酸性蛋白酶又称天冬氨酸蛋白酶，主要来源于动物脏器和微生物分泌物，是一种适合在酸性条件(pH 2.0–5.0)下水解蛋白质的酶类，其被广泛应用于食品^[1-7]、畜牧^[8-9]、医学^[10]、皮革^[11]以及水产加工^[12]等领域。酸性蛋白酶主要通过微生物发酵获得。产酸性蛋白酶的菌种包括黑曲霉、红曲霉、宇佐美曲霉、米曲霉等。

米曲霉作为美国FDA公布的安全菌株，具有蛋白酶系丰富、酶活高、不产毒素等诸多优点，是我国传统酿造食品酱、酱油和酒类的主要生产菌种^[13-14]。然而，米曲霉菌株普遍产中性蛋白酶和碱性蛋白酶的能力较强而产酸性蛋白酶的能力偏弱^[15]，目前对米曲霉来源酸性蛋白酶的研究主要集中于菌株的筛选与诱变、产酶条件优化、酶学特性研究等方面^[16-19]，有关米曲霉酸性蛋白酶基因异源表达与酶学性质研究尚未有报道。此外，米曲霉酸性蛋白酶主要通过固态发酵生产，存在发酵周期长、劳动强度大、质量不稳、纯化困难等缺点，限制了其规模化生产。

基于巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris的蛋白表达系统具有杂蛋白分泌较少、培养成本低廉、发酵工艺成熟等优点^[20-26]，具有实现米曲霉酸性蛋白酶的工业化生产的潜力。本研究通过宏基因组测序，从发酵豆制品中获得米曲霉酸性蛋白酶的编码基因pepA，并在毕赤酵母中实现异源表达，同时对重组酸性蛋白酶的酶学特性展开研究，以期为米曲霉来源酸性蛋白酶的规模化生产奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

毕赤酵母GS115菌株、pPIC9K质粒均为本实验室保存；大肠杆菌Escherichia coli DH5α、Trelief^TM SoSoo Cloning Kit购自北京擎科新业生物技术有限公司；Plasmid Mini KitⅠ、Cycel-pure Kit、Gel Extraction Kit购自美国OMEGA Bio-Tek公司；限制性内切酶BamHⅠ、限制性内切酶NotⅠ、dNTPs购自上海Fermentas公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、琼脂糖购自英国OXOID公司；甲醇购自美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。大肠杆菌培养基LB、毕赤酵母培养基YPD、选择培养基MD、诱导表达培养基BMGY和BMMY的培养基配方见Invitrodgen公司毕赤酵母操作手册。

1.2 方法 1.2.1 酸性蛋白酶基因的获取

提取发酵豆制品微生物菌群宏基因组，利用二代测序技术进行测序。通过功能基因注释，挖掘获得酸性蛋白酶基因。

1.2.2 重组表达载体pPIC9K-pepA的构建

以特异性引物AOX-F1和AOX-R1 (序列见表 1)扩增目的基因pepA，回收PCR产物。用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ对表达质粒pPIC9K进行双酶切，纯化回收线性化质粒。在55 ℃条件下利用重组酶Trelief^TM SoSoo Cloning Kit进行重组，将重组产物转化至E. coli DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，用BamHⅠ和NotⅠ进行双酶切验证并测序。

1.2.3 毕赤酵母重组菌株的构建与筛选

将构建成功的重组表达质粒pPIC9K-pepA与毕赤酵母GS115感受态混合，混匀后，转入冰预冷的0.2 cm电转杯，冰上放置1 min后电击(1.5 kV、25 μF、200 Ω、6 ms)转化，电转结束后迅速加入1 mL 1 mol/L冰预冷的无菌山梨醇至杯中，于超净台内将所有溶液转至灭菌离心管中，30 ℃下静置培养1 h后，取300 μL涂布于MD平板，30 ℃下倒置培养3−4 d后，随机挑取若干单菌落，用YPD液体培养基振荡培养24 h，提取染色体DNA，以表达载体pPIC9K的通用引物AOX-F、AOX-R进行PCR鉴定，鉴定成功的菌株通过酶活力测定进一步筛选。

