中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 柳海云, 董虎, 靳野, 郭慧琛, 孙世琪
- Liu Haiyun, Dong Hu, Jin Ye, Guo Huichen, Sun Shiqi
- 口蹄疫病毒自身核酸片段对病毒样颗粒组装的促进作用
- Promotion of self-nucleic acid fragments on the assembly of foot-and-mouth disease virus-like particles
- 生物工程学报, 2020, 36(10): 2076-2082
- Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(10): 2076-2082
- 10.13345/j.cjb.200084
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文章历史
- Received: February 26, 2020
- Accepted: May 18, 2020
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是偶蹄类动物易感的一种高度传播性的病毒性疫病。FMD的病原体是口蹄疫病毒(FMD virus,FMDV),FMDV属小RNA病毒科口蹄疫病毒属,无囊膜,是一种高度可变的RNA病毒。其基因组为单股正链RNA,全长约8 500 bp,由5′ UTR、ORF和3′ UTR组成。5′ UTR具有广泛的二级结构全长约1 300 bp,主要由S片段、Poly(C)区段、功能未知区(CRE)和内部核糖体进入位点(IRES)几部分组成。开放阅读框ORF长约7.0 kb,主要由P1区、P2和P3区组成。P1被3Cpro裂解,生成口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3、VP1。P2-P3被3Cpro裂解后形成数种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。3′ UTR长约172 bp,由两个部分组成,一个长约100 bp的序列和一个poly(A)尾巴[1]。
感染FMDV后可引起急性或长期无症状持续感染的现象[2]。由于该病能够使易感动物及其产品的流通受到限制,严重影响国家的经济发展。我国将其列为一类传染病,在国家动物疫病防治长期发展规划中确定为首位限期免疫净化防控的疫病[3-4]。目前国内外主要使用灭活疫苗对FMD进行免疫预防,具有较好的效果;但此类疫苗在生产过程中可能存在灭活不彻底导致免疫动物成为病毒携带者而散播病毒的生物安全问题。因此,研发新型、安全、高效的基因工程疫苗是时代之需,也符合国家提出的有效防控重大动物疫病、保障畜牧业健康持续发展的战略需求。
病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)作为近年新出现的一种基因工程亚单位疫苗具有巨大的应用潜力。VLPs是由病毒的一个或多个结构蛋白组装成的二十面体空心颗粒,由于自身的特征在疫苗预防、分子载体等方面具有广阔的应用前景[3, 5-6]。VLPs没有病毒核酸,不具有感染能力,但在形态上与真正的病毒粒子相同或相似,具有与完整病毒相似的免疫原性。VLPs作为一种颗粒性抗原,模拟了天然病毒的体内感染过程,能很好地活化抗原递呈细胞,尤其是树突状细胞(DC)。通过MHC-Ⅱ类分子的识别,活化T细胞,从而诱导强烈的细胞免疫应答[7-8]。因此,VLPs疫苗是能够替代全病毒疫苗的最佳候选疫苗。获得大量的VLPs是有效发挥VLPs优势的前提。目前经原核表达系统生产的FMDV的VLPs,成本低,生产工艺简单快速[9]。
在二十面体的小RNA病毒的研究中,某些小RNA病毒的VLPs在植物表达系统和真核表达系统中的组装效率比较理想;但生产成本高,同时它们的组装工艺更趋向多样化,例如植物病毒(CCMV、CPMV)[10]、多瘤病毒(SV40)[11]、噬菌体Qβ的衣壳蛋白利用自身的基因片段或者体外合成的具有特殊功能的核酸片段、多聚阴性金属离子等作为支架去诱导VLPs的体外组装[12],可以更好地提高VLPs的体外组装效率[13]。研究发现小RNA病毒的5′ UTR可能与病毒的衣壳蛋白有连接[14],此外具有特殊生物学结构的核酸片段也有利蛋白质的缠绕和连接;而口蹄疫自身核酸片段5′ UTR和IRES具有广泛的生物学二级结构[15]。故本研究选择FMDV自身核酸片段5′ UTR和IRES作为用于组装VLPs的支架,试图模拟FMDV的体内组装,以期能更好地提高FMDV VLPs的体外组装效率,发挥更好的免疫效果,为研究和制备新型、高效的FMD VLPs疫苗奠定基础。
