中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 陈玉, 郭仁朋, 黄赛飞, 宋丹, 刘蓉
- Chen Yu, Guo Renpeng, Huang Saifei, Song Dan, Liu Rong
- 人同型融合和蛋白质分选复合体亚基的原核表达、蛋白纯化及功能验证
- Prokaryotic expression, protein purification and functional verification of human homotypic fusion and vacuole protein sorting complex subunit
- 生物工程学报, 2020, 36(1): 133-142
- Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(1): 133-142
- 10.13345/j.cjb.190133
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文章历史
- Received: April 10, 2019
- Accepted: May 29, 2019
- Published: July 12, 2019
HOPS是一个在哺乳动物和酵母之间高度保守的多蛋白复合体,由6个相对分子质量为79–123 kDa的蛋白组成。长约30 nm,形状类似“海马”,Vps41位于顶部邻近Vps16和Vps33亚基,而Vps39位于底部与Vps18和Vps11亚基连接在一起[1]。HOPS又被称为Vps (Vacuolar protein sorting)复合物,先发现的Vps11、Vps16、Vps18和Vps33构成Vps-C complex,普遍存在于酵母、果蝇、植物、哺乳动物中。Vps-C complex能够通过自噬过程、胆固醇和脂质代谢途径处理和再循环细胞质组分[2-3]。另外两个亚基Vps39及Vps41则属于Vps-B complex,与Vps-C complex形成了相对分子质量约633 kDa的HOPS复合体。最初HOPS只被鉴定为酵母内涵体上的一种聚集复合物,如今其已被确定能够影响内涵体和溶酶体的成熟和传递过程,可以通过膜融合机制来调节生物体内的膜泡运输,对于酵母和哺乳动物中自噬体与液泡/溶酶体的膜融合过程至关重要[4-6]。
细胞自噬广泛存在于真核生物中,是一种自我消化、进化保守的过程,依赖于溶酶体降解途径[7]。自噬的过程需要经历以下几个阶段:自噬的诱导;自噬前体的形成;自噬前体的延伸及闭合;自噬体的成熟;自噬体与溶酶体的融合及内容物的降解[8]。其中自噬体与溶酶体的融合是自噬的关键过程,需要多种蛋白的参与。已知SNAREs属于膜锚定蛋白,主要作用是介导囊泡与靶膜的融合[9]。在融合过程中,定位于两个待融合膜上不同形式的SNARE蛋白会形成复合体,这一复合体之间的螺旋结构相互缠绕,从而使膜拉近并融合。研究表明STX17 (定位于自噬体上)通过与SNAP29形成二元复合物,再与VAMP8 (定位于溶酶体上)相互作用形成STX17-SNAP29-VAMP8三元复合物从而介导自噬体与溶酶体的融合[10]。形成SNARE复合物对膜融合过程至关重要,但它们的自发组装效率很低,由SNARE蛋白介导的膜融合过程均需要一些聚集因子的调节。体内试验结果表明,HOPS复合体通过与自噬性SNARE蛋白STX17相互作用来促进SNARE复合物的组装,加速由SNARE蛋白介导的膜融合过程[11-12]。但是,HOPS复合体亚基与自噬SNARE蛋白STX17是直接发生相互作用还是由其他蛋白进行介导的,这一问题目前尚未可知。
鉴于HOPS复合体在细胞自噬膜融合过程中的重要作用,本研究拟纯化得到VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41这6种组成人HOPS复合体的重组蛋白,利用GST pull-down技术,在体外鉴定HOPS复合体与STX17蛋白是否存在直接相互作用,为寻找HOPS复合体的互作蛋白和进一步探究其在自噬体与溶酶体融合过程中的功能及作用机制奠定材料基础。
