中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 张素玲, 王孟月, 王彦伟, 吴芃, 逄文强, 田克恭
- Zhang Suling, Wang Mengyue, Wang Yanwei, Wu Peng, Pang Wenqiang, Tian Kegong
- 三种禽病毒抗原的串联表达、纯化及活性鉴定
- Co-expression, purification and bioassay of three avian viral antigens
- 生物工程学报, 2020, 36(10): 2066-2075
- Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(10): 2066-2075
- 10.13345/j.cjb.200057
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文章历史
- Received: February 12, 2020
- Accepted: May 25, 2020
- Published: July 1, 2020
目前商业化的禽用疫苗包括灭活疫苗、弱毒活疫苗及亚单位疫苗。相比传统类型的疫苗,亚单位疫苗具有成本低、安全性高、保护效果好等优势,所以越来越受重视,相关疫苗的开发也越来越多[1-5]。与单组分疫苗相比,多联多价疫苗操作简便,减少免疫针次,简化免疫程序,提高免疫效率,避免了反复免疫导致的应激等问题。基因工程亚单位多联多价疫苗因其具有安全性高、保护效果好、免疫程序简单、免疫效率高等特点,更利于临床使用。
但是基因工程亚单位多联多价疫苗涉及多种抗原的制备,每种抗原都需要分别经过表达和纯化,这使得生产工艺繁琐复杂,过程难控制,生产成本高,而多基因共表达技术可以有效解决此问题,且节约生产成本、提高产量,并简化生产工艺。
基因共表达的载体包括单基因载体和多基因载体[6]。单基因载体的每个载体上只携带一个基因,通过单基因载体的多重转化来实现多个基因的共表达。单基因载体多重转化后,可能会出现质粒在复制后发生不均等分配,经过多次增殖后会导致某个质粒丢失而造成蛋白间表达比例失调,多重转化后蛋白表达量下降,在多种抗生素存在的条件下,细胞的生长速率减慢、载体之间可能会出现相互干扰等问题[6-7]。在这种情况下,多基因载体的共表达策略可能更为合适。多基因载体能装载多个基因,所以能够利用一个载体实现多个基因在宿主细胞中的同时表达,其中包含单一转录单元的共表达和多重转录单元的共表达。在大肠杆菌中,由于单一载体/多重转录单元的共表达策略涉及到载体的选择、不同启动子的选择、不同基因在载体上的顺序和表达条件的优化等,其研究比较复杂,目前尚无标准统一的方法可参考使用。
基于先前的研究和报道,为了简化基因工程亚单位多联多价疫苗中抗原生产的工艺步骤,实现多个基因在同一菌株中均一可溶性表达,本研究选用Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4) Fiber-2蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2蛋白和减蛋综合征病毒(EDSV) Fiber蛋白为研究对象,利用原核表达系统,通过密码子优化、载体启动子改造等方法优化目的蛋白的可溶性表达。然后进一步通过调整多个基因片段在单一载体上的顺序实现FAdV-4 Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白的均一表达。并且对3种蛋白的生物学活性进行了分析。本研究对简化多联多价疫苗中抗原生产的工艺步骤、降低生产成本具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 质粒和菌株质粒pET28a购自Novagen;大肠杆菌Escherichia coli DH5α、BL21(DE3)菌株购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 主要试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher。2×Easy Taq PCR Super Mix购自北京全式金生物技术有限公司。DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司。质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。蛋白预染Marker、兔抗鸡IgG-HRP二抗购自Thermo Fisher。DAB显色试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。Ni2+ Sepharose 6 Fast Flow购自美国GE Healthcare。FAdV-4阳性鸡血清为本实验室自制。IBDV阳性鸡血清和EDSV阳性鸡血清购自中国兽医药品监察所。其他化学试剂均为分析纯。
