2019, Vol. 35中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 李洪英, 常瑞, 朱秋劲, 朱旭玲, 徐阿奇, 周樱子, 晏印雪
- Li Hongying, Chang Rui, Zhu Qiujin, Zhu Xuling, Xu Aqi, Zhou Yingzi, Yan Yinxue
- 染料木黄酮对大鼠体内N-羟乙酰神经氨酸含量的影响及其与唾液酸转移酶相互作用的探讨
- Effects of genistein on N-glycolylneuraminic acid content in rats and the interaction with sialyl transferase
- 生物工程学报, 2019, 35(5): 857-870
- Chinese Journal of Biotechnology, 2019, 35(5): 857-870
- 10.13345/j.cjb.180505
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文章历史
- Received: December 6, 2018
- Accepted: January 29, 2019
引用本文
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2. 贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州 贵阳 550025
2. Guizhou Province Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Storage and Processing, Guiyang 550025, Guizhou, China
红肉的摄入与癌症、心血管和炎症等疾病密切相关，这是因为红肉中含Neu5Gc[1-7]。Neu5Gc主要存在于脊椎动物体内，极少部分存在于微生物中，通常与糖蛋白或者糖脂以结合态的形式存在于体内，很少以游离的形式存在[8-10]。其中结合态Neu5Gc含量是游离态的Neu5Gc含量的30倍，游离态Neu5Gc仅占2%左右[11]，且结合态的Neu5Gc才具有引发炎症反应的生物学功能。
大多数哺乳动物自身能合成Neu5Gc，但人类由于在进化的过程中丢失了编码胞苷-磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH)基因，所以正常人体内不能合成Neu5Gc[12-14]，人体内的Neu5Gc主要通过红肉的摄入而积累，当红肉中的Neu5Gc进入人体后，游离态的Neu5Gc迅速随代谢产物(如尿液)排出体外，结合态的Neu5Gc则能在肠道、肝脏、血液中稳定存在，被机体当作外来物质，产生异种抗体，诱发机体处于低度炎症状态[15]。大量的流行病学资料表明，约20%的恶性肿瘤由炎症诱发或促进[16-17]。此外，红肉易被产志贺毒素型大肠杆菌(Shiga toxin-type Escherichia coli，STEC)污染；若人体上皮细胞中存在结合态的Neu5Gc，当它与志贺毒素结合时会引起胃肠道不适，从而引发腹泻等症状；而当肾内皮细胞中存在聚集结合态的Neu5Gc时，与STEC产生的志贺毒素结合会破坏内皮细胞，进而诱发溶血性尿毒症综合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)，引起血性腹泻并伴随肾衰竭等症状[1, 18-20]。可见，大宗畜产品红肉中的Neu5Gc严重威胁着人类的健康，因此，设法从动物性食品的源头上降低Neu5Gc的含量显得尤为必要。
目前降低红肉中Neu5Gc含量的研究才刚刚起步，蒋芸等[21]分别使用物理和化学酶解法对猪肉和牛肉进行烹饪前的处理，发现它们对红肉中结合态Neu5Gc含量的降低有着不同程度的效果。Bardor等[22]利用阿米洛利和Gen培养人类的癌细胞及突变细胞，发现它们能降低细胞中Neu5Gc的含量，且Gen对Neu5Gc的抑制效果更好。然而，目前通过添加某种安全试剂降低动物体内Neu5Gc生物合成的方法鲜有报道。
本文基于Neu5Gc的合成路径，寻找在哺乳动物体内抑制Neu5Gc的生物合成的抑制剂。Neu5Gc在哺乳动物体内的生物合成路径[14]如图 1所示。由图 1可知，Neu5Gc的生物合成涉及CMAH和ST，故抑制ST的活性是降低对促炎起主要贡献的结合态Neu5Gc含量的关键；关于抑制ST的研究，王棐等[23]通过分子对接和分子动力学模拟的方法探讨了大豆皂苷Ⅰ抑制ST的机理，但在活体内还没有相关的实验验证。