1 材料与方法 1.1 材料pGEX 4T-1-GST原核表达质粒由本实验室保存;pET-28a(+)改造的pET-His-NusA原核表达质粒由南京农业大学理学院万群实验室惠赠;pcDNA3.1-HA-VPS11等6种重组质粒由浙江大学孙启明实验室惠赠;大肠杆菌Escherichia coli DH5α、BL21 (DE3)感受态细胞购自上海唯地生物技术公司;PCR试剂盒、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司;Trelief SoSoo Cloning Kit购自南京擎科生物技术有限公司;限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、Hind Ⅲ和NotⅠ购自NEB公司;胶回收试剂盒、DNA marker购自Genstar公司;质粒小提试剂盒购自OMEGA公司;TAE、氨苄青霉素(Ampicillin)、卡那青霉素(Kanamycin)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和考马斯快速染色液均购自北京索莱宝科技有限公司;引物合成及DNA序列测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成;Glutathione Sepharose 4B购自美国GE公司;Ni Focurose 6FF购自武汉汇研生物科技股份有限公司;鼠单克隆抗Flag抗体购自Sigma公司;鼠单克隆抗HA抗体、鼠单克隆抗VPS11、VPS18、VPS39、VPS41抗体均购自Santa Cruz公司;兔单克隆抗VPS33抗体购自Genetex公司;兔单克隆抗VPS16抗体购自Proteintech公司;兔单克隆抗STX17抗体购自Sigma公司;HRP标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG购自SBA公司;化学发光试剂购自Bio-Rad公司。
1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成所用引物见表 1。
Name of primer | Primer sequence (5′–3′) | Restriction site |
pET-HA-VPS11-F | CTGGTGAGAACCTGTACTTCCAATCCGGATCCTACCCCTACGACGTG CCCGACTA |
BamHⅠ |
pET-HA-VPS11-R | TCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCAAGCTTTTAAGTGCCCCTCCTG GAGTGC |
Hind Ⅲ |
pGEX 4T-1-Flag-VPS16-F | CCGGAATTCATGGACTGCTACACGGCGAAC | EcoRⅠ |
pGEX 4T-1-Flag-VPS16-R | ATTTGCGGCCGCCTACTTCTTCTGGGCTTGTGCCCT | NotⅠ |
pET-HA-VPS18-F | CTGGTGAGAACCTGTACTTCCAATCCGGATCCTACCCCTACGACGTGC CCGACTA |
BamHⅠ |
pET-HA-VPS18-R | TCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCAAGCTTCTACAGCCAACTGAGCT GCTCCTC |
Hind Ⅲ |
pGEX 4T-1-Flag-VPS33-F | ACAAGGGATCCCCGGAATTCATGGCGGCTCATCTGTCC | EcoRⅠ |
pGEX 4T-1-Flag-VPS33-R | CAGTCAGTCACGATGCGGCCGCCTAGAAAGGTTTTTCCATCAG | NotⅠ |
pET-HA-VPS39-F | CTGGTGAGAACCTGTACTTCCAATCCGGATCCTACCCCTACGACGTG CCCGACTA |
BamHⅠ |
pET-HA-VPS39-R | TCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCAAGCTTCTAAGTGTCAGCTGGG TTTACCTC |
Hind Ⅲ |
pGEX 4T-1-Flag-VPS41-F | CGCGGATCCATGGCGGAAGCAGAGGAGCAGGAAAC | BamHⅠ |
