番茄红素是类胡萝卜素的一种，具有强抗氧化性和极强的清除自由基的能力^[1]，对防治前列腺癌、肺癌、乳腺癌等有很好的疗效，能有效抑制癌细胞扩散^[2-4]。番茄红素除了用于生产保健食品和药品外，还能添加到冰淇淋、蛋糕等食品中，提高其营养价值，具有巨大的市场需求。微生物发酵生产天然番茄红素不受光照、气候、产地等条件的限制，且产品具有经济、安全等优势，因此该技术受到国内外市场的广泛青睐。

番茄红素等萜烯类化合物合成的前体物质异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)，可以经甲羟戊酸途径(MVA途径)和2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)两条途径合成(图 1)。近年来对重组大肠杆菌提高番茄红素产量的改造主要集中在提高MEP途径关键基因表达、引入外源MVA途径基因提高前体物质供应方面。另外，近年来部分研究组通过代谢流分析等研究了非代谢途径基因表达水平对萜类化合物产量的影响^[5-9]。Alper等利用代谢流分析，验证了敲除谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)、丙酮酸脱氢酶基因(aceE)、转醛醇酶基因(talB)、甲酸脱氢酶基因(fdhF)对番茄红素产量的影响，发现同时敲除gdhA、aceE和fdhF，产量提高37%^[5]。Choi等发现高表达磷酸果糖激酶基因(pfkA)、6-磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)、果糖-二磷酸醛缩酶Ⅱ基因(fbaA)、磷酸甘油醛异构酶基因(tpiA)、异柠檬酸脱氢酶基因(icdA)和苹果酸脱氢酶基因(mdh)可以提高番茄红素产量，fbaA、tpiA和mdh效果最明显。gdhA和2, 3-二磷酸甘油酸磷酸变位酶基因(gpmAB)双敲除，同时高表达mdh和磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因(pps)，番茄红素产量达到283 mg/L^[6]。Farmer等通过高表达pps，平衡磷酸烯醇丙酮酸PEP和3-磷酸甘油醛(G3P)供应提高番茄红素产量^[7]。Sun等调控MEP途径关键基因、中央代谢途径和ATP合成途径关键基因表达，进一步提高番茄红素产量^[8]。Wu等通过增加产番茄红素大肠杆菌株细胞膜的含量，增加菌体承载番茄红素的能力进一步提高番茄红素产量^[9]。

图 1 重组大肠杆菌中番茄红素合成途径(表示包含多步催化反应) Fig. 1 Construction of lycopene synthetic pathway in E. coli through MVA and MEP pathway. represents multi-steps reaction.

图选项

将MVA途径基因引入大肠杆菌可以提高萜类化合物前体物质供应，提高番茄红素产量^[10-14]。含有来自链霉菌属(Streptomyces sp. CL190)的整个MVA途径的重组大肠杆菌，番茄红素产量是仅含有MEP途径的重组大肠杆菌的2倍。但是，甲羟戊酸途径酶的高水平表达可能抑制细胞生长^[11]。Pitera等发现过表达乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因(atoB)、羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因(mvaS)和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1 (hmg1)，可以使MVA途径中间体羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMGCoA)积累，从而抑制了细胞生长^[15]。当使用MVA途径增加紫穗槐二烯产量时，由erg12编码的甲羟戊酸激酶(MK)被鉴定为另一种限速酶^[16]。因此，MVA途径各基因平衡表达，减少MVA途径有毒中间产物积累，成为提高番茄红素产量的重要手段。

Ye等用Ⅱ型限制性内切酶基础上的模块(Type Ⅱs restriction based combinatory modulation，TRCM)构建MVA途径5个基因的RBS文库，根据菌株颜色，筛选到分别使β-胡萝卜素产量提高86%和96%的质粒^[17]。本研究从已经精细调控MEP途径基因的产番茄红素菌株LYC101出发，研究MVA途径协调表达对番茄红素产量的影响，并整合MVA途径基因使其稳定表达，提高番茄红素的产量和产率。

