子宫为胚胎植入和生长提供了最重要的内部环境，在妊娠建立与维持方面有着不可替代的作用。我国每年约有1 300万次人工流产发生，手术中机械性的刺激损伤可能造成感染、内膜变薄等^[1-4]，进而影响子宫腔的正常形态功能，最终导致不孕、习惯性流产等产科疾病。而子宫环境的复杂性，决定了药物很少能直接作用于患处。

子宫病理性创伤后自发修复困难。内膜与基底层同时受损，可导致内膜干细胞受损或缺失。与此同时，局部感染和炎症破坏干细胞微环境^[5-6]，导致细胞修复障碍，血管再生受阻，腺体减少萎缩，进而造成宫腔局部内膜缺失，宫壁产生纤维化或粘连等现象^[7-8]。

自组装短肽是一种新型纳米生物支架材料，具有构建仿细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的功能，能部分模拟ECM功能^[9-11]。且自组装短肽仅由氨基酸构成，对生物体无毒害作用^[12]，具有良好的生物相容性^[13]。本课题组在前期研究中发现自组装短肽在心肌修复、快速止血、皮肤创伤^[14-16]等再生修复方面具有良好应用。

本研究选用的自组装短肽Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ均由16个氨基酸残基构成，纯度分别是96.18%与97.03%。我们通过理化性质实验研究Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ自组装形态及效果；体外细胞实验检测其是否具有良好的生物相容性；通过动物实验分别探究Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ对子宫创伤模型的修复效果。

1 材料与方法 1.1 材料

本研究使用的手性自组装短肽Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ由成都赛恩贝生物技术有限公司赠送；磷酸盐缓冲剂(PBS, 北京鼎国昌盛)；高糖DMEM培养基、胰蛋白酶(Hyclone，美国)；青霉素混合液(Genview，美国)；4%多聚甲醛固定液、DAB显色试剂盒(上海碧云天)；刚果红染液(Genivew，美国)；免疫组织化学染色试剂盒(北京中杉新桥)；兔抗MMP-9抗体、鼠抗VEGF抗体(Proteintech，美国)；孕马血清注射用血促性素(PMSG，赤峰波恩药业，批号：兽药字(2012) 050074564)；注射液用绒促性素(HCG，丽珠制药)；去离子水；生理盐水。

1.2 方法 1.2.1 短肽溶液配制

分别称取Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ冻干粉末各10 mg，1 mL去离子水溶解，制成10 mg/mL短肽母液，4 ℃冰箱保存备用。等体积PBS溶液与短肽母液混合，放置于室温下，短肽可发生自组装现象，得到浓度5 mg/mL短肽水凝胶。

1.2.2 检测分析短肽二级结构

圆二色谱仪(AVIV 400 CD sepectrometer)对Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ进行CD检测：分别用PBS与短肽母液配制100 μmol/L Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ溶液，取400 μL于石英比色皿中，室温下进行CD检测^[16]。

参数设置：扫描波长190−260 nm，波长间隔0.5 s，光径2 mm。导入测量值，根据下列公式计算[θ]值，横坐标为波长，纵坐标[θ]作图^[16]。

[θ]=[m(deg)]/[10(peptide)ln]

1.2.3 宏观观察短肽自组装过程

用PBS与短肽母液分别配制5 mg/mL Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ溶液，37 ℃孵育24 h，在自组装过程第0 h、4 h和24 h，分别吸取10 μL Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ溶液滴于载玻片上，刚果红染色约20−30 s，镜检观察^[16]。

1.2.4 红细胞裂解实验

1) 生理盐水与去离子水分别配制浓度为1、10、100 μg/mL的Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ溶液；2)取SD大鼠腹主动脉血，EDTA抗凝，2 000 r/min离心15 min，弃上清；生理盐水洗涤离心3次，至上层澄清透明；3)分别使用3种不同浓度的短肽溶液稀释红细胞悬液，至其终浓度为2%，作为实验组；去离子水稀释红细胞悬液为阳性对照组；生理盐水稀释红细胞悬液为阴性对照组；4)样本置于37 ℃下水浴孵育1 h，5 000 r/min离心15 min；吸取200 μL上清液，酶标仪检测其在570 nm处的吸光度值。