pGEX 4T-1-Flag-VPS41-R | ATTTGCGGCCGCCTATTTTTTCATCTCCAAAATTGCAC | NotⅠ |
Note: underlined sequences are restriction enzyme sites. |
以pcDNA3.1-HA-VPS11、pcDNA3.1-HA-VPS16、pcDNA3.1-HA-VPS18、pcDNA3.1-HA-VPS33、pcDNA3.1-HA-VPS39、pcDNA3.1-HA-VPS41 (已有质粒)为模板,利用PrimerSTAR酶扩增目的片段,条件如下:98 ℃变性10 s,58 ℃退火5 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测正确后,胶回收目的片段。
1.2.3 6种重组质粒的构建及鉴定37 ℃酶切过夜条件下,BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切pET-His-NusA质粒,EcoRⅠ和NotⅠ、BamHⅠ和NotⅠ分别双酶切pGEX 4T-1-GST质粒,回收线性化载体。1)无缝连接方式:Trelief SoSoo Cloning Kit连接线性化载体与目的片段,转化E. coli DH5α,37 ℃培养过夜。2) T4连接方式:双酶切PCR产物并用T4 DNA连接酶将带有粘性末端的目的片段与载体连接,转化E. coli DH5α,37 ℃培养过夜。次日挑取单克隆,进行菌落PCR,琼脂糖凝胶电泳初步检测,选择条带位置正确的菌液进行测序鉴定。测序无误后,进行质粒小提。
1.2.4 重组蛋白的分离纯化将测序正确的6种重组质粒转化至E. coli BL21 (DE3),挑取单克隆并扩大培养。1)镍柱亲和层析:37 ℃培养至OD600 0.9–1.2,加入IPTG (终浓度为0.2 mmol/L),22 ℃诱导16 h,4 ℃离心弃上清收集菌体,用E. coli裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,1.4 mmol/L β-巯基乙醇,0.05% Tween 20,0.2 mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂)重悬,静置30 min后超声破碎,12 000 r/min、4 ℃离心取上清。2倍柱体积的平衡液(20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑,5%甘油)清洗镍柱,随后加入菌体上清,4 ℃旋转2 h,弃流出液,加入2倍柱体积的清洗液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,5%甘油)清洗,加入洗脱液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,500 mmol/L NaCl,500 mmol/L咪唑,5%甘油)洗脱,得到蛋白液①加入TEV酶切掉标签,二次过柱时标签蛋白与镍柱结合,收集蛋白液②即得最终纯化好的重组蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法检测。2)谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析:37 ℃培养至OD600 0.4–0.6,加入IPTG (终浓度为0.2 mmol/L),28 ℃诱导5 h,4 ℃离心弃上清收集菌体,用E. coli裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,150 mmol/L NaCl,0.1% β-巯基乙醇,1% Triton X-100,0.2 mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂)重悬,静置30 min后超声破碎,12 000 r/min、4 ℃离心取上清,并加入适量Glutathione Sepharose 4B (玻璃珠),4 ℃旋转过夜。次日先清洗玻璃珠,再加入适量E. coli裂解缓冲液和TEV酶,旋转2 h,离心收集上清即得最终纯化好的重组蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法检测。