1 材料与方法 1.1 菌种、FMDV自身的基因片段含O型FMDV结构蛋白基因的重组菌由中国农业科学院兰州兽医研究所兽用纳米材料与应用团队保存[9]。O型FMDV自身核酸片段5′ UTR、IRES的质粒是将FMDV O strain O/BY/CHA/2010 (GenBank登录号:JN998085.1)的5′ UTR、IRES序列分别合成并克隆到pcDNA3.1+载体,克隆位点为5′NheⅠ和3′BamHⅠ。
1.2 主要试剂大肠杆菌培养试剂(胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠),氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素,质粒提取试剂盒,胶回收试剂盒均购自Omega公司。辣根过氧化物酶标记的家兔抗猪IgG均购自Sigma公司。抗O型FMDV的猪IgG、灭活FMDV由本实验室自制。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),限制性内切酶XhoⅠ、BamHⅠ均购自宝生物工程(大连)有限公司。2%磷钨酸,10×MOPS购自索莱宝公司。T7体外转录试剂盒购自Promega公司。硝酸纤维素膜(NC)购自Millipore公司。镍亲和层析树脂购自罗氏公司。2K的核酸标准分子量购自TaKaRa公司。蛋白质标准分子量购自Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 FMDV VLPs的表达纯化以1:100的比例将表达O型FMDV结构蛋白的大肠杆菌接到含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL氨苄青霉素、10 μg/mL卡那霉素的LB培养基中,37 ℃、220 r/min培养4 h左右,当OD600达到0.8左右时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,25 ℃、220 r/min培养10 h,低温离心收菌。用Buffer A (500 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)重悬并超声破碎,离心收集上清,转移到填有Ni2+树脂的层析柱中,4 ℃结合1 h,用Buffer A洗5–10个柱体积后用Buffer B (300 mmol/L咪唑,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)洗脱目的蛋白。将上述纯化好的蛋白加入SUMO酶混匀装入10 kDa的透析袋中在Buffer C (300 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.5)中酶切组装。组装产物进行变性凝胶电泳和蛋白免疫印迹鉴定。
1.4 5′ UTR、IRES的制备将口蹄疫自身的核酸片段5′ UTR、IRES的质粒转化在含有氨苄青霉素的琼脂平板中培养,挑阳性克隆菌测序鉴定后,摇菌提取质粒,经BamHⅠ线性化并胶回收,按T7体外转录试剂盒说明书操作获得目的RNA片段,进行变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.5 FMDV VLPs与5′ UTR、IRES组装比例和组装时间的优化将VLPs的终浓度定为0.5 mg/mL,调整FMDV自身核酸片段5′ UTR、IRES的终浓度依次是10 ng/μL、20 ng/μL、30 ng/μL。分别装入10 kDa的透析袋中组装,组装过程中每间隔2 h,取50 μL样品用于检测组装产物的水合粒径(纳米粒度仪Nano ZS)与口蹄疫病毒粒子大小(25 nm)比较以确定最佳的FMDV自身核酸片段的浓度和组装时间。
1.6 粒径和电位鉴定单独VLPs的组装作为对照,VLPs与FMDV自身核酸片段5′ UTR、IRES的共组装分别作为试验组。在组装Buffer C中透析组装一定时间,收集组装产物用0.22 μm的滤器过滤,利用纳米粒度仪(Nano ZS)检测这3个样品的粒径和电位。