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| 图 1 Neu5Gc在哺乳动物体内的生物合成 Fig. 1 Biosynthesis of Neu5Gc in mammals. |
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Gen是从大豆中提取的异黄酮类化合物，存在于富含豆肽的多种天然植物中，在大豆中占到1.5%，明显高于大豆皂苷(0.6%)[24]，无毒副作用，在动物细胞中具有广泛的药理学功效。Gen还可诱导T淋巴瘤细胞、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌细胞的凋亡，具有抗肿瘤作用[25]。可见Gen对降低动物体内Neu5Gc的生物合成必然存在一定的影响，然而，目前这种影响及其作用机制尚不清楚。
本研究首先考察Gen对大鼠体内Neu5Gc的生物合成的影响；其次，通过分子对接探讨Gen降低大鼠体内Neu5Gc合成作用机制。本文以期为从饲喂环节降低红肉中Neu5Gc的含量提供实验依据；主要对原料肉(猪、牛、羊)的养殖具有一定指导意义；为后续探索降低宰前红肉中Neu5Gc含量的方法奠定研究基础。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器采用试剂包括：Gen (纯度 > 97%)(上海阿拉丁试剂有限公司)；色谱纯试剂有：乙腈、甲醇(德国Applichem公司)、1, 2-二氨基4, 5-亚甲基二氧苯盐酸盐(DMB)、β-巯基乙醇(Sigma公司)；分析纯试剂有：氢氧化钠、硫代硫酸钠、无水亚硫酸钠(天津市致远化学试剂有限公司)、冰乙酸、硫酸铵(成都金山化学试剂有限公司)；Neu5Gc标准品。
主要仪器设备：Agilent-1260 Infinity高效液相色谱(配有荧光检测器和自动进样器)；TGL20M台式高速冷冻离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机、SCIENTZ-10N真空冷冻干燥机、SB25-12DT超声清洗器(宁波新芝有限公司)；Heal Force超纯水系统（力新仪器（上海）有限公司）；ADVENTURER电子分析天平(奥豪斯仪器有限公司）。
开源免费软件AutoDock vina、贵州大学云计算平台共享软件SYBYL2.0。
1.2 实验动物SPF级雄性SD大鼠(实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2014-0011)，4周龄，体重(70±2) g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供。所有大鼠适应性喂养7 d后开始实验，大鼠饲料由长沙市天勤生物技术有限公司提供。
1.3 方法 1.3.1 实验分组及样品采集80只SD雄性大鼠，适应性饲养7 d后，随机分成2组，40只/组，即对照组、Gen组。分组后连续灌胃60 d，对照组灌胃5%的乙醇(1 mL/只)，Gen组灌胃300 mg/(kg·d) (根据Gen的安全剂量范围及在动物体内发挥生理作用的特点选定300 mg/(kg·d)为实验剂量[26-30]) Gen的溶液(1 mL/只) (溶液配制方法：Gen的质量根据300×大鼠体重(kg)×数量(只)计算，1-4周Gen的质量分别为8.40、10.08、9.82和10.08 g，由于Gen不溶于水而溶于乙醇，故先用5 mL的酒精溶解Gen，再用蒸馏水稀释定容)；动物房温度控制在(23±2) ℃，湿度60%；自由进食、自由进水。
灌胃15 d、30 d、45 d、60 d后，在对照组和Gen组中分别选10只大鼠，用乙醚迷晕后，断颈处死，取大腿肌肉、肝脏组织、肾脏组织于−80 ℃保存待用。
1.3.2 肌肉组织及内脏组织前处理分别称取1 g后腿肌肉及左肾组织、肝脏组织于匀浆瓶中，加入10 mL的30%的硫酸铵磨成匀浆液，−80 ℃冷冻12 h沉淀蛋白质后冷冻干燥成粉末；将干燥后的粉末加入10 mL浓度为2 mol/L的醋酸在80 ℃水浴3 h进行酸解，使样品中结合态的Neu5Gc解离为游离态的Neu5Gc[1, 8]；之后13 363 ×g离心15 min，并用0.45 µm的有机滤头过滤后于−80 ℃冷冻12 h，之后进行真空冷冻干燥成粉末；将冻干粉溶于1.0 mL的蒸馏水和0.2 mL NaOH (浓度0.1 mol/L)中，在37 ℃的条件下水浴30 min去乙酰化处理；取去乙酰化的样品900 µL，加入100 µL的衍生剂，在避光的条件下衍生150 min后进行高效液相色谱检测样品中游离态和结合态Neu5Gc总的含量。
1.3.3 衍生剂的配置及HPLC检测条件衍生剂的配制参考了文献[1, 21]的配置方法：0.008 mol/L的DMB、0.25 mol/L的Na2S2O3·5H2O、1.5 mol/LCH3COOH（冰醋酸）分析纯、0.25 mol/L亚硫酸钠（分析纯）、0.8 mmol/L的2-巯基乙醇（色谱纯）。