1.2.4 重组菌株的诱导表达

毕赤酵母含有醇氧化酶基因启动子(PAOX1)，在甲醇的诱导下，PAOX1可驱动外源基因大量表达^[27]。将筛选成功的菌株接种于含5 mL YPD培养基的试管中，30 ℃、200 r/min振荡培养1 d，按2%体积将种子液接种于含50 mL BMGY培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振荡培养1 d，离心收集菌体，然后全部转入含50 mL的BMMY培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振荡培养，每隔24 h添加甲醇至终浓度为0.5%，每隔24 h取样检测菌液浓度及发酵上清液酸性蛋白酶活力，实验重复3次，上清液浓缩后进行SDS-PAGE分析^[27]。

1.2.5 重组蛋白的酶活力测定

酶活力测定参考GB 1886.174-2016食品安全国家标准，以1%的酪蛋白为底物，采用Folin-酚法进行酶活测定。以1 mL液体酶在40 ℃和pH 3.0条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位，用U/mL表示。

1.3 酶学性质分析 1.3.1 最适反应温度与温度稳定性

按1.2.5的方法，在30–60 ℃，每间隔10 ℃取样测定酶活，每个反应设3个平行，以最高酶活为100%，计算其他不同温度下的相对酶活，确定酶的最适反应温度。

将酶液分别置于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃水浴锅中，保温15 min后取出酶液，测定残余酶活力，每个反应设3个平行，以所测最高酶活为100%，计算各个温度条件下的相对酶活，考察不同温度下的热稳定性。

1.3.2 最适反应pH与pH稳定性

在pH 2.0−7.0下测定酶活，以最高酶活力为100%，计算其他不同pH下的相对酶活，每个反应设3个平行，探讨不同pH值对酶活力的影响。

将酶液置于pH 1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0的反应体系中，2 h后取出酶液，测定残余酶活力，每个反应设3个平行，以所测最高酶活为100%，计算各个pH条件下的相对酶活，确定酶的pH值稳定性。

1.3.3 金属离子对酶活力的影响

为分析金属离子对该酸性蛋白酶的影响，将不同的金属离子(Fe³⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Na⁺、K⁺、Ag⁺)分别添加到酸性蛋白酶酶反应体系中，使金属离子终浓度为5 mmol/L，以不加金属离子的样品酶活为100%，每个反应设3个平行，计算不同金属离子存在下的相对酶活，考察金属离子对酶活力的影响。

2 结果与分析 2.1 米曲霉酸性蛋白酶基因的克隆与重组载体的构建

利用二代测序技术对发酵豆制品进行宏基因组测序，通过功能基因注释，挖掘得到一种酸性蛋白酶基因pepA，其长度为1 215 bp，共编码287个氨基酸。利用MEGA4.6软件对不同微生物来源的酸性蛋白酶氨基酸序列构建进化树(图 1)，并进行同源性分析，发现该酸性蛋白酶与来自米曲霉RIB40的酸性蛋白酶(GenBank基因登录号: XM_001824123.3)的序列完全一致^[28]，与来自烟曲霉af293的酸性蛋白酶相似性为70.69%^[29]，与来自黑曲霉CBS 513.88的酸性蛋白酶相似性为66.58%^[30]。

以提取的宏基因组为模板，经引物AOX-F1和AOX-R1 PCR扩增，回收PCR产物，经PCR扩增，得到1 200 bp左右的片段(图 2)。在55 ℃条件下进行重组，将重组产物转化至E. coli DH5α感受态细胞中，获得重组菌，提取质粒，经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后，如图 3所示，得到两条大小分别为9 000 bp和1 200 bp的两条带，表明目的基因已经插入到pPIC9K载体上。测序结果表明该转化菌的质粒中确实含有目的基因片段，且阅读框正确，表达质粒pPIC9K-pepA构建成功。