1.7 凝胶阻滞试验各取20 μL VLPs-5′UTR、VLPs-IRES的组装产物混合4 μL 6×上样缓冲液加入甲醛变性的琼脂糖凝胶中在含有3%甲醛的1×MOPS缓冲液中进行电泳(75 V,35 min),在凝胶紫外成像仪(北京市六一仪器厂)上观察结果。
1.8 核酸酶消化保护试验各取30 μL VLPs-5′UTR、VLPs-IRES的组装产物加入核酸酶(RNase A)消化。将消化和未消化的组装产物各取20 μL混合4 μL 6×上样缓冲液加入甲醛变性的琼脂糖凝胶中在含有3%甲醛的1×MOPS缓冲液中进行电泳(75 V,35 min),之后在凝胶紫外成像仪(北京市六一仪器厂)上观察。
1.9 尺寸排阻色谱(SEC)分离纯化组装产物VLPs-5′UTR、VLPs-IRES与VLPs的组装产物用Sephacryl S-400高分辨率凝胶柱(GE Healthcare)在蛋白纯化仪AKTA pure (GE Healthcare)上分离纯化。同时,分离纯化灭活FMDV (146S)作为对照曲线,根据病毒粒子的出峰位置确定VLPs的出峰位置。对通过SEC分离的VLPs-5′UTR、VLPs-IRES与VLPs的各个峰面积进行统计学分析,P < 0.000 1 (****)为差异极其显著,P < 0.001 (***)为差异极显著,P < 0.01 (**)为差异显著,P > 0.05 (NS)为差异不显著。
1.10 透射电镜(TEM)用100 kDa的浓缩管浓缩经SEC分离纯化VLPs-5′UTR、VLPs-IRES与VLPs的各个峰产物,各取5 μL浓缩样品吸附在铜网上2 min,滤纸吸干,用去离子水洗涤2次,滤纸吸干,再加5 μL 2%磷钨酸染色2 min,滤纸吸走多余染液,干燥后,用透射电子显微镜(日本,规格型号:HT7700)观察VLPs-5′UTR、VLPs-IRES与VLPs的峰产物。
1.11 圆二色光谱(CD)分析用100 kDa浓缩管浓缩经SEC分离纯化的VLPs-5′UTR、VLPs-IRES、VLPs和灭活FMDV的峰产物(作为对照)在圆二色光谱仪(英国,规格型号:Chirascan)上检测分析其二级结构。
2 结果与分析 2.1 FMDV VLPs和5′ UTR、IRES的获得摇菌提取FMDV的5′ UTR和IRES的质粒用BamHⅠ线性化后胶回收鉴定其大小合适(图 1A),进行体外转录获得目的核酸片段5′ UTR、IRES的RNA (图 1B)。镍亲和层析法纯化FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3,在体外组装形成FMDV- VLPs,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,其大小与理论值(VP0 33 kDa、VP1 25 kDa、VP3 24.5 kDa)相符(图 1D)。
2.2 5′ UTR、IRES与FMDV VLPs共组装收集VLPs、VLPs-5′UTR、VLPs-IRES的组装产物,用0.22 μm的滤器过滤,检测电位和粒径。单纯VLPs组装28 h后的Zeta电位是-3.85 mV,VLPs-5′UTR共组装28 h后的Zeta电位是-7.27 mV,VLPs-IRES共组装28 h后的Zeta电位是-9.135 mV (图 2A)。VLPs-5′UTR、VLPs-IRES组装产物的电位要比单纯VLPs组装产物的电位大(绝对值),说明VLPs和5′ UTR、IRES进行了共组装。同样,VLPs-5′UTR组装28 h后的粒径大小与单纯VLPs组装28 h后的粒径大小相似(20–35 nm) (图 2B)。VLPs-5′UTR、VLPs-IRES的组装产物进行变性琼脂糖凝胶电泳,由于5′ UTR、IRES分别与VLPs共组装,核酸片段作为支架被包裹在VLPs内部,在琼脂糖凝胶电泳中会出现凝胶阻滞现象,即组装产物滞留在加样孔(图 2C,泳道2、5)。同时进行核酸酶消化试验,组装产物仍滞留在加样孔(图 2C,泳道3、6),即核酸片段并没有被核酸酶消化掉,进一步证明,核酸片段作为支架被包裹在VLPs内部,VLPs对核酸片段具有保护作用。