衍生条件：将100 µL的衍生剂加入到盛有900 µL样品瓶中，50 ℃避光衍生2.5 h，冷却至室温后进样进行HPLC-FLD分析。
HPLC检测条件：德国默克Li Chrosorb RP-18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 µm)，流动相为乙腈-甲醇-超纯水(8:7:85，V/V)，流速为0.9 mL/min，柱温30 ℃，进样体积10 µL，荧光检测器激发波长373 nm、发射波长448 nm。
为探讨Gen降低大鼠体内Neu5Gc合成的作用机制，参考本团队前期探索和总结的方法[31]，采用分子对接探讨Gen与ST可能的作用过程，具体步骤如下。
1.3.4 AutoDock vina对接采用分子对接和分子动力学分析探讨Gen与ST相互作用的可能过程。利用AutoDock vina和SYBYL2.0中的Surflex-Geom对接模块对对接过程中涉及的蛋白活性残基进行分析。对接受体准备：采用北京创腾科技有限公司的Discovery Studio (DS)客户端(2.5版)显示ST (2wnb)的三维结构信息，去水加氢后发现其中有两个底物配体，配体1为胞苷单磷酸，配体2由CG31345、A2G1346、Gal1347三个残基组成。保留配体1，删除配体2，记下配体1的空间位置参数(x=23.926 9，y=31.865 3，z=34.235 1)，保存蛋白文件。对配体2操作如上，得到配体2位置空腔参数：x=34.034 286，y=23.860 486，z=40.470 714。在AutodockTool- 1.5.6中打开保存的蛋白文件，定义原子类型为AD4并加casteiger电荷，然后将两文件保存为pdbqt格式，作为对接受体。对接配体准备：Gen分子结构用Chemoffice构建，用Openbable转换为mol2文件。对Gen分子进行加氢和电荷处理时采用的是Autodock Tools工具，并将其原子格式设置为pdbqt文件。盒子大小设为size_x=30，size_y=30，size_z=30，选用“拉马克遗传算法”开展对接构象的搜索，最大对接构象数目控制为9，对接完成后，根据打分函数值的综合得分及其均方根偏差(Root mean square deviation，RMSD)值来评价和确定最佳的对接构象。对接结果采用Ligplot+软件来统计Gen与配体之间发生相互作用的氢键和氨基酸残基数目[23, 31]。
1.3.5 SYBYL-Surflex对接采用Surflex-Dock(SFXC)-Geom模式进行对接，采用加氢后删除配体、水分子以及杂原子的方式对受体唾液酸转移酶进行处理。在Tripos力场下，优化唾液酸转移酶的两个配体，优化的方法每步都采用最陡下降法，并加Casteiger- Huckel电荷处理，其余参数默认。对接空腔以配体形式产生，分别提取配体1和配体2产生对接位点，在其周围0.5 nm范围半径内产生活性空腔。唾液酸转移酶的两配体的均方根偏差RMSD值最小值控制在0.5，对接构象的数目控制在20种。采用SYBYL对对接结果进行分析。
1.3.6 Gromacs动力学模拟在上述优化对接结果的基础上，选取其中对接较好的复合物进行动力学模拟。具体方法参考本团队探索的方法[31]，首先获得目标配体的限制势文件及拓扑文件，即在AMBER99-ILDN力场存在的条件下，以TIP3P三点水为模型，利用AmberTools 17中的GAFF力场进行处理产生拓扑文件；而限制势文件是通过genrestr工具产生的，然后再以DPOSRES对位置进行限制。盒子大小设为：边界距离复合物文件大小为0.8 nm。向体系中加入抗衡离子以平衡电荷，能量最小优化采用是最陡下降法，优化500步，模拟步长为0.01 ps。邻居列表的生成选择“cutoff-scheme=Verlet”，静电作用选择coulomb type，非键相互作用采用PME截断方式。使用LINCS算法对键进行约束，每50步输出一次能量信息，控温和控压的时间为100 ps，进行限制性动力学模拟，使体系达到平衡，热浴设定为velocity-rescale，平衡温度控制为147.86 ℃，时长为0.2 ps。压浴设定为Berendsen，采用各项同性控压，控压时间设为0.5 ps，动力学模拟过程中仅约束氢键，且每采用最陡下降法优化一次并输入一次能量信息，而每优化两次的时候输出一次坐标信息。限制性动力学完成后，对ST和Gen进行索引的设置并对其进行分组，进行200 ns的常规动力学模拟；即每步为0.002 ps，每1 000步输出一次能量信息。