氨苄青霉素、氯霉素和SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒小量快速提取试剂盒购自美国Axygen公司；Trans 2K Plus DNA Marker、EasyTaq PCR SuperMix DNA聚合酶购自北京全式金生物工程公司；PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶和DNaseⅠ (Recombinant DNaseⅠ，RNase-free，Cat，No 2270 A)购自宝生物工程(大连)有限公司；Gold ViewⅠ型核酸染色剂购自北京索莱宝科技有限公司；Phusion^TM超保真DNA聚合酶购自NEB公司；番茄红素标品购自美国Sigma公司(Cat. No. 75051)；其他试剂均为分析纯。

紫外可见分光光度计，Shimadzu UV-2550 spectrophotometer (Shimadzu，Kyoto，Japan)；PCR扩增仪，Eppendorf Mastercycler gradient；全自动凝胶成像系统，AlphaImager HP；电转仪MicroPulser；台式高速离心机，Eppendorf 5415D；高速冷冻离心机，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色谱，Agilent Technologies Series 1200。实时定量PCR仪，CFX connect^TM Real-Time system (Bio-Rad，Hercules，USA)。

本研究所用菌株和质粒见表 1。

LB培养基：1 L培养基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化钠；氨苄青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素终浓度分别为100、34、50 μg/mL。LB固体培养基含1.5%的琼脂。

LB+2%甘油培养基：1 L培养基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g氯化钠和20 mL甘油。

保存于−80 ℃的菌种在LB平板上划线活化，挑取单菌落接种到15 mm×100 mm试管(含4 mL LB培养基)中，37 ℃、250 r/min培养24 h，1%的接种量转接到100 mL三角瓶(含10 mL LB+2%甘油培养基)中，37 ℃、250 r/min培养24 h。收集菌体用于测定番茄红素含量。每个待测样品分别有3个平行样，实验结果取自3个平行的平均值。

测定番茄红素产量时，先取500 μL待测菌液，于13 000 r/min离心5 min，无菌水清洗后，用1 mL丙酮悬浮沉淀，在55 ℃黑暗条件下萃取15 min，然后将样品在14 000 r/min下离心10 min，含有番茄红素的上清过滤后用于测定番茄红素产量。用高效液相色谱测定番茄红素的浓度^[12]。检测条件：VWD检测器，Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇：乙腈:二氯甲烷(21:21:8)，流速1.0 mL/min，时间20 min，柱温30 ℃，检测波长480 nm。每个待测样品分别有3个平行样，实验结果取自3个平行的平均值。用购自Sigma公司的番茄红素标准品构建HPLC标准曲线。单位细胞干重(DCW)用1 OD₆₀₀=0.343 g干细胞来换算。

用Golden Gate方法构建质粒^[17-18]，首先构建pPoxB-N20质粒，用于将外源基因通过cas9辅助方法插入到重组大肠杆菌的丙酮酸氧化酶基因(poxB)位点。以pACYC184-gRNA质粒为模板，以N20-B-F1/N20-B-R1扩增质粒骨架、以poxB-N20-B-F2/N20-B-R2为引物扩增含poxB基因上的N20片段的骨架，用poxB-bsaI-F1/poxB- bsaI-R1扩增待整合区域，将3个片段用Golden Gate方法进行连接，得到pPoxB-N20质粒，构建流程见图 2。其中poxB-N20-B-F2引物上含cas9识别的poxB基因的一段与GCC相邻的20个碱基(CGCCGACACGTTAGTGCTACT)，通过PCR将这20个碱基连接到gRNA上，用于识别目标DNA，并对其进行切割。

图 2 质粒构建流程图 Fig. 2 Construction of plasmid.