1.2.5 In vitro GST pull-down验证HOPS组分蛋白与STX17的相互作用将pGEX 4T-1-TEV-Flag-STX17重组质粒转化至E. coli BL21 (DE3),经IPTG诱导离心得到菌体,用E. coli裂解缓冲液重悬,静置30 min后超声破碎,12 000 r/min、4 ℃离心取上清,加入相应Glutathione Sepharose 4B (对照组1为纯玻璃珠,不加Flag-STX17蛋白上清),4 ℃旋转过夜。次日清洗玻璃珠,在实验组与对照组1中加入已纯化好的HOPS蛋白,对照组2中加入等量缓冲液,旋转结合1 h,离心弃上清并清洗玻璃珠,再加入适量E. coli裂解缓冲液和TEV酶,4 ℃继续旋转2 h,最后收集上清并制备样品,采用Western blotting方法检测HOPS组分蛋白与STX17之间的相互作用。
2 结果与分析 2.1 目的片段的克隆及鉴定以6种已有质粒为模板,利用设计的6对引物扩增得到目的片段,其中VPS11全长2 826 bp,VPS18全长2 922 bp,VPS39全长2 628 bp,VPS16全长2 520 bp,VPS33全长1 791 bp,VPS41全长2 565 bp,经琼脂糖电泳鉴定获得与预期片段一致的6种PCR产物(图 1和图 2)。
2.2 重组质粒的构建及鉴定用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切pET-His-NusA质粒(图 3),用EcoRⅠ和NotⅠ或BamHⅠ和NotⅠ分别双酶切pGEX 4T-1-GST质粒(图 4),37 ℃酶切过夜后得到3种线性化载体。将载体与目的片段分别连接并转化。次日,挑取单克隆,进行菌落PCR,用琼脂糖凝胶电泳初步鉴定(图 5和图 6)。菌落PCR验证正确的菌液送测,正反向测序结果与基因序列一致,说明6种组成HOPS复合体的原核表达重组质粒构建成功。
2.3 重组蛋白的纯化经SDS-PAGE和Western blotting方法检测得出以下结果:利用镍柱亲和层析方式成功纯化得到分子量在105 kDa左右的HA-VPS11重组蛋白、108 kDa左右的HA-VPS18重组蛋白及97 kDa左右的HA-VPS39重组蛋白(图 7);利用谷胱甘肽亲和层析方式成功纯化得到分子量在97 kDa左右的Flag-VPS16重组蛋白、70 kDa左右的Flag-VPS33重组蛋白及98 kDa左右的Flag-VPS41重组蛋白(图 8)。
2.4 HOPS蛋白与Flag-STX17蛋白的体外相互作用以Flag-STX17为诱饵蛋白,首先将其与Glutathione Sepharose 4B结合,然后分别加入纯化好的6种重组蛋白,待HOPS组分蛋白与Flag-STX17蛋白充分结合后,用TEV蛋白酶进行洗脱。若两种蛋白没有直接相互作用,添加的蛋白被清洗掉,则上清中无此添加蛋白,用特异性抗体将检测不出相应条带。结果如图 9所示,与对照组相比,实验组在分子量为105、97、108、70、97、98 kDa左右分别检测出HA-VPS11、Flag-VPS16、HA-VPS18、Flag-VPS33、HA-VPS39、Flag-VPS41蛋白的特异性条带,并且同一位置对照组1和2均无非特异性条带,以上结果一方面说明制备的重组蛋白均具有生物学功能,另一方面说明组成HOPS复合体的6种重组蛋白与STX17蛋白在体外均发生直接相互作用,不存在第三者在中间作为“桥梁”形成间接相互作用。
3 讨论当细胞处于饥饿状态下自噬体会吞噬长寿命蛋白,将其递送至溶酶体进行降解,从而回收降解所产生的营养物质用来供能,使细胞在应激条件下循环产生能量来继续存活[13]。自噬还可以降解细胞内错误折叠的蛋白质和受损害的细胞器,消除细胞内的病原体以此维持胞内稳态[14]。研究者们已经在细胞和分子生物学水平上证实了自噬可以改善因内质网应激、微生物感染和蛋白质聚集体积累引起的疾病[15]。目前对于细胞自噬与疾病的研究已包括衰老、病原体感染、神经退行性疾病、癌症等[16-17]。对自噬研究的深入将会对这些疾病的治疗提供新的方法,而对与自噬相关蛋白结构的解析可能会对未来疾病的治疗提供潜在药物靶标[18]。