模拟达到平衡后，在180-200 ns范围内，基于分子力学泊松-波尔兹曼表面积(MM-PBSA)法对配体和蛋白结合自由能△Gbind进行计算。受体和配体间的亲和力与△Gbind值成反比，即△Gbind值越低，受体与配体间的亲和力越好。
MM-PBSA法计算自由能主要包括以下4个过程：
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(1) |
式中，Gcomplex是总的自由能、Gligand为配体独立的自由能、Gprotein为溶剂中蛋白独立自由能。其中，Gligand和Gprotein由公式(2)计算：
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(2) |
式中，Gx代表复合物；EMM是分子力学能；TS是熵变对自由能的贡献值；由于构象熵对本文变化影响不大，故TS一般设置为0；Gsolvation为溶剂化能。EMM由公式(3)计算，而Gsolvation则由公式(4)计算：
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(3) |
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(4) |
其中，Ebond代表成键作用，Enobonded为非键作用力。Gpolar由波兹曼方程计算；Gnonpolar通过SASA模型、SAV和WCA模型计算。
1.3.7 标准曲线的绘制称取Neu5Gc标准品0.032 5 g，并加入100 mL超纯水溶解标准品，将其配置成1 mol/mL标准品溶液。分别取50、100、200、300、400 µL的标准溶液和850、800、700、600、500 µL的超纯水及加入100 µL的DMB衍生液中(表 1)，充分振荡混匀后，进行避光衍生2.5 h，用HPLC检测。每个浓度标准品均进样3次，以标准品浓度为纵坐标，以峰面积的平均值为横坐标，制作标准曲线，计算标准曲线方程[1, 21]。
样品中Neu5Gc含量降低百分比按式(5)进行计算：
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(5) |
式中，C0表示对照组中Neu5Gc含量，C1表示Gen组样品中Neu5Gc的含量。
1.3.9 数据处理分析方法数据以x±s表示，用IBM SPSS Statistics进行统计分析，两样本均采用t检验，根据清华大学出版社出版的张永爱主编的医学统计分析教材，P < 0.05为差异有统计学意义，涉及的图形用OriginPro 2016平台完成。
2 结果与分析 2.1 对照组中Neu5Gc及Neu5Gc标品的HPLC检测图谱将对照组样品按照“1.3.2和1.3.3”方法处理，按照“1.3.4”色谱条件进行3次分析，测得50 µmol/L Neu5Gc标品的保留时间为10.080 min (图 2A)，对照组中后腿肌肉组织中Neu5Gc保留时间为10.077 min (图 2B)，肝脏组织中Neu5Gc保留时间为10.187 min (图 2C)，肾脏组织中Neu5Gc保留时间为10.158 min (图 2D)。
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| 图 2 50 µmol/L的Neu5Gc标品(A)、对照组后腿肌肉组织中Neu5Gc (B)、肝脏组织中Neu5Gc (C)和肾脏组织中Neu5Gc (D)的HPLC图 Fig. 2 The HPLC chromatograms of the 50 µmol/L Neu5Gc standard (A), the hind leg muscle tissue (B), the liver tissue (C) and the kidney tissue (D) of the control group. |
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所得标准曲线方程为y=0.299 51x+33.812 2，R2=0.993 7，表明标准品在50-400 µmol/L浓度范围内，峰面积与浓度具有较好的线性关系。