1.2.5 构建Hela细胞贴壁和空间三维培养体系

细胞贴壁培养：将Hela细胞复苏后加入培养基重悬为细胞悬液，接种于25 cm²培养瓶，加入高糖DMEM培养基(10%胎牛血清，1%青链霉素混合液)，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。

细胞三维培养：待细胞二维培养生长覆盖率达90%时进行三维培养。用去离子水和短肽粉末分别配制5 mg/mL Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ短肽溶液，4 ℃保存。0.25%胰蛋白酶消化后离心，弃上清液加入蔗糖溶液吹打重悬，将细胞浓度调整为约1×10⁵个/mL，分别加入等体积Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ短肽溶液，将混合液滴加入96孔板，置于细胞培养箱中孵育5 min，然后每孔加入100 μL培养基，放置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱孵育。

1.2.6 CCK-8检测三维环境中细胞活性

1) 取96孔板中贴壁和空间三维培养的Hela细胞，在实验第1、3、5天进行酶标仪检测；2)每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2–4 h；3)检测450 nm处吸光度(OD)值，其中OD值越大，则细胞活力越强，细胞增殖数量越多。

1.2.7 制备大鼠假孕模型

雌性SD大鼠于颈部皮下注射50 IU PMSG，48 h后皮下注射30 IU HCG，定义注射HCG 24 h后，为假孕第1天^[17]。

1.2.8 建立大鼠子宫创伤模型

1) 体重200-220 g的SD假孕模型大鼠，提前8 h对动物禁食，7%水合氯醛溶液按0.4 mL/100 g进行麻醉。将麻醉后动物固定在特定试验台上，备皮消毒；2)沿腹白线，距耻骨联合上方约2 cm处，纵切一个约2.5−3 cm的切口，依次切开皮肤、肌层、腹膜，进入腹腔，暴露Y型子宫；3)在距子宫交汇处约1 cm处，水平作一个约0.5 cm的切口，放入特制刮宫针，沿子宫系膜对侧宫腔行走约1 cm后退出；4)右侧子宫用微量注射器沿划痕注入30 μL 5 mg/mL Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ短肽溶液，右侧注入等量生理盐水；5)缝合子宫，温热生理盐水冲洗腹腔，依次缝合关闭腹腔；6)术后第3、7、14天颈椎脱臼处死大鼠，组织取材。用4%多聚甲醛溶液浸泡子宫组织样本，48 h后石蜡包埋并切片、制片。

1.2.9 子宫组织苏木精-伊红(HE)染色

1) 组织包埋块脱蜡：放入二甲苯-Ⅰ浸泡10 min后，再放入二甲苯-Ⅱ浸泡5 min；2)梯度水化处理：放入100%酒浸泡1min后；放入95%酒精浸泡30 s；再放入80%酒精浸泡30 s；最后放入75%酒精浸泡30 s；用自来水冲洗2–3次，每次约5 min；3)染色：苏木素染色8 min；自来水冲洗2–3次；1%盐水乙醇6 s；氨水反蓝作用20 s，自来水冲洗；镜检至细胞核呈清晰蓝色；伊红染色2 min，自来水冲洗；4)梯度脱水处理：放入80%酒精浸泡30 s后；再放入95%酒精浸泡30 s；然后放入100%酒精浸泡5 min；最后放入无水酒精浸泡2 min；5)透明：放入二甲苯-Ⅰ浸泡2 min，再放入二甲苯-Ⅱ浸泡2 min；6)中性树脂封片，光镜下观察。