1.3 方法 1.3.1 基因的克隆及表达载体的构建利用表 1中的FAdV-fiber2-F/FAdV-fiber2-R、IBDV-VP2-F/IBDV-VP2-R和EDSV-fiber-F/EDSV- fiber-R引物,分别扩增FAdV-4 fiber-2基因、IBDV VP2基因和EDSV fiber基因,经相应的内切酶处理后克隆至pET28a,获得重组质粒pET28a-pT7- F-fiber2、pET28a-pT7-I-VP2和pET28a-pT7-E- fiber,分别转化E. coli BL21(DE3)进行蛋白表达。
Primer name | Primer sequence (5′–3′) | Size (bp) | Restriction enzyme cutting site (Underlined) |
FAdV-fiber2-F | GGAATTCCATATGCTCCGAGCCCCTAAAAGAAGA | 34 | NdeⅠ |
FAdV-fiber2-R | CGCGGATCCTTACGGGACGGAGGCTGCTGG | 30 | BamHⅠ |
IBDV-VP2-F | GGAATTCCATATGACAAACCTGCAAGATCAAACC | 34 | NdeⅠ |
IBDV-VP2-R | CGCGGATCCTTACCTTAGGGCCCGGATTAT | 30 | BamHⅠ |
EDSV-fiber-F | GGAATTCCATATGAAGCGACTACGGTTGGACCCT | 34 | NdeⅠ |
EDSV-fiber-R | CGCGGATCCTTACTGTGCTCCAACATATGT | 30 | BamHⅠ |
FAdV-im-fiber2-F | GGAATTCCATATGCTGCGTGCTCCGAAACGTCGT | 34 | NdeⅠ |
FAdV-im-fiber2-R | CGCGGATCCTTACGGAACAGAAGCAGCCGG | 30 | BamHⅠ |
IBDV-im-VP2-F | GGAATTCCATATGACCAACCTGCAGGACCAGACC | 34 | NdeⅠ |
IBDV-im-VP2-R | CGCGGATCCTTAACGCAGAGCACGGATGAT | 30 | BamHⅠ |
EDSV-im-fiber-F | GGAATTCCATATGAAACGTCTGCGTCTGGACCCG | 34 | NdeⅠ |
EDSV-im-fiber-R | CGCGGATCCTTACTGAGCACCAACGTAGGT | 30 | BamHⅠ |
pT5-F | GGAAGATCTTCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCC | 79 | BgI Ⅱ |
pT5-R | CCGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGAC | 30 | XhoⅠ |
Note: enzyme restriction sites are underlined. |
根据同义密码子具有简并性的特点,采取密码子优化策略,依据大肠杆菌密码子偏好性对FAdV-4 fiber-2基因、IBDV VP2基因和EDSV fiber基因进行优化合成。利用表 1中的FAdV-im- fiber2-F/FAdV-im-fiber2-R、IBDV-im-VP2-F/IBDV- im-VP2-R和EDSV-im-fiber-F/EDSV-im-fiber-R引物进行目的基因扩增并克隆至pET28a,获得重组质粒pET28a-pT7-F-im-fiber2、pET28a-pT7-I-im- VP2和pET28a-pT7-E-im-fiber,分别转化E. coli BL21(DE3)进行蛋白表达。
1.3.3 表达载体启动子改造分别以pET28a-pT7-F-im-fiber-2、pET28a- pT7-I-im-VP2和pET28a-pT7-E-im-fiber为模板,利用表 1中含有T5启动子序列的引物pT5-F和pT5-R扩增目的基因片段并克隆至pET28a,获得重组质粒pET28a-pT5-F-im-fiber-2、pET28a-pT5- I-im-VP2和pET28a-pT5-E-im-fiber,分别转化E. coli BL21(DE3)进行蛋白表达。