2.3 Gen对大鼠后腿肌肉中Neu5Gc的影响实验结果显示灌胃15、45、60 d Gen组Neu5Gc含量均低于对照组，且差异具有统计学意义(P < 0.05) (图 3)，各组不同灌胃时间Neu5Gc的含量如表 2所示。灌胃15 d时，Gen组Neu5Gc的含量比对照组显著降低，对照组中Neu5Gc的含量与Gen组中Neu5Gc的含量之间的差异有高度统计学意义(P < 0.01)，但Neu5Gc的含量仅降低了2.50 µg/g，而这一降低值在生物学上实际意义不明显。灌胃30 d时，用HPLC-FLD法检测时系统未对其进行积分，说明在此灌胃时间段内，大鼠后腿肌肉中Neu5Gc的含量很低，以至于未检出，由此可以推测Gen在灌胃30 d抑制Neu5Gc的合成效果最好。灌胃45 d时，Gen组中Neu5Gc的含量降低了32.65%，对照组中Neu5Gc的含量与Gen组中Neu5Gc的含量之间差异具有高度统计学意义(P < 0.01)，Neu5Gc的含量降低了8.18 µg/g，在生物学上实际意义明显。灌胃60 d时，Gen组中Neu5Gc的含量降低了12.72%，对照组中Neu5Gc的含量与Gen组中Neu5Gc的含量之间差异具有高度的统计学意义(P < 0.01)，Neu5Gc的含量降低1.8 µg/g，而这一降低值在生物学上实际意义不明显。实验结果表明，在对照组中，在灌胃15-45 d时间段内，Neu5Gc的含量在逐渐增大，而在45-60 d时间段内，Neu5Gc含量在降低。造成这种结果的原因可能是：1)大鼠本身的差异，在饲养过程中，这一组大鼠个体大小差异较大；2)随着饲养时间的延长，大鼠个体增大，而排泄物的量也随着增加，另有文献报道[15]游离态的Neu5Gc在体内快速随着体液排出，所以随着排泄物的增加而游离态的Neu5Gc排出量增加，导致结合态的Neu5Gc合成减少，所以导致大鼠肌肉组织中Neu5Gc的含量减少。Gen组，Neu5Gc的含量与对照组有相似的变化趋势，除了上述对照组存在的原因外，还有一种可能是Gen在动物体内发生生理活性时具有剂量依赖性[27, 32]，随着饲养时间的延长，大鼠体内蓄积Gen的量增多，增强了对Neu5Gc合成的影响。
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| 图 3 Gen对大鼠后腿肌肉组织中Neu5Gc含量的影响 Fig. 3 Effect of genistein on the content of Neu5Gc in rats hind legs muscle tissues. * P < 0.05; ** P < 0.01. |
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| Group | 15 d | 45 d | 60 d |
| Control group (µg/g) | 18.15±1.12 | 25.05±1.72 | 14.14±0.60 |
| Gen group (µg/g) | 16.87±0.15 | 15.65±1.32 | 12.34±0.45 |
| Neu5Gc content reduction (µg/g) | 2.50 | 8.18 | 1.80 |
由图 4可知，各时间段实验组肝脏组织中Neu5Gc的含量均低于对照组，各组在不同灌胃时间内Neu5Gc的含量如表 3所示。
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| 图 4 Gen对大鼠肝脏组织中Neu5Gc含量的影响 Fig. 4 Effect of genistein on the content of Neu5Gc in rat livers tissues. * P < 0.05; ** P < 0.01. |
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| Group | 15 d | 30 d | 45 d | 60 d |
| Control group (µg/g) | 29.60±3.11 | 29.71±1.20 | 26.27±1.48 | 32.99±3.52 |
| Gen group (µg/g) | 25.02±2.31 | 25.74±4.04 | 21.86±1.48 | 28.93±2.21 |
| Neu5Gc content reduction (µg/g) | 4.57 | 4.07 | 4.41 | 4.06 |
| Group | 15 d | 30 d | 45 d | 60 d |
| Control group (µg/g) | 212.50±20.03 | 113.56±11.24 | 149.47±13.83 | 153.53±12.25 |
| Gen group (µg/g) | 164.13±39.39 | 95.69±19.12 | 100.47±17.72 | 136.00±12.30 |
| Neu5Gc content reduction (µg/g) | 49.00 | 17.53 |
