花生是重要的油料作物之一，我国花生50%以上用作榨油，据报道，花生籽仁含油率每提高1个百分点，纯利润可提高7%^[1]。因此创造花生高油新种质、培育高产高油新品种对提高花生产值、增加农民收益有着重要意义^[2-3]。但目前栽培花生中缺乏高油种质资源，高油育种没有适宜的鉴定方法、育种过程存在盲目性，采用杂交育种难以获得突破性进展^[4]，目前栽培花生品种含油率一般在50%左右^[5]，极少数能达到53%以上，尤其是在我国胶东半岛、辽东半岛、广州省、吉林省等高纬度和沿海地区培育高油品种更加困难，而含油率55%以上则定为高油花生品种^[6]。诱变能够产生自然界不存在的或极为罕见的新性状、新个体^[7-10]。但突变是不定向的^[11]，诱变往往产生大量突变体，而突变体的后续鉴定需要大量人力、物力和财力^[12]。诱变结合定向筛选可解决这一难题^[13-15]，利用离体诱变结合离体定向筛选创造新种质已在多种植物上获得成功。罗静等^[16]利用EMS诱变处理草莓愈伤组织并筛选得到抗灰霉病草莓植株。陈丽等^[17]应用EMS处理杨树胚性愈伤组织，经盐胁迫定向筛选后获得了耐盐植株。李红等^[18]采用NaN₃处理苜蓿愈伤组织，对诱变处理的愈伤组织进行碱胁迫处理，获得了耐碱的变异植株。平阳霉素(PYM)是一种抗生素，作为一种新的诱变剂已在多种植物育种中应用，它与EMS的诱变特点相近，且在某些方面优于EMS，被证明具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点，具有广阔的开发和应用前景。Zhao等^[19]利用平阳霉素作为诱变剂进行离体诱变，并结合NaCl定向筛选获得了花生耐盐突变体。

我们前期研究发现，经干旱胁迫处理后的花生叶片水势与其籽仁含油率呈极显著正相关^[20]。本论文利用羟脯氨酸作为水势(渗透压)调节物质，对平阳霉素离体诱变后获得的体胚进行定向筛选，获得的再生植株后代采用系统选择，培育出了高产高油花生新品种。

供试材料为花生品种花育20的成熟种子，由青岛农业大学农学院保存。花育20号是我国主要栽培的小花生品种，是山东省和国家区域试验小粒组对照。

体胚诱导培养基为MS+2, 4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)，水势为–1.873 MPa。体胚诱导和诱变培养为MS + 2, 4-D+4 mg/L平阳霉素(PYM)，PYM作为诱变剂，水势为–1.873 MPa。体胚萌发和筛选培养基为MS+4 mg/L 6-BA+6 mmol/L羟脯氨酸(HYP)，水势为–2.079 MPa。每种培养基均添加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH调至5.8。培养条件均为(25±1) ℃，光照时间为6–19点，强度为2 000 lux。

选取成熟饱满的花育20号干种子，去子叶，将种胚用70%的酒精浸泡20 s，再用0.1%的升汞浸泡10 min进行表面消毒。用无菌水漂洗5次后，置于装有无菌水的培养瓶中浸泡12 h。取出种胚，置于无菌培养皿中分离胚小叶，接种到添加不同浓度2, 4-D (0、5、10、15、20 mg/L)的体胚诱导培养基中进行培养。每个处理重复3次，每个处理接种60个外植体。4周后统计体胚诱导率，根据试验结果确定适宜的2, 4-D浓度。

体胚诱导率=形成体胚的胚小叶外植体数/接种胚小叶外植体数×100%。

选用花育20号的胚小叶，接种在体胚诱导和诱变培养基上进行培养，诱导体胚形成，同时进行诱变处理。培养4周后，将存活的形成体胚的外植体转移到体胚萌发和筛选培养基上诱导体胚萌发，同时进行高油突变体的定向筛选。转移4周后将存活的萌发的体胚转移到植株再生和筛选培养基上培养，每4周继代培养1次，直到体胚萌发长成的小苗达1.5 cm以上。