2.3 5′UTR、IRES对FMDV VLPs组装的影响SEC分离纯化灭活FMDV (146S)作为对照,根据146S的出峰位置确定VLPs出峰位置(图 3A)。在VLPs-5′UTR、VLPs-IRES和VLPs组装产物的SEC图中OD260 > OD280,可以初步说明FMDV VLPs与FMDV自身核酸片段共组装(图 3B、C、D)。通过对VLPs-5′UTR、VLPs-IRES与VLPs组装产物的SEC峰产物(75S 12S)的面积进行统计学分析发现VLPs-5′UTR的75S峰面积极显著高于单纯VLPs组(P < 0.001),显著高于VLPs-IRES组(P < 0.01);而VLPs-IRES的12S峰面积极其显著高于单纯VLPs组(P < 0.000 1)和VLPs-5′UTR (P < 0.000 1)。即核酸片段与FMDV结构蛋白结合有助于75S和12S的组装,其中5′ UTR更有利于75S的形成,而IRES更有利于12S的形成(图 3E)。对SEC分离纯化VLPs-5′UTR、VLPs-IRES与VLPs的峰产物75S和12S进行圆二色光谱分析,发现75S颗粒与146S的二级结构曲线很相似,说明VLPs-5′UTR、VLPs-IRES的组装产物与天然病毒粒子的结构类似(图 3F)。用透射电子显微镜观察SEC分离纯化的VLPs-5′UTR、VLPs-IRES和VLPs的峰产物75S和12S,75S为与146S (25 nm)大小相似的空心颗粒,12S为15 nm左右的空心颗粒(图 3G、H、I)。
3 讨论VLPs疫苗是当代新型疫苗。为了更好地将VLPs疫苗应用到防控疫病的实战中,就需要有可靠高效的生产工艺去获得足量的VLPs。O型FMDV结构蛋白经原核表达系统表达并在体外组装的VLPs,成本低,生产工艺简单快速,在临床应用中有巨大的潜力。在植物病毒(CCMV、CPMV)和噬菌体Qβ的VLPs的体外组装中,常常引入一些自身或非自身的基因片段作为支架诱导VLPs的组装,而且这些基因片段也可以决定形成VLPs的大小和形状[16]。
为了促进FMDV VLPs的组装效率,本研究初次尝试在FMDV VLPs体外组装时引进自身核酸片段。迄今为止,关于FMDV基因组如何参与FMDV衣壳化的机制还不是很清楚,但有文献报道小RNA病毒科的病毒的5′ UTR可能与病毒衣壳蛋白有连接,具有特殊生物学结构的核酸片段也有利于蛋白质的缠绕和连接[17];而FMDV自身核酸片段5′ UTR和IRES具有生物学二级结构有利于蛋白的缠绕。因此选择FMDV自身核酸片段5′ UTR和IRES作为支架诱导FMDV VLPs的体外组装。通过对VLPs、VLPs-5′UTR、VLPs-IRES的组装产物的粒径、电位、凝胶阻滞试验初步证明5′ UTR和IRES与VLPs共组装,核酸酶消化试验证明5′ UTR和IRES是被包裹在VLPs的内部。SEC分离纯化VLPs、VLPs-5′UTR、VLPs-IRES的组装产物和灭活FMDV,根据病毒粒子(146S)的出峰位置确定了FMDV VLPs的出峰位置,即SEC分离纯化的峰产物依次是VLPs峰(75S)、五聚体峰(12S)和单体峰(5S)。对每个峰产物的面积进行统计学分析可以发现VLPs-5′UTR共组装产物的75S和12S峰面积与单纯VLPs组装的75S和12S峰面积差异极显著(P < 0.001),与VLPs-IRES的75S峰面积差异显著(P < 0.01);而VLPs-IRES共组装产物的12S峰面积与单纯VLPs和VLPs-5′UTR共组装产物的12S的峰面积差异极其显著(P < 0.000 1)。这充分说明了FMDV自身的核酸片段5′ UTR有利于病毒样颗粒(75S)和五聚体(12S)的组装,IRES更有利于五聚体(12S)的组装。
在VLPs组装的研究报道中,病毒的衣壳蛋白可以通过各种外来的模板诱导组装,从而生成不同尺寸和形状的VLPs。采用核酸片段的主要原因是核酸带负电,可以通过静电作用与蛋白质相互作用[13],因此也有人引进一些多聚阴性的金属离子参与组装。也有研究者设计特殊功能的核酸支架去诱导VLPs的组装,不仅能提高VLPs的组装效率还使其多功能化[12]。引进的核酸类型不同,形成的VLPs形状也有差异,引入一些RNA片段更多地形成球形VLPs,引入DNA片段形成棒状VLPs[18]。核酸片段的长度对形成的VLPs的大小和形态也有差异,超过一定长度的核酸片段会诱导形成二联体、三联体、四联体的VLPs[10]。
本文初步尝试利用FMDV自身核酸片段5′ UTR和IRES作为支架诱导FMDV VLPs的体外组装,结果发现FMDV自身核酸片段5′ UTR和IRES都有利于FMDV VLPs的组装。该研究为提高FMDV VLPs体外组装效率提出新思路,有利于病毒样颗粒疫苗的推广和应用。
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