灌胃15 d时，Gen组中Neu5Gc的含量与对照组相比显著降低，Gen组中Neu5Gc含量降低了15.45%，经统计学分析，差异具有统计学意义(P < 0.05)，Gen组中Neu5Gc的含量降低了4.57 µg/g，而这一降低值在生物学上实际意义不明显。灌胃30 d时，Gen组中Neu5Gc的含量与对照组相比显著降低，Gen组中Neu5Gc含量降低了13.35%，Gen组中Neu5Gc含量降低了4.07 µg/g，而这一降低值在生物学上的实际意义不明显。灌胃45 d时，Gen组Neu5Gc的含量与对照组相比显著降低，Gen组中Neu5Gc的含量降低了16.80%，经统计学分析差异具有高度的统计学意义(P < 0.01)，Neu5Gc的含量降低了4.41 µg/g，而这一降低值在生物学上差异性实际意义不明显。灌胃60 d时，Gen组中Neu5Gc含量降低了12.30%，对照组中Neu5Gc的含量与Gen组中Neu5Gc的含量之间差异有高度统计学意义(P < 0.01)，Neu5Gc的含量降低了4.06 µg/g，而这一降低值在生物学上的实际意义不明显。整个饲养阶段，在45 d时，对照组和Gen组中Neu5Gc的含量最低，Neu5Gc的含量降低值最高。然而，随着灌胃时间继续延长，Neu5Gc的含量开始升高，60 d时，对照组和Gen组中Neu5Gc的含量达到最高。
2.5 Gen对大鼠肾脏中Neu5Gc的影响由图 5可知，各时间段Gen组肾脏组织中Neu5Gc的含量均略低于对照组，但是15 d和30 d时经统计分析，差异不显著(P > 0.05)，而灌胃45 d时，Gen组Neu5Gc的含量与对照组相比显著降低，Gen组中Neu5Gc的含量降低了32.78%，经统计学分析差异具有高度的统计学意义(P < 0.01)，Gen组Neu5Gc的含量降低了49.00 µg/g，在生物学和统计学上具有高度的统计学意义。灌胃60 d时，Gen组Neu5Gc的含量与对照组相比显著降低，Gen组中Neu5Gc的含量降低了11.42%，经统计学分析差异具有高度的统计学意义(P < 0.01)，Gen组Neu5Gc的含量降低了17.53 µg/g，在生物学和统计学都具有实际意义。这一结果与肌肉和肝脏组织存在一定的差异。在本实验中Gen对肌肉和肝脏组织中Neu5Gc的含量影响较肝脏明显，这可能与Gen在肾脏组织中存在的代谢机制与其在肌肉和肝脏组织中不同有关[29]。
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| 图 5 Gen对大鼠肾脏组织中Neu5Gc含量的影响 Fig. 5 Effect of genistein on the content of Neu5Gc in rat kidneys tissues. * P < 0.05; ** P < 0.01. |
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已知对接受体ST晶体结构解析得到的活性位点残基为：Gln108、Asn150、Met172、Asn173、Tyr194、Clu196、Phe212、Tyr233、Arg269、Thr272、Gly273、Gly293、Trp300、His302、Val318、His319[33-34]。
ST和Gen在配体1和配体2位置进行AutoDock vina对接后，打分最高的对接构象其结合能均为−35.564 kJ/mol，仅从结合能无法判定最佳结合位置，故继续进行相互作用残基分析和SYBYL-Surflex对接分析。
图 6A为Gen与ST在配体1位置完成Auto Dock vina对接后的二维相互作用模式图。由图可知，ST和Gen产生氢键的残基是Asn150、Ser151、Gly291、Glu324，共产生了4个氢键。产生疏水相互作用的残基为：His302、His301、Trp300、Ile274、Phe292、Ser271、Thr328、Ser325。图 6B为Gen与ST在配体1位置SYBYL-Surflex对接后相互作用示意图，可发现Gen和ST残基Asn173、Asn150、Gly293、Glu324、Ser271产生氢键，数目为5个。对比ST在配体1处的活性残基，Gen与其中的残基Asn150、Asn173、Gly273、Gly293产生了氢键作用，并且和残基Trp300、His302产生了疏水相互作用。综合以上分析，Gen在ST配体1处占据了ST中7个活性残基的6个，且和配体2处的活性残基没有相互作用，表明Gen在配体1处结合作用较强。
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| 图 6 ST配体1与Gen对接模式图 Fig. 6 Binding mode of sialyltransferase ligand 1 with genistein by docking. (A) A two-dimensional analysis of genistein and ST after docking Auto Dock vina at the position of ligand 1. (B) A schematic diagram of the interaction between genistein and SYBYL-Surflex at the position of ligand 1. |
