生物工程学报  2020, Vol. 36 Issue (1): 90-99
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.190165
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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文章信息

许曼, 江贤章, 黄建忠, 祁峰
Xu Man, Jiang Xianzhang, Huang Jianzhong, Qi Feng
强化类球红细菌辅因子NADPH再生以提高法尼醇的产量
Reinforcement of Rhodobacter sphaeroides cofactor NADPH to increase the production of farnesol
生物工程学报, 2020, 36(1): 90-99
Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(1): 90-99
10.13345/j.cjb.190165

文章历史

Received: April 26, 2019
Accepted: June 10, 2019
Published: July 1, 2019
强化类球红细菌辅因子NADPH再生以提高法尼醇的产量
许曼1,2,3 , 江贤章1,2,3 , 黄建忠1,2,3 , 祁峰1,2,3     
1. 福建师范大学 工业微生物教育部工程研究中心,福建 福州 350108;
2. 福建师范大学 生命科学学院,福建 福州 350108;
3. 福建省现代发酵技术工程中心,福建 福州 350109
摘要:法尼醇(Farnesol, FOH)是由焦磷酸异戊烯基(IPP)和焦磷酸二甲基烯丙基(DMAPP)合成的法尼酰基焦磷酸盐(FPP)去焦磷酸化作用生成的。在类球红细菌中IPP和DMAPP是由MEP途径生成,而完整的MEP途径需要消耗大量的辅因子NADPH,增加胞内NADPH的量有可能强化FOH的合成。文中从增加NADPH的生成和降低NADPH的消耗这两个策略出发,分别干扰了编码6-磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的表达,同时强化了磷酸戊糖途径中6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因(zwf)和6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶基因(gnd)的表达。实验结果表明,经改造的菌株NADPH含量显著增加,干扰菌株中菌株RSpgii的产量较高,为3.91 mg/g,在过表达的菌株中同时过表达zwfgnd基因的重组菌株(RSzg)的FOH产量提高到了3.43 mg/g。为了获得FOH产量更高的菌株,以RSpgii为出发菌株,分别与zwfgnd组合调控,获得的菌株RSzgpi的产量达到了最高量为4.48 mg/g,是出发菌株RS-GY2产率的2.24倍。
关键词法尼醇    类球红细菌    RNA干扰    NADPH    
Reinforcement of Rhodobacter sphaeroides cofactor NADPH to increase the production of farnesol
Man Xu1,2,3 , Xianzhang Jiang1,2,3 , Jianzhong Huang1,2,3 , Feng Qi1,2,3     
1. Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian, China;
2. College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian, China;
3. Engineering Research Center of Fujian Modern Fermentation Technology, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian, China
Abstract: Farnesol (FOH) is produced by dephosphorylation of farnesyl diphosphate (FPP) derived from two universal building blocks, dimethylallyl diphosphate (DMAPP) and isopentenyl diphosphate (IPP). In Rhodobacter sphaeroides these building blocks are generated by MEP pathway, however, many of the biosynthetic reactions and biotransformations in the MEP pathway are limited by low availability of NADPH. Improvement of the amount of intracellular NADPH may enhance the synthesis of FOH. In this study, we utilized the strategies of increasing the production of NADPH and decreasing the consumption of NADPH. The expression of glucose 6-phosphate isomerase (pgi) and glutamate dehydrogenase (gdhA) were inhibited by RNA interference, respectively, and overexpression of 6-glucose phosphate dehydrogenase (zwf) and 6-glucose phosphate dehydrogenase (gnd) in the pentose phosphate pathway were carried out. The results showed that the content of NADPH in the recombinant strains increased significantly, the highest FOH production of RSpgii in the RNA interfered strain was 3.91 mg/g, and the FOH production increased to 3.43 mg/g after zwf gene and gnd gene has been overexpressed. In order to obtain strains with higher FOH production, we used RSpgii as the starting strain, and zwf, gnd and co-overexpressed zwf + gnd gene were overexpressed in RSpgii, respectively. The highest FOH production of the strain RSzgpi reached to 4.48 mg/g which was 2.24 times that of the starting strain RS-GY2.
Keywords: farnesol    Rhodobacter sphaeroides    RNA interfering    NADPH    