如今,自噬体的形成机制已得到广泛研究,而自噬体与溶酶体融合的分子机制尚不明朗。已知自噬体与溶酶体的融合经历了联结、锚定、膜融合3个步骤,SNAREs在这一过程中发挥了重要作用。2012年Itakura等[19]首先确定了自噬体与溶酶体膜融合需要自噬性SNARE蛋白STX17的参与,STX17-SNAP29-VAMP8三元复合物的形成能介导这一膜融合过程[20]。但自噬体与溶酶体之间一些聚集因子的作用尚不清楚,因此还有许多蛋白的功能需要进行验证。2014年Jiang等[11]利用免疫共沉淀(Co-IP)和质谱分析(MS)两种方法确定了与STX17相互作用的两种蛋白VPS33及VPS16,当利用siRNA干扰VPS33、VPS16或VPS39基因的表达会阻断自噬流过程,造成STX17和LC3蛋白的积累。在293T细胞中分别转染带Flag标签的STX17和GFP标签的HOPS复合体亚基,结果表明所有的HOPS组分蛋白在体内都与STX17有相互作用,但是两者在体外的相互作用还未得到验证。因为Co-IP结果只能证明两种蛋白在细胞内存在相互作用,这种作用可能是直接相互作用,也可能是第三者在中间作为“桥梁”,形成复合物后的间接相互作用;而GST pull-down是一种常用的探究蛋白质体外相互作用的技术,该方法能在体外鉴定两种蛋白质是否发生直接的相互作用从而消除其他蛋白质的影响。因此本试验纯化出6种构成人HOPS复合体的重组蛋白,采用GST pull-down技术证实HOPS复合体与STX17蛋白在体外具有直接相互作用,为在体外揭示HOPS复合体在自噬体与溶酶体膜融合过程中的作用机制提供切实可行的实验途径,并为进一步研究HOPS的生物学功能奠定实验基础。
在前期试验中发现pGEX 4T-1-GST-TEV-Flag-VPS11、VPS18和VPS39这3种重组质粒的蛋白表达量很低,即使优化培养条件(诱导时间、温度和诱导剂浓度),效果也并不明显,因此选择pET-His-NusA载体重新构建质粒。此载体上含有T7强启动子,为了减慢蛋白质的合成速度、降低形成包涵体的概率,利用IPTG诱导表达时采用22 ℃诱导过夜的条件,最终在His-NusA促融标签的作用下实现VPS11、VPS18和VPS39的可溶性表达,成功纯化出重组蛋白。本试验构建的重组质粒带有GST和His两种标签,GST-tag约为26 kDa,其能够增加重组蛋白的可溶性,提高其稳定性并且保留抗原性和生物活性[21-22]。同样GST-tag也有相应的缺点,分子量较大可能影响蛋白质的功能[23]。His-tag通常是由6–10个组氨酸残基组成,约0.84 kDa。His-tag作为蛋白纯化的标签不会影响蛋白质的可溶性及生物学功能,免疫原性较低,用这种方式纯化的蛋白可以直接注入动物体内制备抗体,并且能够与其他亲和标签一起组成双亲和标签利于蛋白表达[24]。NusA是一个分子量约55 kDa的蛋白标签,由于其自身的可溶性很高,因此作为融合标签与目的蛋白结合后可以提高目标蛋白的稳定性及可溶性[25]。并且有研究表明,NusA还有利于促进重组蛋白的正确折叠,提高蛋白的表达量[26]。由于GST、NusA这两种融合标签的分子量较大,而本试验纯化的6种重组蛋白相对分子质量大多超过90 kDa,所以利用TEV蛋白酶去除重组蛋白的GST或NusA融合标签,从而消除亲和标签对蛋白结构及生物学功能的影响。
综上所述,本研究利用pGEX 4T-1-GST和pET-His-NusA载体成功构建出组成人HOPS复合体的6种重组质粒,转化至E. coli BL21 (DE3),经IPTG诱导在原核系统中正确表达,并且采用谷胱甘肽琼脂糖树脂与镍柱两种亲和纯化方法获得VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41这6种重组蛋白,GST pull-down试验证实HOPS复合体与定位在自噬体上的STX17蛋白在体外具有直接的相互作用。前面已介绍到自噬体与溶酶体融合过程中,自噬体上的STX17及SNAP29会首先形成二元复合体,继而与溶酶体上的VAMP8形成三元复合体促进膜融合。因此我们猜想HOPS复合体是否与SNARE蛋白STX17-SNAP29二元复合体或STX17-SNAP29-VAMP8三元复合体也存在直接相互作用,从而促进这一膜融合过程。后续将继续采用GST pull-down技术来探究HOPS复合体与SNARE蛋白不同复合体的体外相互作用关系,阐明HOPS复合体作为融合因子在膜融合过程中的作用机制。
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