2.2 重组菌株的诱导表达

利用电转化的方式将表达质粒pPIC9K-pepA转入毕赤酵母GS115，利用组氨酸缺陷型MD培养基筛选阳性转化子，提取重组酵母菌基因组DNA，以其为模板，利用毕赤酵母表达载体通用引物AOX-F、AOX-R和目的基因特异性引物AOX1-F、AOX1-R进行PCR鉴定^[31]。从图 4可以看出，使用表达载体通用引物，阳性重组菌扩增出1 600 bp左右的片段，使用基因特异性引物，扩增出1 200 bp左右片段，条带大小与理论值相符，证明pPIC9K-pepA与毕赤酵母GS115染色体基因组重组成功。

将阳性菌株接种于以甘油为唯一碳源的培养基中，30 ℃培养1 d后，收集菌体进行甲醇诱导培养，每隔24 h取样，进行菌体浓度和酶活的测定(如图 5所示)，随着发酵的不断进行，重组菌株浓度也逐渐增加，当发酵4 d后，菌体浓度达到最大，OD₆₀₀达到45，此时酶活也达到最高，大约为50.62 U/mL。

酸性蛋白酶经诱导表达后，取上清液进行离心、超滤浓缩，取浓缩后的上清蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图 6所示，分子量50 kDa处有明显的条带，无明显杂蛋白，可以开展后续酶学性质方面的研究。

2.3 酶学性质分析 2.3.1 最适温度与温度稳定性

如图 7A所示，该酶最适反应温度为50 ℃。当低于50 ℃时，随着反应温度的升高，酶活力逐渐增加。在50 ℃下，酶活力最高，为30 ℃下的2.5倍，但高于50 ℃时，酶活力随着反应温度的升高迅速下降。温度为60 ℃时，该酶基本失活。由图 7B可知，该酶在40 ℃以下放置15 min后仍然具有较高的活性。

2.3.2 最适反应pH值与pH稳定性

该酸性蛋白酶的最适pH为4.5 (图 8A)。当pH < 4.5时(2.0−4.5)，随着pH值的增加，酸性蛋白酶的酶活力逐渐增大。酸性蛋白酶在pH 4.5下的酶活力是pH 2.0下酶活力的6倍。但当pH > 4.5时，随着pH值的增加，酸性蛋白酶的相对酶活力迅速降低。图 8B为酸性蛋白酶在pH 1.0–7.0下的稳定性。由图可知，该酸性蛋白酶在pH 3.0–4.0下放置120 min后，相对酶活仍可达70%以上。

2.3.3 常见金属离子对酸性蛋白酶活性的影响

金属离子可以影响酶结构的正确折叠，进而影响酶活力。为分析金属离子对酸性蛋白酶酶活力的影响，以不添加金属离子的反应体系为对照，测定不同金属离子(Fe³⁺、Al³⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Na⁺、K⁺和Ag⁺)对酶活力的影响。如图 9所示，该酸性蛋白酶可显著被Mn²⁺和Cu²⁺激活。添加5 mmol/L的Mn²⁺和Cu²⁺时，该酸性蛋白酶的酶活力分别为对照的2.6倍和1.3倍。而Fe³⁺、Fe²⁺与Ca²⁺对酸性蛋白酶具有显著的抑制作用。由此可见，不同的金属离子对酸性蛋白酶酶活力具有不同的激活或抑制作用。

3 讨论

酸性蛋白酶在制革工业、食品行业、畜牧业、医药等行业应用广泛，然而却受到酶不易获取、分离纯化困难、酶学性质不稳定等因素限制。由于毕赤酵母表达系统菌株稳定，发酵水平高，分泌能力强，自身蛋白分泌少^[32]，目前已有黑曲霉、宇佐美曲霉、牛胃、猪胃等来源的酸性蛋白酶实现了在毕赤酵母中的异源表达，却少有米曲霉酸性蛋白酶的相关报道。