法尼醇(1-羟基-3, 7, 11-三甲基-2, 6, 10-十二碳三烯;C15H26O,简写为FOH)是一种无环倍半萜,广泛分布在多种植物精油中,比如寻常椴、加南芥、茉莉、玫瑰、柠檬草等。因为其独特的甜香味,常被用来作为化妆品、香皂、芳香油和香水的香料[1-2]。它还具有信号转导[3-4]、群体感应[5-6]等多种生物学功能,同时FOH还可以调控细胞增殖[7]。FOH还被用作胃溃疡和维生素合成药物的原料[8],因为其能诱导多种肿瘤细胞系的凋亡,因此其衍生物已成为候选的抗癌药物[9]。此外,由于其在水中的溶解性较低,能量高,也可以作为生物燃料的替代品[10]。随着人们对FOH的需求日益增长,且从自然资源中提取的产量极低,化学合成的纯度低[11],用微生物代谢工程生产FOH变得十分必要。

目前,FOH的生物合成途径在植物和微生物中都已基本阐明。植物中FOH合成酶或微生物中混杂的磷酸酶可以通过法尼酰基焦磷酸盐(FPP)的去磷酸化作用生成FOH[12]。FPP是由FPP合成酶通过1个二甲基丙烯焦磷酸盐(DMAPP)和2个异戊基焦磷酸盐(IPP)的头尾缩合形成的[13]。这两种物质的合成有两种途径:一条是2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphates, MEP)途径;另一条是甲羟戊酸(Mevalonate, MVA)途径[14-15]。之前的实验表明过表达MEP途径中的关键酶可以提高FOH的水平,其中王崇龙等以Escherichia coli为出发菌株,通过过表达ispA同时导入外源MVA途径,发酵48 h后,使得FOH产量达到了135mg/L[12]。除此之外,实验还表明,FPP的可用性对FOH的合成具有重要意义,增加FPP池的大小可以促进微生物高水平地生产FOH。而参与FPP的生物合成酶经常参与生成与还原的盐酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)相当的代谢物,并在其中发挥着主导作用[16]。类球红细菌作为辅酶Q10的天然生产者,拥有完整的MEP途径。但是,想要提高微生物体内FOH的产量,微生物体内的还原辅因子NADPH量是远远不够的。而在工业应用中,需要还原辅因子如NADH和NADPH的生物合成过程,如果我们以等摩尔的量投入,将会非常昂贵。我们以类球红细菌为出发菌株,利用生物工程手段,增加NADPH在全细胞系统中的可用性,从而提高FOH的产量(图 1)。6-磷酸葡萄糖异构酶(pgi)[18]和谷氨酸脱氢酶(gdhA)是两个依赖NANPH的脱氢酶,弱化这两个基因的表达,将会减小NADPH辅因子的消耗;6-葡萄糖磷酸脱氢酶(zwf)[19]和6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶(gnd)[20]的表达会增加NADPH的量,强化这两个基因的表达,会增加NADPH辅因子的量;本实验的研究目的是通过干扰pgi基因和gdhA基因的表达,强化zwf基因和gnd基因,从而提高类球红细菌中NADPH的水平,达到强化MEP途径,增加FPP前体供应,从而提高FOH产量的作用。

图 1 类球红细菌中FOH的合成途径及磷酸戊糖途径 Fig. 1 Biosynthetic pathway of FOH and pentose phosphate pathway in R. sphaeroides.
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌E. coli T1用于质粒的克隆,E. coli S17-1用双亲本的接合,类球红细菌R. sphaeroides用于基因改造和FOH的生产;质粒pBBR1MC-2,所有的菌株见表 1