1.3.4 表达载体的串联及串联顺序优化利用表 2中的引物,分别从pET28a-pT5- I-im-VP2和pET28a-pT7-E-im-fiber质粒中扩增出pT5-I-im-VP2片段和pT7-E-im-fiber片段,利用相应的内切酶处理后,依次克隆入pET28a-pT5-F-im-fiber2质粒中,获得重组质粒pET28a-F-I-E。按照此方法,将3个基因片段在质粒上的顺序进行互换,共获得6种不同串联顺序的质粒pET28a-F-I-E、pET28a-F-E-I、pET28a-I-F-E、pET28a-I-E-F、pET28a-E-I-F和pET28a-E-F-I。将6种不同串联顺序的重组质粒分别转化E. coli BL21(DE3)进行蛋白表达。
Primer name | Primer sequence (5′–3′) | Size (bp) | Restriction enzyme cutting site (underlined) |
pT5-IBDV-VP2-F | CGAGCTCTCATAAAAAATTTATTTGCTT | 28 | SacⅠ |
pT5-IBDV-VP2-R | CCCAAGCTTTTAACGCAGAGCACGGATGAT | 30 | Hind Ⅲ |
pT5-EDSV-fiber-F | AAATATGCGGCCGCTCATAAAAAATTTATTTGCTT | 35 | NotⅠ |
pT5-EDSV-fiber-R | CCGCTCGAGTTACTGAGCACCAACGTAGGT | 30 | XhoⅠ |
Note: enzyme restriction sites are underlined. |
蛋白的诱导表达条件为:37 ℃、220 r/min培养至OD600为0.5–0.6时,用终浓度为0.5 mmol/L的IPTG于28 ℃诱导表达12 h。同时设置空载体诱导组。表达结束后,离心收集菌体细胞。按照菌体︰重悬液=1︰10 (W/V)的比例加入PBS,充分重悬菌体细胞。超声破碎后,4 ℃、12 000 r/min离心30 min,分离上清和沉淀。12% SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
1.3.6 蛋白的纯化大量诱导表达后的菌体加PBS重悬后,使用高压均质机进行菌体破碎,破碎条件为:压力80 MPa,循环破碎4次。破碎后的样品,4 ℃、12 000 r/min离心1 h,收集上清。上清用0.45 μm滤膜过滤后,利用AKTA-pure系统经过装有Ni2+ Sepharose 6 Fast Flow填料的XK16/20柱子纯化。收集的洗脱蛋白用12% SDS-PAGE检测。
1.3.7 Western blotting检测纯化后蛋白和未诱导细胞裂解液上清经过SDS-PAGE后,采用半干法将蛋白转移至PVDF膜上,5% (W/V)脱脂牛奶室温封闭2 h,然后分别加入1︰500稀释的FAdV-4阳性鸡血清、IBDV阳性鸡血清和EDSV阳性鸡血清,4 ℃孵育过夜。PBST洗涤3次,每次5 min。最后加入1︰5 000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG,室温孵育1 h,PBST洗涤3次,每次5 min。用DAB显色试剂盒显色后,观察结果。
1.3.8 活性检测纯化后的重组蛋白,采用AGP试验进行FAdV-4 Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白的效价检测。
2 结果与分析 2.1 3种抗原在大肠杆菌中的单独表达为了在大肠杆菌中实现3种抗原的可溶性共表达,首先对3种抗原在大肠杆菌中的单独表达情况进行了探索和优化。
将3种构建正确的表达载体pET28a-pT7-F- fiber2、pET28a-pT7-I-VP2和pET28a-pT7-E-fiber分别转化至表达宿主E. coli BL21(DE3)中,用0.5 mmol/L IPTG于28 ℃诱导表达12 h。结果如图 1A所示,与空载体诱导组相比,含有表达载体pET28a-pT7-F-fiber2的菌株,在58 kDa左右,上清和沉淀中均未见明显条带,说明FAdV Fiber-2蛋白未表达(第2泳道和第3泳道),而IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白则均主要分布在沉淀中,在诱导后上清中并没有明显的新增条带,说明IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白表达后均主要以包涵体形式存在。初步表达结果说明,在大肠杆菌中,FAdV Fiber-2蛋白不表达,IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白表达为包涵体。
2.2 3种抗原表达条件的优化为了使3种抗原在大肠杆菌中可溶性表达,对表达条件进行了优化。