1.2.10 子宫组织免疫组织化学染色

1) 烤片：切片置于60 ℃电热恒温烤箱，过夜；2)组织包埋块脱蜡：放入二甲苯-Ⅰ浸泡10 min后，再放入二甲苯-Ⅱ浸泡5 min；3)梯度水化处理：放入100%酒浸泡1 min后；放入95%酒精浸泡30 s；再放入80%酒精浸泡30 s；最后放入75%酒精浸泡30 s；用自来水冲洗2–3次，每次约5 min；4)修复：放入0.1 mol/L柠檬酸混合液，高温加热至沸腾，自然冷却。去离子水冲洗5 min，PBS冲洗5 min；5)阻断：3% H₂O₂孵育15 min，阻断内源性过氧化物，PBS冲洗10 min；6)滴入一抗，4 ℃孵育过夜；7)室温孵育30 min，滴入二抗，孵育30 min；8) DAB显色；9)苏木素染色，脱水处理步骤同前；10)中性树脂封片，光镜下观察。

2 结果与分析 2.1 手性自组装短肽自组装形态及效果

短肽Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ在37 ℃下孵育24 h后，可在倒置EP管中观察到其呈现凝胶状(图 1)；进一步刚果红染色检测，我们发现短肽在盐离子溶液中自组装0 h时，呈现较为分散的细密流沙状结构；4 h时，出现松散膜片结构；24 h后，Sciobio-Ⅱ和Sciobio-Ⅲ形成了颜色透明、稳定均一的膜结构(图 2)，其中Sciobio-Ⅱ成膜速度更快。由此，我们初步推测Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ，可为细胞培养提供足够的支撑，从而进行下一步实验。

2.2 手性自组装短肽的二级结构特征

经过圆二色谱(CD)分析，两条自组装短肽的二级结构均为稳定的β折叠结构。且Sciobio-Ⅱ在198 nm处有一强正峰，在212 nm处有一强负峰。Sciobio-Ⅲ与Sciobio-Ⅱ呈镜像相关，在198 nm处有一强负峰，212 nm处有一强正峰(图 3)。

2.3 红细胞膜裂解实验

通过分析数据可得，3种不同浓度的Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ短肽溶液(1、10、100 μg/mL)均对红细胞的裂解程度较低。与阳性对照组裂解度相差30%左右。结果表明，手性自组装短肽在自组装24 h前后对细胞膜都没有破坏与裂解作用，可作为下一步动物实验材料参与大鼠子宫创伤修复实验(图 4)。

2.4 细胞在二维、三维环境中的形态观察

光学显微镜下观察可以看到，在二维培养中Hela细胞呈贴壁生长，分布均匀，细胞多为菱形；在三维培养中，细胞为圆球形，细胞透亮边界清晰，表现为分层生长。在三维环境中，细胞相较于二维环境生长较为缓慢，但生长状态较好，细胞数量持续增长(图 5)。

2.5 细胞在贴壁和空间三维环境中的CCK-8 (Cell counting kit-8)检测

CCK-8检测结果显示，Hela细胞在由Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ构建的空间三维环境中增速与二维环境相比较为缓慢，但未出现细胞数量减少，说明Hela细胞可以在Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ构建的三维环境中生长，短肽Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ对细胞正常生长、增殖无抑制作用(图 6)。

2.6 大鼠子宫组织HE染色

实验第3天，Sciobio-Ⅱ短肽组基层细胞排列基本有序，Sciobio-Ⅲ短肽组腺体形态与Sciobio-Ⅱ组相比较为混乱，对照组宫腔内可见脱落物，内膜形态异常，内膜层与基层界限模糊。第5天，Sciobio-Ⅱ组基层细胞增多，Sciobio-Ⅲ组较Sciobio-Ⅱ组仍可见基层细胞排列紊乱，对照组出现膜上皮细胞粘连。实验第14天，短肽组基本完成修复过程，与Sciobio-Ⅲ组相比，可见Sciobio-Ⅱ组基底层细胞数量更多，且排列趋向规律，腺体增多；对照组仍可见内膜与腺体出现复层扁平上皮细胞，腺体上皮细胞异常(图 7)。