表 1 菌株和质粒 Table 1 Strains and plasmids used in the study
Description Reference
Strain
E. coli S17-1 RP4-2. Tc::Mu-Km::Tn7 [23]
E. coli DH5α F-λ–endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Invitrogen
Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-mK+)
E. coli TOP10 F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Invitrogen
Δ(ara-leu)7697 galU galK λ– rpsL(StrR) endA1 nupG Invitrogen
R. sphaeroides-GY2 CoQ10 high-yield mutant strain obtained from R. sphaeroides 2.4.1 this study
RSpgii R. sphaeroides-GY2 RNAi-pgi this study
RSgdhAi R. sphaeroides-GY2 RNAi-gdhA this study
RSz R. sphaeroides-GY2 with overexpressed zwf this study
RSg R. sphaeroides-GY2 with overexpressed gnd this study
RSzg R. sphaeroides-GY2 with overexpressed zwf and gnd this study
Plasmids Description Reference
pYC6a Ptac promoter, AmpR this study
pBBR1MCS2 low-copy cloning vector, KanR [24]
Rszpi R. sphaeroides-GY2 RNAi-pgi and with overexpressed zwf this study
Rsgpi R. sphaeroides-GY2 RNAi-pgi and with overexpressed gnd this study
Rszgpi R. sphaeroides-GY2 RNAi-pgi and with overexpressed zwf and gnd this study
pBBR1MCS2-tac pBBR1MCS2 containing tac promoter this study
pBBR1MCS2-pgii pBBR1MCS2-tac containing pgii this study
pBBR1MCS2-gdhAi pBBR1MCS2-tac containing gdhAi this study
pBBR1MCS2-NouCDi pBBR1MCS2-tac containing NouCDi this study
pBBR1MCS2-zwf pBBR1MCS2-tac containing zwf from R. sphaeroides 2.4.1 this study
pBBR1MCS2-gnd pBBR1MCS2-tac containing gnd from R. sphaeroides 2.4.1 this study
pBBR1MCS2-zwf-gnd

pBBR1MCS2-tac containing zwf and gnd from R. sphaeroides 2.4.1 this study
pBBR1MCS2-pgii-zwf pBBR1MCS2-pgii containing zwf from R. sphaeroides 2.4.1 this study
pBBR1MCS2-pgii-gnd pBBR1MCS2-pgii containing gnd from R. sphaeroides 2.4.1 this study
pBBR1MCS2-pgii-zwf-gnd pBBR1MCS2-pgii containing zwf and gnd from R. sphaeroides 2.4.1 this study
1.1.2 主要的试剂和仪器

所有的限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自NEB公司;Q5超保真DNA聚合酶购自NEB公司;质粒提取和胶回收试剂盒购自Omega公司;NADP/NADPH定量试剂盒购自美国Sigma公司;卡那霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司;其他试剂为国产或进口分析纯。气相色谱检测器为Agilent 7890A型。

1.1.3 培养基和培养条件

大肠杆菌在LB培养基(NaCl 10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取粉5g /L)中培养,培养条件是37 ℃、220 r/min;R. sphaeroides种子培养基(3.5 g/L (NH4) 2SO4、2 g/L酵母提取物、0.75 g/L玉米浆粉、10 g/L葡萄糖、2 g/L NaCl、0.75 g/L K2HPO4、0.75 g/L KH2PO4、0.1 g/L FeSO4和0.3 g/L MgSO4、1 g/L烟酸和1 g/L生物素,最终用10 mol/L NaOH调pH为6.1–6.3,在32 ℃中培养;生产FOH的培养基由4 g/L (NH4)2SO4、32.5 g/L葡萄糖、3.25 g/L NaCl、1.2 g/L KH2PO4、1.4 g/L FeSO4和9.8 g/L MgSO4、3.9 g/L玉米浆粉组成,最后用10 mol/L NaOH将pH值调至6.2–6.3。所有使用的质粒都是卡那霉素抗性,培养基中卡那霉素终浓度为50 μg/mL。