以沙子中无菌萌发的花生实生苗作为砧木，再生小苗作为接穗，采用插接法在超净工作台内进行无菌嫁接。嫁接苗继续在沙子中培养2–3 d后，直接移栽试验田，浇足水。移栽初期2周搭塑料拱棚，上午10点至下午4点搭遮阳网，之后撤掉遮阴网和塑料拱棚，按常规进行田间管理。成熟后按单株收获再生植株的种子M_{1, 2}。

再生植株后代进行系统选育。将收获的再生植株的种子按株行种植(M₂代)，起垄单粒播种，每垄播种2行，垄距100 cm，株距20 cm，试验在青岛农业大学莱阳试验基地进行。生育期间选择出苗早、开花集中、抗逆性强的单株挂牌，结合收获期选择结果多、荚果整齐的单株作为育种材料。其他明显变异的单株作为突变体自交纯合。M₃代及以后世代继续选择单株种成株行，并结合海南加代，缩短育种年限，直到同一株行的单株间无明显分离，混收荚果形成株系。

对入选的优良株系进行产量鉴定试验，试验在青岛农业大学莱阳试验基地进行，起垄双粒播种，垄距90 cm，每垄播种2行，每行播种30穴，穴距16.7 cm，每个株系播种1垄。收获后晒干称重产量。

选择产量高、荚果整齐、抗逆性强的优良株系形成品系。对入选品系进行品种比较试验，起垄双粒播种，垄距90 cm，每垄播种2行，每行播种30穴，穴距16.7 cm，每个小区播种3垄，小区面积为13.5 m²。以诱变亲本花育20号作为对照，设置3次重复。按常规进行田间管理，收获晒干后称重各小区荚果产量。品种比较试验连续进行2年。

再生植株后代品系籽仁含油率的测定，使用脂肪提取器YLSB022并采用残余法，由农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心测试化验，每个样本重复2次，以诱变亲本作为对照。

选择高产高油品系参加辽宁省新品种备案试验，试验为春播，5月中旬播种，9月中旬收获，全省不同地域共设7个试验点，每个试验点重复3次。

花育20号胚小叶在添加不同浓度2, 4-D (0、5、10、15、20 mg/L)的体胚诱导培养基上培养1周后，胚小叶伸展，并由白色变为绿色。培养2周后开始形成体胚，4周后统计体胚诱导率于图 1。由图 1可以看出，2, 4-D浓度极显著影响体胚诱导率，随2, 4-D浓度的增加，体胚诱导率呈先升高后下降的趋势。在未添加2, 4-D的培养基上无体胚形成，在添加10 mg/L 2, 4-D的培养基上体胚诱导率最高，为92.7% (图 2A)，确定体胚诱导培养基中添加适宜的2, 4-D浓度为10 mg/L。

图 1 2, 4-D浓度对体胚诱导率的影响 Fig. 1 Influence of 2, 4-D concentration on somatic embryo induction. A, B, C, D, E indicates significantly different at P < 0.01.

图选项

将形成体胚的外植体转移到添加4 mg/L BAP的体胚萌发培养基上进行培养，体胚逐渐萌发成苗(图 2B)。调查结果显示，平均每个外植体可获得再生植株15个以上。一个种子可获得8个胚小叶，1粒种子最终可获得再生植株120个以上。

图 2 体胚形成及植株再生 Fig. 2 Somatic embryo formation and plantlet regeneration. (A) Somatic embryos formed from embryonic leaflets on induction medium containing 10 mg/L 2, 4-D. (B) Plantlets regenerated from embryogenic masses on germination medium containing 4 mg/L BAP.