首先是进行目的基因的密码子优化。将3个目的基因序列进行密码子优化后,将获得的构建正确的重组载体pET28a-pT7-F-im-fiber2、pET28a-pT7-I-im-VP2和pET28a-pT7-E-im-fiber,分别转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。按照相同的条件进行目的蛋白的诱导表达。表达完成后,菌体裂解上清和沉淀经SDS-PAGE分析,如图 1B所示。从图 1B可以看出,FAdV Fiber-2蛋白明显表达,但以包涵体的形式存在于沉淀中。相同表达条件下,IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白均在上清中出现相应条带,以部分可溶性形式存在,约占总可溶性蛋白的比例分别为7.5%和8.1%。结果表明,密码子优化后,FAdV Fiber-2蛋白以包涵体形式在E. coli BL21(DE3)中表达,IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白部分可溶性表达。
为了进一步优化3个蛋白的可溶性表达量,在密码子优化的基础上,分别对表达载体的启动子进行了改造,将T7启动子更换为T5启动子。构建正确的质粒pET28a-pT5-F-im-fiber2、pET28a- pT5-I-im-VP2和pET28a-pT5-E-im-fiber分别转化E. coli BL21(DE3)并以相同的条件进行蛋白的表达,结果如图 1C所示。从图中可以看出,FAdV Fiber-2蛋白可溶性表达量明显增加,约为总可溶性蛋白的5.9%。IBDV VP2蛋白可溶性表达未有明显提升,约为总可溶性蛋白的7.4%,但包涵体含量减少。EDSV Fiber蛋白可溶性表达量则降低,约占可溶性蛋白的6.3%。
通过上述表达条件的优化,分别得到了3种抗原最适的可溶性表达方式,即选择可溶性表达FAdV Fiber-2蛋白的pET28a-pT5-F-im-fiber2质粒、能够可溶性表达IBDV VP2蛋白且包涵体含量较少的pET28a-pT5-I-im-VP2质粒和EDSV Fiber可溶性表达量较高的pET28a-pT7-E-im-fiber质粒进行串联表达载体的构建。
2.3 3种抗原串联表达及优化将含有6种不同串联顺序重组载体(图 2)的E. coli BL21(DE3)同时培养,并用相同的诱导条件,诱导目的蛋白表达。破碎后样品上清用12% SDS-PAGE检测结果见图 3。结果显示,不同串联顺序中FAdV Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白的可溶性表达情况差异比较明显。其中,含有串联表达重组载体pET28a-F-E-I、pET28a-E-I-F、pET28a-E-F-I和pET28a-I-E-F的菌株能够实现3种蛋白同时可溶性共表达(第2、4、5、6泳道),含有串联表达重组载体pET28a- F-I-E和pET28a-I-F-E的菌株仅能实现FAdV Fiber-2蛋白和IBDV VP2蛋白的同时可溶性表达(第3、7泳道)。
使用灰度扫描软件对上清中3种可溶性表达蛋白进行分析,分析结果显示,第6泳道中,3种蛋白的比例接近1︰1︰1,说明含有串联表达重组载体pET28a-I-E-F的菌株,能够获得的可溶性表达相对较多,且比例接近目的蛋白。
综上所述,含有pET28a-I-E-F质粒的表达菌,能够实现FAdV Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白的均一可溶性串联表达。
2.4 串联表达蛋白的纯化对含有串联表达质粒pET28a-I-E-F的BL21 (DE3)进行扩大培养,菌体收集破碎离心后上清液进行纯化。
FAdV Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白N末端均带有6×His标签,利用Ni2+ Sepharose 6 Fast Flow填料能够同时将FAdV Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白吸附。50 mmol/L咪唑清洗杂蛋白后,用500 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白,获得3种目的蛋白的混合物。纯化后的蛋白样品经过12% SDS-PAGE检测,结果见图 4。从图可以看出,FAdV Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白能够同时结合于镍柱。经过灰度扫描分析,纯化后3种蛋白的比例为1︰1︰0.9,纯度约为90%。透析除咪唑后,BCA蛋白定量显示蛋白总浓度为1.35 mg/mL。因此,纯化后,FAdV Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白浓度分别约为0.41 mg/mL、0.41 mg/mL和0.38 mg/mL。
2.5 3种抗原的鉴定与活性分析将纯化后的蛋白用PBS缓冲液透析除去咪唑,进行免疫反应性鉴定和活性分析。