1.2 方法 1.2.1 载体的构建

pBBR1MCS2-pgii和pBBR1MCS2-gdhAi载体的构建:以类球红细菌的基因组作为模板,用含有相应的限制性酶切位点的引物(pgiiL-F/pgiiL-R,pgiiS-F/pgiiS-R,gdhAL-F/gdhAL-R,gdhAS-F/ gdhAS-R)分别扩增出与pgigdhA基因相对应的两段反向重复序列pgiL和pgiS、gdhAL和gdhAS,较长的片段pgiL和gdhAL包含548 bp,较短的片段pgiS和gdhAS包含498 bp,较长的片段中多出的50 bp形成发夹结构。然后用BamHⅠ和EcoRⅠ消化较长的片段pgiL和gdhAL,EcoRⅠ和SalⅠ消化较短的片段pgiS和gdhAS。然后将限制性内切酶消化的两段PCR产物与用BamHⅠ和SalⅠ消化后的载体PBBR1MCS2连接,形成一个称为pBBR1MCS2-pgii和pBBR1MCS2-gdhAi的质粒,RNA干扰图和原理图如图 2所示。

图 2 RNA干扰原理图和质粒结构简图 Fig. 2 Schematic diagram of RNA interference and brief architecture of vectors.

过表达zwfgndzwf-gnd载体的构建:以类球红细菌的基因组作为模板,用带有相应同源臂的引物zwf-F/zwf-R和gnd-F/gnd-R,分别扩增出带有相应同源臂的zwf基因和gnd基因序列,然后用Gibson assembly试剂将扩增出来的zwfgnd分别与骨架PBBR1MCS2z (引物为pBBR1MCS2z-F/ pBBR1MCS2z-R)和骨架PBBR1MCS2g (引物为pBBR1MCS2g-F/pBBR1MCS2g-R)连接起来,形成质粒pBBR1MCS2-zwf和pBBR1MCS2-gnd;共过表达zwf基因和gnd基因的质粒的构建,分别用overlapzwf-F/overlapzwf-R和overlapgnd-F/overlapgnd-R扩增出带有相应同源臂的zwf基因和gnd基因序列,用pBBR1MCS2zg-F/pBBR1MCS2zg-R为引物,质粒pBBR1MCS2为模板扩增出骨架pBBR1MCS2zg,然后用Gibson assembly试剂将这3个片段连接起来,连成的质粒为pBBR1MCS2-zwf-gnd,结构图如图 2所示。

干扰加强化的质粒构建,分别以pBBR1MCS2-zwf、pBBR1MCS2-gnd和pBBR1MCS2-zwf-gnd为模板,tac-F/trrnB-R为引物,分别扩增出带有tac启动子和trrnB终止子的zwfgndzwf+gnd的基因序列,然后用限制性内切酶AgeⅠ消化扩增出来的片段和质粒pBBR1MCS2-pgii,最后用T4 DNA连接酶连接,分别形成质粒pBBR1MCS2-pgii-zwf、pBBR1MCS2-pgii-gnd和pBBR1MCS2-pgii-zwf-gnd。结构图如图 2所示,所有质粒见表 1,引物见表 2