宏基因组技术将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体，自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系，可以从微生物的天然环境中直接提取基因组遗传物质和寻找新基因，大大地拓展了微生物学的研究思路与方法^[33]。本研究利用宏基因组测序及注释技术从发酵豆制品中获得了编码来源于米曲霉的酸性蛋白酶基因pepA，尽管与来源于米曲霉RIB40的酸性蛋白酶基因序列一致，然而，到目前为止尚未见到由这一基因序列表达的酸性蛋白酶的酶学性质报道。此外，调研也没有获得其他米曲霉来源、可与pepA进行同源序列对比的酸性蛋白酶基因序列。

本研究基于分泌型表达载体pPIC9K携带的外源基因表达可抑制毕赤酵母自身蛋白表达的特点^[34]，利用pPIC9K载体，首次在毕赤酵母GS115中成功表达了米曲霉来源的酸性蛋白酶基因pepA。发酵所得上清液中蛋白组分单一，重组酸性蛋白酶活力约为50.62 U/mL。王鑫等^[35]将来自黑曲霉CBS 513.88、与PepA相似性为66.58%的酸性蛋白酶在毕赤酵母中进行表达，测得重组黑曲霉酸性蛋白酶的酶活为8.76 U/mL。邱重晏^[36]研究了粗糙脉孢霉酸性蛋白酶基因在毕赤酵母S115中的表达，测得重组粗糙脉孢霉酸性蛋白酶最高酶活为6.8 U/mL。与上述研究相比，本研究的重组酸性蛋白酶的酶活较高。而且，随着后续发酵条件优化以及密码子优化等分子生物学实验的开展，PepA的酶活力可进一步提高。

Tsujita和End ^[37]发现来自米曲霉365-U-64-1的酸性蛋白酶具有底物选择特异性。在以牛血清蛋白为底物时，最适pH值为4.2，在pH 5.0、50 ℃下加热10 min，仍可保持70%以上的酶活。Vishwanatha等^[38]发现米曲霉MTCC 5341分泌的酸性蛋白酶最适温度和pH值分别为55 ℃和3.2，在40−57 ℃和pH 2.5−6.0下可保持一定的稳定性。Yin等^[39]发现来自米曲霉BCRC 30118的酸性蛋白酶最适温度和pH值分别为60 ℃和3.0，Fe²⁺、Fe³⁺与Hg²⁺会抑制酶活。王鑫等^[35]则发现由黑曲霉CBS 513.88分泌的酸性蛋白酶最适温度和pH分别为50 ℃和3.0，Fe²⁺、Ca²⁺和Mn²⁺可促进酶活，而Cu²⁺和Fe³⁺则可抑制酶活。本研究中的重组米曲酸性蛋白酶PepA的酶学性质与上述报道的曲霉酸性蛋白酶存在一定的差异，其最佳温度为50 ℃，40 ℃下较为稳定，最适pH为4.5，在pH 3.0−4.0酶活力较为稳定，金属离子Mn²⁺和Cu²⁺是该酶的激活剂，而Fe²⁺、Fe³⁺和Ca²⁺对酶活抑制程度较大。文献表明毕赤酵母表达蛋白的糖基化会影响其分泌及功能^[40]。当糖基化修饰发生在表达蛋白的折叠有序区域时，会降低其稳定性^[41]。如马清等^[42]推断N-糖基化修饰导致毕赤酵母异源表达的β-甘露聚糖酶其局部结构改变，使之变为相对不耐热的结构，导致其热稳定性下降。王越等^[43]认为毕赤酵母对蛋白的过度化糖基修饰，会造成产物的活性位点遮蔽。因此，虽然缺少天然野生型PepA的酶学性质信息，但考虑到PepA潜在多个N-糖基化修饰位点，推测PepA的酶学性质差异可能与其在毕赤酵母表达过程中的多肽链的错误折叠及蛋白糖基化作用有关^[44]。

本研究实现了米曲霉酸性蛋白酶在毕赤酵母中的异源表达并对其酶学性质进行了表征，为酸性蛋白酶的异源表达研究及应用推广提供了借鉴参考，同时为食品、医药和皮革等工业提供了新型的米曲酸性蛋白酶来源。