP重组病毒得以成功制备的关键，这也为其他重组痘病毒的构建提供了很好的借鉴。

总之，本重组病毒的成功制备，为后续开发可同时保护家兔和欧洲野兔-穴兔受兔瘟和粘液瘤病侵袭的二价疫苗奠定了基础，具有重要的理论意义和应用价值。