表 2 引物序列 Table 2 Primers used in the study
PrimersSequence (5′–3′)
pgiiL-FCCGGAATTCGCCTCGAAGACCTTCACCAC
pgiiL-RCGCGGATCCGCTGGTAGAAGGCGTGCTG
pgiiS-FCCGGAATTCGAAGCGCTGGATGGCCG
pgiiS-RTTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACGCTGGTAGAAGGCGTGCTG
gdhAiL-FCCGGAATTCGAGGAGCTGCGCCACTGGAT
gdhAiL-RCGCGGATCCCACCTTCCGCCCCGTGCCAG
gdhAiS-FCCGGAATTCGCAGGCCGACTTTGTCGAGG
gdhAiS-RTTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACCACCTTCCGCCCCGTGCCAG
NouCDiL-FCCGGAATTCCATCCGGCCTTCTTCCGCAT
NouCDiL-RCGCGGATCCGCGGTGGCCCTCGATCTG
NouCDiS-FCCGGAATTCATGGGACGCGATGGTGCG
NouCDiS-RTTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACGCGGTGGCCCTCGATCTG
pBBR1MCS2z-FGCTGGCGCGAGATCCGCTGACTCGAGGGTAGATCTGGTAC
pBBR1MCS2z-RGGAATGACTCTCGAAACCATGGTTAATTCCTCCTGTTACG
zwf-FCGTAACAGGAGGAATTAACCATGGTTTCGAGAGTCATTCCGG
zwf-RGTACCAGATCTACCCTCGAGTCAGCGGATCTCGCGCC
pBBR1MCS2g-FTCAAGCGCCTCACGCGCTAACTCGAGGGTAGATCTGGTAC
pBBR1MCS2g-RAGAAATGCCAGCTTGGCCATTAGGTTAATTCCTCCTGTTACG
gnd-FCGTAACAGGAGGAATTAACCTAATGGCCAAGCTGGCATTTCT
gnd-RGTACCAGATCTACCCTCGAGTTAGCGCGTGAGGCGCTTG
pBBR1MCS2zg-FTCAAGCGCCTCACGCGCTAACTCGAGGGTAGATCTGGTAC
pBBR1MCS2zg-RGGAATGACTCTCGAAACCATGGTTAATTCCTCCTGTTACG
overlapzwf-FCGTAACAGGAGGAATTAACCATGGTTTCGAGAGTCATTCCGG
overlapzwf-RAGAAATGCCAGCTTGGCCATCTCCTTCAGCGGATCTCGCG
overlapgnd-FCGCGAGATCCGCTGAAGGAGATGGCCAAGCTGGCATTTCT
overlapgnd-RGTACCAGATCTACCCTCGAGTTAGCGCGTGAGGCGCTTG
tac-FTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTCACAGCTAACACCACGTCGT
trrnB-RTATGTCTATTGCTGGTTTACCGGTAAGGCCCAGTCTTTCGACTG
V-FGGCCTCAGGCATTTGAGAAG
V-RCAACTTAATCGCCTTGCAGC
1.2.2 工程菌株的构建和验证

将含有相应质粒的供体菌S17-1接种在含有卡那霉素抗性的液体LB中37 ℃过夜培养,以10%的接种量转接到含有相应抗性的新鲜LB中,37 ℃继续培养至对数生长期;受体菌R. sphaeroides接种在无抗的液体LB中于30 ℃培养24 h后转接到新鲜的LB培养基中,继续培养至对数生长期,将受体菌和供体菌转移到1.5 mL的离心管中,7 000 r/min离心3 min,用新鲜的LB洗2次,然后分别用300 μL和200 μL的新鲜LB重悬受体菌和供体菌,将受体菌和供体菌按6:1的体积比混匀后点在无抗的LB平板上,于30 ℃恒温培养箱中培养大约20 h,最后用1 mL预冷的1×Sistrom’s培养基洗脱到预冷的1.5 mL的离心管中,4 ℃ 5 000 r/min离心2 min后去上清,用约1 mL的预冷的1×Sistrom’s洗涤2次后用100 μL预冷的1×Sistrom’s培养基重悬,最后涂布在含有卡那霉素抗性和终浓度为150 mg/L K2TeO3的平板上,30 ℃恒温培养35 d直至长出黑色的接合子。用验证引物和单酶切验证黑色的接合子,根据PCR和测序结果验证质粒是否转入成功。

1.2.3 转录组水平的分析

提取所有干扰菌株中总的RNA,用DNA酶消化所提取RNA中的基因组,用逆转录试剂盒将去除基因组后的RNA反转录成cDNA,最后用Power SYBR Green PCR试剂进行qPCR。每个反应混合物包括RT反应液2 μL (模板浓度为50 ng/μL),引物分别1 μL,SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μL,用水补足到25 μL。每个反应做3组平行,采用2–ΔΔCt(–ΔΔCt=[Ct(target)–Ct(ref)]sample–[Ct(target)–Ct(ref)]WT)相对法对基因进行定量分析[21]