将透析后的蛋白和未诱导组破碎后的样品上清进行SDS-PAGE,然后转移至PVDF膜,分别使用FAdV-4阳性鸡血清、IBDV阳性鸡血清和EDSV阳性鸡血清作为一抗,HRP标记的兔抗鸡IgG作为二抗,用Western blotting分析,结果见图 5。如图 5所示,PVDF膜上分别出现了相对分子质量约为58 kDa、40 kDa和70 kDa的目的条带,表明串联表达的FAdV Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白均正确并且具有免疫反应性。
将透析后蛋白分别与FAdV-4阳性鸡血清、IBDV阳性鸡血清和EDSV阳性鸡血清进行AGP试验,结果显示,FAdV Fiber-2蛋白效价为1︰64,IBDV VP2蛋白效价为1︰64,EDSV Fiber蛋白效价为1︰32。结果说明纯化后的3种禽病毒抗原均具有天然的抗原活性。已有研究表明,IBDV VP2蛋白按照AGP效价1︰16及以上配制疫苗免疫后,攻毒保护率可达90%–100%[3-4]。FAdV Fiber-2蛋白和EDSV Fiber蛋白的AGP效价与攻毒保护率之间也具有一定的相关性(相关研究结果尚未发表)。
上述结果说明串联表达和纯化后的FAdV Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白均具有免疫反应性和抗原活性,可以作为基因工程亚单位多联多价疫苗研究的候选抗原。
3 讨论在大肠杆菌中共表达多个基因已有很多研究,主要包括酶与辅酶共表达,获得具有催化活性的蛋白酶;功能相关蛋白质的共表达;增加外源蛋白质的可溶性的共表达等[8]。有研究采用多重转录单元表达系统,将商业化质粒进行改造,使每个基因都带有独立的启动子、核糖体结合位点、终止子等表达调控元件,各个基因的表达相对独立,实现了在大肠杆菌中由单一质粒介导的多基因高效共表达[9]。以串联表达技术为基础的基因工程亚单位多联多价疫苗,可以通过一次发酵和纯化,同时获得多种抗原。该技术在生产上可以减少生产工序,降低生产成本,对基因工程亚单位多联多价疫苗的产业化具有十分重要的意义。
本研究为了简化基因工程多联多价疫苗中所含抗原的生产工艺,获得均一的可溶性抗原,利用多重转录单元共表达系统,共表达3种禽类病毒抗原。FAdV Fiber-2蛋白[1, 10]、IBDV VP2蛋白[11-13]和EDSV Fiber蛋白[14-15]是亚单位疫苗研发主要的靶蛋白。靶蛋白的可溶性表达成为了疫苗研发的关键问题。为了获得可溶性的蛋白,首先对上述3种抗原单独表达进行了研究。初步表达结果显示,3种抗原基因片段在大肠杆菌中不表达或表达为包涵体。目前解决大肠杆菌表达外源蛋白形成包涵体问题的常用方法包括使用不同的表达菌株[16]、基因片段的密码子优化[17-18]和使用促溶性标签[12, 19-21]等。这些方法的使用很大程度上解决了包涵体表达的问题。因此本文通过基因片段密码子优化和载体启动子改造的方法对3种抗原片段单独表达条件进行了优化,并且成功获得了能够单独可溶性表达3种抗原的最适载体。在此基础上,进一步对3个基因片段的串联表达进行了研究。由于单基因载体多重转化共表达策略和单一载体/单一转录单元共表达策略均会出现共表达的基因表达水平不一的问题,难以控制多个基因表达水平的一致性[22-23],所以本研究选用单一载体/多重转录单元共表达策略进行3种禽病毒抗原的共表达,并且优化了3个基因在同一载体上的串联顺序,期望能够控制3种抗原在同一菌株中表达水平的均一性。结果显示,3个基因在同一载体上不同的串联顺序对可溶性蛋白表达的均一性有影响,可能是因为3个基因片段来自于不同的病毒,其在大肠杆菌中的可溶性表达能力有区别,虽然经过单独表达的优化,当将其串联到一起,每个基因前的启动子之间可能会相互干扰,导致不同蛋白的表达速度有别于单独表达时的速度,从而出现可溶性表达量不均一的现象。本研究通过不同串联顺序的优化,最终实现了3个不同基因的均一表达,并且纯化后获得的3种禽病毒抗原均能与相应的阳性鸡血清反应。我们之前的研究已经表明,纯化后的IBDV VP2蛋白免疫鸡后,攻毒保护率为100%[4],FAdV Fiber-2蛋白和EDSV Fiber蛋白也均能够刺激鸡体产生保护性抗体(相关研究结果尚未发表)。大量的研究报道也证明了FAdV Fiber-2蛋白、IBDV VP2蛋白和EDSV Fiber蛋白均具有免疫原性[1, 3, 10-14]。
本研究通过目的基因密码子优化、表达载体启动子改造和基因串联等关键技术的突破,首次实现了3种来自不同禽病毒抗原的高效、均一、可溶性串联表达和纯化,简化了基因工程亚单位多联多价疫苗中抗原生产的工艺步骤,共表达蛋白纯化后经Western blotting和活性检测证明3种蛋白均具有免疫反应性和天然的抗原活性,为基因工程亚单位多联多价疫苗的研制奠定了基础。
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