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图 7A为Gen与ST在配体2位置与Auto Dock vina对接后的二维相互作用模式图。在配体2处，ST和Gen产生氢键的残基是Asn150、Ser151、Glu324、Gly291，共产生了4个氢键。产生疏水相互作用的残基是His302、Trp300、Ser325、Phe292、Ile274、Thr328、Ser271共7个残基。图 7B为Gen与ST在配体2位置SYBYL-Surflex对接后相互作用示意图，由图可知仅和残基Tyr233、Thr272、Gly273产生氢键。综合以上分析，可知Gen在ST配体2处和ST活性残基Thr272、Tyr233产生氢键，而在配体1处不仅与ST活性残基Asn150、Gly273产生氢键，还和活性残基Trp300、His302产生疏水相互作用，因此Gen更易与ST配体1位点产生相互作用。
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| 图 7 ST配体2与Gen对接模式图 Fig. 7 Binding mode of sialyltransferase ligand 2 with genistein by docking. (A) A two-dimensional interaction analysis diagram of genistein and ST after docking with Auto Dock vina at the position of ligand 2. (B) A schematic diagram of the interaction between genistein and SYBYL-Surflex at the position of ligand 2. |
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对Gen与ST在配体1处AutoDock vina对接后最佳复合物进行水环境下200 ns的分子动力学模拟，分子动力学模拟过程一般以均方根偏差RMSD来衡量体系的稳定性[34]；从模拟结果可知，ST和ST-Genistein复合物的RMSD值在70 000- 130 000 ns时趋于平衡并收敛于0.25 nm附近，表明体系模拟过程中较为稳定。
图 8为动力学模拟平衡时ST和Gen结合模式图。氢键是维持底物和配体稳定结合的重要分子间作用力[34]。从图 8可以看出，动力学平衡后Gen主要和ST残基His319、Thr328、Gly293、Ser151产生4个氢键。对比Gen在配体1处与STAutoDock vina和SYBYL-Surflex对接揭示的可能相互作用残基结果，发现残基Ser151和Gly293与对接分析结果一致。这表明Ser151和Gly293在复合物体系稳定性中可能有重要贡献。
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| 图 8 ST-Genistein动力学平衡后结合模式图 Fig. 8 ST-Genistein binding mode diagram at MD equilibrium position. |
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通过g_mmpbsa工具对动力学平衡后Gen与ST的结合能进行计算分解，结果显示：总结合能为−82.691 kJ/mol；对结合过程起促进作用的是范德华力(−155.167 kJ/mol)、静电作用力(−62.223 kJ/mol)和溶剂可积表面作用力(−14.502 kJ/mol)；对结合过程起抑制作用的是极性溶剂化能(149.201 kJ/mol)。
图 9为ST-Genistein在动力学模拟相互结合过程中重要氨基酸残基的能量贡献。从图 9可知，ST中与Gen产生氢键作用的残基Asn150、Ser151和Glu324主要贡献了静电相互能，与Gen产生疏水作用的残基Phe292、His302、Thr328、His319、Trp300和Ile274主要贡献了极性作用力，这和对接分析的结果是一致的，表明分子间弱相互作用主导了Gen对ST活性抑制的机制。
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| 图 9 ST-Genistein结合位点残基能量分解图 Fig. 9 ST-Genistein binding residue energy decomposition map. |