1.2.4 NADP/NADPH的测定

收集发酵48 h后菌液1 mL (约1×105个细胞)用预冷的PBS清洗2遍之后,2 000 r/min离心5 min,去除上清。加入300 μL NANP/NADPH缓冲液,于−80 ℃条件下反复冻融2次,每次冻20 min,然后涡旋振荡10 s,13 000×g离心10min后,将上清转移到干净的离心管中,取50 μL转移到96孔板中,然后再加入100 μL反应混合液,混匀后在室温下反应5 min,最后加入10 μL显色剂,在室温的条件下反应约4 h后,测其在450 nm处的吸光值,得到细胞内NADP的总量;取200 μL上清液到干净的离心管中,在60 ℃的水浴锅中加热30 min,立刻将样品放在冰上冷却,快速离心,然后取50 μL的样品于96孔板中,加入100 μL反应混合液,混匀后在室温下反应5 min,最后加入10 μL显色剂,在室温的条件下反应约4 h后,测其在450 nm处的吸光值,即得细胞内NADPH的量。

1.2.5 FOH的产量测定

由于FOH具有挥发性,为了减少FOH的挥发在发酵培养液里加入了体积比为15%的癸烷[22]。发酵48 h后,收集癸烷相,以8 000×g离心10 min,去除细胞碎片,取1 mL的上清,过滤膜,采用配备火焰离子化检测器(FID)的安捷伦技术7890A气相色谱仪对FOH的产率进行了定量。样品以1:10的比例注入,在19091J HP-5柱(30 m长;0.32 mm内径);以流速为1.0 mL/min的氮气为载气,入口压力为39 psi。喷油器初始温度为250 ℃,柱式烘箱设置为80 ℃。然后以10 ℃/min的速度增加到250 ℃,并保持1 min。FOH的标准样品购自Sigma-Aldrich公司(中国上海)。

2 结果与分析 2.1 载体的验证

经过PCR、酶切酶连等多步实验,最终成功地获得了干扰质粒,用BamHⅠ单酶切原始质粒和构建成功的质粒,分别得到一条约6.5 kb和6.6 kb的条带,构建成功的质粒比原始质粒多约100 bp,与预期的单酶切结果一致;经PCR、Gibson assembly试剂组装得到强化的质粒,将阳性克隆用引物tac-F/trrnB-R进行菌落PCR验证,分别得到条带大小为1 972 bp (RSz)、1 386 bp (RSg)、2 670 bp (RSzg),与预期结果一致,质粒测序结果与原序列系列比对一致;干扰串联强化的质粒验证,将转化后长出来的阳性克隆用验证引物V-F/V-R进行PCR验证,得到长度分别为2 402 bp (RSzpi)、1 816 bp (RSgpi)、3 037 bp (RSzgpi)的条带与实验结果一致,测序结果与原序列比对一致,干扰串联强化质粒构建成功。

2.2 类球红细菌工程菌株的验证

挑选黑色的结合子,转接到含有卡那霉素抗性的液体LB中,提取质粒,然后分别用单酶切、tac-F/trrnB-R和V-F/V-R这两对引物去PCR验证,最后得出单酶切重组质粒之后的条带比原始质粒长约100 bp,tac-F/trrnB-R扩增出来的片段分别为1 972 bp (RSz)、1 386 bp (RSg)、2 670 bp (RSzg),验证引物V-F/V-R扩增出来的条带大小分别为2 402 bp (RSzpi)、1 816 bp (RSgpi)、3 037 bp (RSzgpi),以上结果均与前面实验结果相符,工程菌株构建成功。

2.3 干扰后pgi基因和gdhA基因的转录组水平分析

为了评价pgi基因和gdhA基因干扰后的转录水平,采用实时荧光定量PCR对两株干扰株进行分析。

分别挑取3个验证正确的接合子接种在含有卡那霉素抗性的液体LB中,30 ℃、220 r/min培养24 h后分别提取其总RNA,反转录等一系列操作之后,采用了q-PCR的方法,分别测定了干扰株RSpgii和RSgnhAi中pgi基因和gdhA基因的转录水平,本实验以出发菌株RS-GY2中相对应的基因丰度为1,来计算改造以后基因的相对转录水平。

图 3是干扰后的转录水平分析结果,由图 3可知,与出发菌株相比,RSpgii和RSgdhAi中pgi基因和gdnA基因的相对转录水平均有不同程度的下降。由图 3A可知,RSpgii-2和RSpgii-3干扰株pgi基因的转录水平明显下调,分别为出发菌株的0.19和0.18;gdhA基因的转录水平同样也下调比较明显,由图 3B可知,RSgdhAi-2和RSgdhAi-3的转录水平为出发菌株的0.10和0.15;实验结果表明,干扰菌株已经构建成功。