图选项

以上述确立的体胚诱导方法为基础进行离体诱变。花育20号胚小叶外植体在添加4 mg/L PYM和10 mg/L 2, 4-D的体胚诱导及诱变培养基上培养4周后，外植体约50%褐化，存活的外植体大部分形成了体胚。将存活的外植体转移到添加6 mmol/L HYP和4 mg/L 6-BA的体胚萌发及筛选培养基上培养，大部分体胚褐化，仅有0.91%的体胚存活并萌发成苗(图 3A–B)。

图 3 外植体在HYP定向筛选培养基上筛选、再生、嫁接移栽及正常结实 Fig. 3 Surviving somatic embryos and plantlets on the the medium supplemented with HYP, and grafting and producing pods of regenerated plants. (A) The surviving somatic embryos and the browning explants on the somatic embryo germination and selection medium supplemented with 6 mmol/L HYP. (B) Plantlets formed from somatic embryos. (C–D) Grafted plantlets. (E) An grafted plant produced pods (The arrow stands for the position of graft).

图选项

当再生苗长到1.5 cm高时进行嫁接(图 3C)。嫁接苗在培养瓶中继续培养2–3 d，成活率100% (图 3D)。嫁接苗经驯化后移栽田间，正常生长，成熟后按单株收获荚果，所有的嫁接苗均收获到荚果(图 3E)。

收获的单株荚果种子次年按株行单粒播种，收获期观察发现再生植株的M₂代发生多样的变异。将入选育种材料的单株及突变单株在M₃代以后继续按株行播种和选择单株。直到M₅代生育期及收获后观察，遗传性状已基本稳定，按株行收获荚果形成株系。共获得了162份突变材料。这些突变系农艺性状表现出多样的变异，如突变系2-2-5-4表现为交替开花、侧枝变长(80.7 cm)、分枝数变多(25条)、荚果突变为串珠形、种皮颜色突变为紫色(图 4 A)。突变系8-3-2-4荚果变大、果形细长(图 4 B)。突变系2-1-9-2结果数较多(图 4 C)。而诱变亲本花育20号为连续开花，分枝数8–10条，荚果粗短，种皮粉红色(图 4 D)。

图 4 突变系及诱变亲本植株 Fig. 4 The plants of the mutant lines and their parents. (A): Line 2-2-5-4. (B): Line 8-2-3-4. (C): Line 2-1-9-2. (D): Parent Huayu 20.

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162份突变系中，经4代连续选择，其中12个株系表现优良，作为育种材料进行产量鉴定试验，其中8个株系荚果产量比对照花育20号增产5%以上，并且荚果整齐、抗旱性较强。这8个株系入选形成品系，继续进行两年品种比较试验。试验结果列于图 5，第一年试验结果，参试的8个品系平均荚果产量均高于对照花育20号(5 322.7 kg/hm²)，其中5个品系增产达到显著水平，增产幅度最大的是品系4-2-1-1，平均产量为6 103.4 kg/hm²，比对照增产14.7%，1-3-6-3增产10.2%，2-5-3-1增产11.3%，6-1-4-1和13-11-4-1分别增产9.5%。

图 5 突变品系和亲本花育20号的产量 Fig. 5 The yields of the mutants and the parent Huayu 20. * indicates significantly different at P < 0.05.

图选项

由图 5可以看出，第二年试验结果与第一年试验结果基本一致，5个显著增产的品系第二年也显著增产。对照花育20号平均产量为5 411.4 kg/hm²，品系4-2-1-1产量最高，平均为6 223.1 kg/hm²，比对照增产15.0%。品系1-3-6-3增产10.7%，2-5-3-1比对照增产11.1%，6-1-4-1增产10.4%，13-11-4-1增产11.8%。

检测获得的162份突变系的含油率，结果132份突变系含油率超过55%，达到高油标准，其中27份超过58%，2份超过60%，品系1-3-6-3含油率最高达到61.05% (表 1)。每个再生植株后代均有含油率55%以上的突变系。

品系1-3-6-3含油率最高，品种比较试验2年均比亲本花育20号显著增产，表现出高产性和高油性。在参加辽宁省新品种备案试验中，比对照白沙1016籽仁增产14.0%，命名为宇花9号，并通过了国家非主要农作物品种登记，登记号为GPD Peanut (2018) 370182。

宇花9号为高油小粒花生品种，春播全生育期120 d左右，夏播110 d左右。株型直立、疏枝、连续开花。主茎高37.4 cm，侧枝长40.7 cm，有效枝长7.5 cm，有效分枝数7–8条，总分枝数8–9条(图 6A)。荚果普通型，缢缩极浅，果嘴不明显，网纹浅。籽仁桃形，种皮粉红色，内种皮白色(图 6B)。百果重172.9 g，百仁重70.9 g，出米率75.82%。宇花9号含油率达61.05%，比亲本花育20号含油率高11.55个百分点。

图 6 宇花9号单株(A)及荚果籽仁(B) Fig. 6 Single plants (A), pod and kernel (B) of Yuhua 9.