2.7 免疫组织化学染色

实验选取在子宫修复过程中发挥重要作用的基质蛋白酶-9 (MMP-9)与血管内皮生长因子(VEGF)进行免疫组织化学染色。结果显示：实验第7天，VEGF主要表达在Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ腔内膜上皮、腺体上皮广泛表达，对照组阳性表达水平较低；第14天，3组均可见VEGF阳性水平上升，短肽组表达量更高，其中Sciobio-Ⅱ组在近腔侧基质中表达略高于Sciobio-Ⅲ组。MMP-9主要在近肌层基质中，实验第7天，短肽组阳性表达均高于对照组，其中Sciobio-Ⅱ组阳性水平略高于Sciobio-Ⅲ组；第14天，对照组中阳性表达分散在内膜基质中，短肽组仍集中在近肌层基质，其中Sciobio-Ⅲ组表达水平略高于Sciobio-Ⅱ组(图 8)。

3 讨论

子宫创伤是人工流产术后常见损伤，临床上，宫腔手术或感染一旦损伤子宫内膜基底层，会导致上皮、间质细胞再生障碍，新生血管形成受损，内膜难以实现自我修复^[11]，宫腔缺乏内膜覆盖，壁层可发生纤维化、瘢痕化及粘连，进而产生宫腔粘连(IUA)、月经不止、子宫瘢痕等并发症^[17-19]。传统组织工程支架材料如合成聚酰类、去细胞基质、胶原类等存在组织强度大^[20]、制备工序复杂和机械强度不足等缺点^[21-22]。因此，构建适合体内培养的优质支架材料，成为子宫组织工程研究的关键。

本研究所用两条自组装短肽是由氨基酸合成的新型高分子材料，具有良好的生物相容性^[23-25]，在室温下均可自组装形成水凝胶结构；同时圆二色谱(CD)结果显示，Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ均可自组装形成纳米纤维交织的膜状结构，两者的二级结呈镜像相关的β折叠结构，其中Sciobio-Ⅱ的成膜速率更快。通过上述结果我们推测，Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅱ可为组织细胞提供一定的强度支撑，且构建成分单一、结构稳定。通过体外红细胞裂解实验与CCK-8细胞活性检测，提示在自组装短肽构建三维培养体系中，Hela细胞可持续生长，其中Sciobio-Ⅱ组细胞活动状态更加稳定。以上结果提示，手性自组装短肽对细胞无裂解作用，且细胞能在短肽形成的三维环境中持续增殖。动物实验我们制备假孕大鼠模拟刮宫术构建子宫创伤模型，结果显示，与对照组相比，短肽组中组织修复速度更快。在7 d与14 d两个时间点，短肽组VEGF表达量均高于对照组，其中Sciobio-Ⅱ组阳性水平更高。同时，与对照组相比，Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ实验组MMP-9表达量更稳定，其中Sciobio-Ⅱ与Sciobio-Ⅲ相比，两个时间点MMP-9表达量提升幅度更小。有研究者认为组织修复前期MMP-9高表达有利于细胞增殖与细胞外基质(ECM)分泌^[26-28]，后期相对低表达可促进多余ECM吸收，消除水肿。由此我们推测手性自组装短肽在促进子宫修复过程中模拟了部分ECM功能，改善了创面细胞微环境，从而促进部分生长因子与蛋白的表达释放，加快创伤修复进程。

但手性自组装短肽促进修复的分子机制，以及其作为组织工程支架材料与种子细胞、生长因子结合应用研究，还需要进一步探索。期望其能为临床减少宫腔术后并发症提供新材料和新思路，并具有更广泛的研究价值与市场前景。

致谢 感谢成都赛恩贝公司对本研究的赞助和支持。