图 3 qRT-PCR检测干扰菌株目的基因的转录特征 Fig. 3 Quantitative RT-PCR analysis of the transcriptional profiles strains. The relative transcript levels pgi gene (A) and gdhA gene (B).
2.4 NADPH的测定及结果分析

分别取发酵48 h后的发酵液,经多步处理后,测其生物体内NADP/NADPH。分析结果见表 3,由表 3可知,两株干扰菌株中,RSgdhAi胞内NADPH的量与出发菌株相比,基本保持不变,而干扰株RSpgii中NADPH比出发菌株提高了12.16%;三组过表达菌株中,RSg胞内NADPH提高了23.65%,RSzg胞内NADPH的量比原始菌株高出了0.42 pmol,为5.62 pmol,而RSz胞内NADPH的量与原始菌株相比无明显变化;在干扰加强化的菌株中,RSzgpi胞内NADPH的量达到了最大,是原始菌株胞内NADPH的1.35倍,RSz胞内的NADPH的量则减少到了4.84 pmol,RSg胞内的NADPH的量基本不变。pgi基因编码的是6-磷酸葡萄糖异构酶,当pgi基因的转录水平受到抑制,6-磷酸葡萄糖转变为6-磷酸果糖的反应受到限制,将导致代谢向磷酸戊糖途径转变,同时zwfgnd也是磷酸戊糖途径中的相关基因,所以当干扰pgi基因串联共过表达zwfgnd之后,胞内的NADPH的积累量达到了最大。

表 3 胞内NADPH的浓度与NADPH/NADP+的比例 Table 3 The concentrations of NADPH and ratios of NADPH/NADP+
RS-GY2 RSgpii RSgdhAi RSz RSg RSzg RSzpi RSgpi RSzgpi
NADP(Tatal)(pmol) 21.12±0.21 19.77±0.15 22.65±0.23 17.4±0.10 26.29±0.24 25.01±0.09 17.13±0.11 17.12±0.1 17.34±0.16
NADPH(pmol) 5.2±0.02 5.83±0.13 5.14±0.15 4.92±0.08 6.43±0.09 5.62±0.2 4.84±0.14 5.1±0.02 7.02±0.11
NADPH/NADP 0.33±0.01 0.42±0.02 0.29±0.01 0.39±0.01 0.32±0.00 0.29±0.01 0.39±0.01 0.42±0.00 0.68±0.02
2.5 工程菌中FOH产量的增加

由于FOH具有挥发性,我们预先在培养基上层覆盖一层癸烷,发酵48 h后,取癸烷相过滤膜后,利用高效气相进行检测,再根据标准曲线计算出各个菌株的产量。我们分别在发酵0、12、24、36和48 h覆盖9 mL的癸烷,待发酵48 h后,分离癸烷相,取1 mL测其产量。结果如图 4所示,图 4A表示的是干扰菌株FOH的产量,由图可知,不同时间段开始覆盖癸烷的数据表明发酵开始时覆盖癸烷测得的产量最高,说明癸烷的产生是伴随着菌的生长;在相同的条件下,干扰后的菌株较出发菌株RS-GY2分别提高了57.51%和51.31%,且干扰株RSpgii FOH的产量比干扰株RSgdhAi的产量略高了4.09%;图 4B表示的是不同的强化菌株在不同时间段覆盖癸烷后FOH的产量,其中同时强化zwfgnd这两个基因,FOH的产量相较于出发菌株显著性提高,比出发菌株提高了59.09%,达到了44.18 mg/L,单独强化zwfgnd的菌株产量都有提高,分别为35.93 mg/L和40.20 mg/L,其中RSg的产量较RSz产量高11.88%。

图 4 重组菌株不同时间段覆盖癸烷后FOH产量 Fig. 4 The production of farnesol from the recombinant strains covered with decane in different time. Farnesol production of RNA interference pgi and gdhA (A) and overexpression zwf, gnd, zwf+gnd (B) covered with decane in different times.