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Neu5Gc在哺乳动物体内主要是以α2→8与寡糖连接和以α2→5与寡糖连接，形成结合态的Neu5Gc，极小部分以游离的形式存在[14]。而HPLC-FLD法能直接检测游离态的Neu5Gc，但是不能直接检测与糖蛋白和糖脂连接的结合态的Neu5Gc，因此，检测组织中总的Neu5Gc含量时，需将Neu5Gc从糖复合物上释放出来。结合先前的研究[1, 8]，本研究选择2 mol/L的醋酸在80 ℃水浴3 h进行酸解，使各组织中结合态的Neu5Gc解离为游离态的Neu5Gc，然后用HPLC-FLD检测组织中游离态和结合态Neu5Gc总的含量。
实验结果表明，Gen对大鼠不同组织中Neu5Gc的含量具有不同的影响效果，并且不同灌胃时长的影响效果不一样；在肌肉组织中，灌胃时间段内，Gen组Neu5Gc含量与对照组相比降低极显著(P < 0.05)，且灌胃30 d时，后腿肌肉组织中未检测到Neu5Gc，可能的原因是后腿肌肉中Neu5Gc量很少，达不到HPLC最低检测限，或是根本不存在Neu5Gc，但是进一步的依据还需后续大量的实验证实；而在肝脏组织中，整个灌胃时间内，Gen组Neu5Gc的含量显著低于对照组(P < 0.05)，且在灌胃45 d时，Gen对肝脏组织的中Neu5Gc的含量影响最明显，Neu5Gc的含量降低了16.80%，体内Neu5Gc的含量也最低，若灌胃时间继续延长，Neu5Gc的含量开始升高，60 d时，对照组和Gen组中Neu5Gc的含量达到最高；在肾脏组织中，直到灌胃45 d时，Gen组中Neu5Gc的含量才显著低于对照组(P < 0.01)，Gen组中Neu5Gc的含量降低了32.78%。Gen对不同部位Neu5Gc的含量影响效果不一样，这主要是因为：1)由于Gen具有雌激素活性和抗雌激素活性，当它与雌二醇受体结合时，动物的生理状态、给药途径、局部浓度以及内源性雌激素水平等均影响生物学功能[29, 35]；2) Gen在哺乳动物中存在着不同的代谢机制；3)哺乳动物不同身体部位对Gen的吸收和代谢速率也不同[32, 35]。
3.2 Gen对Neu5Gc含量降低的机制探讨Neu5Gc的生物合成涉及CMAH和ST，其中ST是结合态Neu5Gc合成的关键酶[34]，故抑制ST的活性是降低对促炎起主要贡献的结合态Neu5Gc含量的关键。
分子对接研究结果表明：Gen在大鼠体内占据ST活性位点His319、Ser151、Gly293、Thr328，并与其形成稳定的氢键，与残基His302、His301、Trp300、Ser271、Phe292、Thr328、Ser325、Ile274形成疏水相互作用，从而竞争性地降低了ST的活性，表明Gen在动物体内降低Neu5Gc的生物合成可以通过抑制ST的活性来实现。有研究报道[36-37]Gen可作为酪氨酸蛋白激酶抑制剂，通过去极化内皮超氧化物产生刺激物，抑制磷酸化的G蛋白Rac膜移位，达到抑制胞内还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性的目的，而Neu5Gc的合成需要还原型辅酶Ⅱ(NADPH)或NADH及Fe2+，所以使Neu5Gc的生物合成受到限制，从而达到降低大鼠体内肌肉和内脏组织中Neu5Gc含量的目的。
4 结论本文实验结果揭示了Gen具有降低大鼠后腿肌肉、肾脏组织、肝脏组织中Neu5Gc的含量的效果。在不同的灌胃时间和不同的组织器官中，Gen对Neu5Gc含量的影响存在差异。在肌肉组织中，灌胃30 d时抑制效果最好，未能检出Neu5Gc；在肾脏和肝脏组织中灌胃至45 d时抑制效果最好，其Neu5Gc的含量分别降低了31.04%和21.66%；且内脏组织中Neu5Gc的含量都高于肌肉组织中的含量。
分子对接结果反映Gen在生物体内抑制Neu5Gc生物合成的机制如下：4个氨基酸残基(His319、Ser151、Gly293、Thr328)与Gen形成稳定的氢键作用，8个氨基酸残基(His302、His301、Trp300、Ser271、Phe292、Thr328、Ser325、Ile274)与Gen形成疏水相互作用，占据了结合态Neu5Gc生成关键酶ST与底物结合的活性位点，所以Gen是ST的竞争性抑制剂，通过与ST底物作用间接地抑制了ST的活性，从而限制了游离态Neu5Gc向结合态Neu5Gc的转化，最终达到降低Neu5Gc生物合成的目的。本实验方法和所获数据对采用饲养方式降低红肉类动物中Neu5Gc的含量具有指导意义。
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