图选项

离体诱变中通过胚胎发生途径再生植株能克服突变体的嵌合现象^[8]。本研究首先对胚胎发生途径有效植株再生方法进行了研究，结果表明2, 4-D浓度极显著影响体胚诱导频率。胚小叶在添加10 mg/L 2, 4-D的体胚诱导培养基上体胚诱导率最高(92%)，当转移到添加4 mg/L BAP的体胚萌发培养基上进行培养，平均每个外植体可获得15个以上再生植株，1个种子含有8个胚小叶，每个种子可获得120个以上再生植株。

PYM是一种抗生素，作为诱变剂与其他化学诱变剂相比具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点^[21-22]。通过对大豆^[23]、小麦^[24]、油菜^[25]等诱变效应的研究，肯定了其效用和应用价值。PYM的诱变机理是能够造成DNA分子结构损伤且不能被修复，与EMS相比具有更稳定的化学性质^[26]。本研究利用平阳霉素作为诱变剂添加于体胚诱导培养基中进行诱变培养，再生植株后代中获得了多个高油突变体，并育成了高产高油新品种，进一步说明平阳霉素具有良好的诱变效果。

叶片水势是表示植物水分亏缺或水分状态的一个直接指标，通过研究不同土壤水分下的植物水势的变化特征，可以了解植物的抗旱特性^[27]。杨彦会等^[28]研究中发现，在干旱胁迫下抗旱性强(多蜡质)的小麦品系较抗旱性差(少蜡质)的小麦品系旗叶水势更高。我们前期研究发现，在干旱胁迫下的花生主茎倒三叶水势与其籽仁含油率呈极显著正相关，即籽仁含油率高的花生，在干旱胁迫下叶片细胞水势高，而一般含油率的花生水势低^[20]，也即含油率高的花生抗旱性强。利用这一特点，本研究以HYP作为水势(渗透压)调节物质添加于体胚萌发培养基中降低培养基的水势，模拟干旱胁迫，培养的一般含油率花生体胚或萌发的小苗因失水而褐化凋亡，仅有含油率高、抗旱性强的花生体胚或萌发的小苗才能存活。将离体诱变存活的体胚，转移到添加6 mmol/L HYP的体胚萌发培养基(培养基水势为–2.079 MPa)上培养，大部分体胚凋亡，最终获得了少量再生小苗。再生苗经嫁接移栽田间，所有再生植株的后代均有含油率55%以上的突变系，并且姊妹系之间含油率明显分离。例如13号再生植株后代株系13-23-17-1的含油率仅为52.6% (结果未列出)，而姊妹系13 HB-6的含油率达59.48%。说明高含油量基因发生了突变，经自交纯合，导致姊妹系含油率发生分离。本研究结果说明，利用HYP作为水势调节物质添加于体胚萌发培养基中，对离体诱变形成的体胚进行离体定向筛选，能够存活的必定是高油的，而非高油的突变或未突变的细胞因失水凋亡被淘汰，这种筛选方法简单易行，可节省大量人力物力财力，提高选育效率。

本研究经离体诱变后，采用降低培养基水势定向筛选高含油量花生突变体，获得了132份含油率超过55%的高油突变体，其中27份含油率超过58%，并育成了高产高油花生新品种宇花9号。宇花9号产量比对照增产14.0%，含油率达到61.05%，是目前国际上含油率最高的花生品种。本研究结果表明，利用离体诱变、培养基降低水势定向筛选及其再生植株后代进行系统选择是定向培育高油花生品种的有效方法。本研究为花生高油育种开辟了一条新的途径。