为了进一步提高FOH的产量,我们以干扰之后产量较高的RSpgii菌株作为出发菌株,分别与zwfgnd组合调控,观察组合调控后对FOH产量的影响。在发酵前分别在每个培养基中覆盖9 mL的癸烷,发酵48 h之后测其FOH的产量,结果见图 5。由图可知,组合调控后,FOH的产量较出发菌株RSpgii的产量都有所提高,RSzpi的产量为49.88 mg/L,DCW为11.77 g/L,RSgpi的产量为54.59 mg/L,DCW为13.53 g/L,RSzgpi的产量为52.29 mg/L,DCW为11.67 g/L,其中RSgpi的产量最高,为原始菌株RS-GY2的1.97倍,但是RSgpi的生物量较高为13.53 g/L,产率为4.04 mg/g,比RSzgpi和RSzpi的产率低,RSzgpi和RSzpi的产率分别为4.48 mg/g和4.29 mg/g。实验结果表明,增加胞内的NADPH的量可以增加FOH的产量,当pgi基因的表达受到干扰,6-磷酸葡萄糖无法正常地向6-磷酸果糖转变,积累6-磷酸葡萄糖,过表达的zwf基因和gnd基因会加速6-磷酸葡萄糖向6-磷酸葡萄糖内酯方向转变,产生大量的NADPH,从而增强MEP途径的表达水平,增加FPP的前体供应,促进FPP向FOH转化,使得类球红细菌FOH的产量增加。

图 5 发酵48 h后各重组菌株中FOH产量及其生物量 Fig. 5 The production of the FOH in different recombinant strains and biomass accumulation (DCW) upon incubation for 48 h.
3 讨论

随着人们对FOH重要性的认知逐渐增加,市场对FOH的需求也越来越大。目前微生物发酵是FOH的主要生产方式,利用生物工程手段定向改造菌株为提高产量、降低成本提供了有效的方法。到目前为止,研究者已通过多个方面来提高FOH的产量。Ohto等通过在E. coli中过表达idiispA这两个基因后使得其产量达到了389 μg/L[23]。据报道,在添加油脂和洗涤剂的条件下,酿酒酵母SQ合酶缺失突变体在培养过程中产生28 mg/L的FOH。阻断SQ合成会增加细胞内FPP水平,导致FOH的形成。本实验以类球红细菌作为出发菌株,通过增加NADPH的量,从而增加MEP途径强度,使得FPP池增加,最终达到提高类球红细菌产法尼醇能力的目的。实验结果表明,在干扰pgi基因的表达的前提下,同时过表达zwf基因和gnd基因后,法尼醇的产量达到了最大为52.29 mg/L,产率达到了4.48 mg/g,产量相比与出发菌株RS-GY2提高了约88.3%。由于pgi的表达受到抑制,使得6-磷酸葡萄糖向6-磷酸果糖的转变受到影响,胞内积累大量的6-磷酸葡萄糖,当同时过表达zwf基因和gnd基因后,6-磷酸葡萄糖通过磷酸戊糖途径转移,碳代谢流向磷酸戊糖方向转变,磷酸戊糖途径通量的提高使得胞内NADPH的积累量达到最大;同时使得MEP途径的起始原料3-磷酸甘油醛的量增加,从而达到增强MEP途径的强度,使FPP池增加,最终增加法尼醇的积累量。

王崇龙等利用E. coli为出发菌株,通过过表达ispA同时导入外源MVA途径,发酵48 h后,FOH产量达到了135 mg/L[12]。虽然我们摇瓶发酵48 h后测得的FOH产量较低,但是本文的工作为使用代谢工程改造微生物提高FOH的产量提供了新的思路。由于FOH是易挥发的物质,癸烷覆盖之后,只需要从癸烷相提取FOH,避免了产物抽提等多步复杂的工作,操作简单。随着发酵工艺、调控策略、培养基等的不断优化,利用类球红细菌生产FOH的产量还将会有很大的提升。

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