图选项

然后构建用于重组的pPoxB-ALV23质粒。用poxB-bsaI-F2/poxB-bsaI-R2对pPoxB-N20质粒进行扩增，得到含同源重组的poxB同源臂和cas9识别位点的N20的片段。用MVA-bsaI-F/MVA- bsaI-R扩增pALV23质粒，得到pALV23质粒上MVA途径几个基因及其启动子序列，将两片段用Golden Gate方法进行连接，得到pPoxB-ALV23，用于在LYC101中进行同源重组。构建菌株及所用质粒见表 1。本研究所用引物序列见表 2。

根据Zhao等文献报道^[19]，用CRISPR-Cas9系统辅助整合MVA途径基因。在LYC101菌株中转化pRed_Cas9和pPoxB-ALV23质粒，然后用阿拉伯糖诱导cas9表达，对染色体poxB的N20区域进行切割，pPoxB-ALV23提供poxB同源臂和MVA途径基因及启动子进行整合。整合后用mvaE-430-r/poxB-yz-up引物进行验证，整合成功、测序正确菌株命名为LYC102。验证引物见表 2。

为了消除MVA途径中间产物积累对细胞生长的影响，本研究室用TRCM方法，通过构建RBS文库，将来源于粪肠球菌Enterococcus faecalis CGMCC No.1.2135的乙酰辅酶A乙酰转移酶/HMG-CoA还原酶基因(mvaE)和mvaS基因，以及来源于肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae CGMCC No.1.8722的甲羟戊酸激酶基因(mvaK1)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(mvaK2)和甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因(mvaD)用不同RBS连接到同一质粒上，得到使MVA途径协调表达、从而β-胡萝卜素产量提高的一系列质粒^[17]，其中pALV23和pALV145使β-胡萝卜素产量最高，为了研究MVA途径基因在重组大肠杆菌中对番茄红素产量的影响，本研究将这两个质粒转化到两株产番茄红素重组大肠杆菌LYC001和LYC101中进行研究。LYC001是在整合来自成团泛菌Pantoea agglomerans的crtEIB基因的基础上，分别用M1-37和M1-46启动子对MEP途径的idi和dxs进行调控的菌株，而LYC101是在LYC001基础上对中央代谢途径基因和MEP途径关键基因ispG和ispH进一步调控所得，LYC101的番茄红素产量远远高于LYC001菌株^{[9, 20]}。用这两株菌为出发菌株，研究两个质粒分别对两株菌番茄红素产量的应用，考察质粒在高、低产菌株作用是否相同。

结果如图 3所示，LYC101中MEP途径协调表达，消除中间体HMBPP积累引起的细胞毒性，细胞生长略优于LYC001，细胞OD₆₀₀比LYC001高16.5%，而番茄红素产量是LYC001的3.75倍。将pALV23和pALV145转化LYC001和LYC101菌株后，对细胞生长没有太大影响(图 3A)。将pALV23和pALV145转化LYC001后，番茄红素产量分别提高了1.98倍和2.9倍，分别为14.87 mg/g DCW和19.45 mg/g DCW，两个质粒对番茄红素产量提高与Ye文献中对β-胡萝卜素产量提高结果一致，pALV145质粒提高类胡萝卜素产量效果优于pALV23质粒。将pALV23和pALV145转化LYC101后，番茄红素产量分别提高了83%和37%，分别为34.12 mg/g DCW和25.66 mg/g DCW。pALV23质粒提高番茄红素产量效果优于pALV145质粒，因为LYC101番茄红素产量高于LYC001，推测在类胡萝卜素产量不同的不同菌株中，使类胡萝卜素产量更高的MVA途径各基因表达比例并不相同，所以在低产类胡萝卜素菌株中，pALV145质粒优于pALV23，而在高产类胡萝卜素的菌株中，结果相反，可能和代谢流和代谢中间体积累有关。

图 3 MVA质粒在产番茄红素菌株中验证 Fig. 3 Lycopene production and cell growth of strains with pALV23 and pALV145. (A) Cell growth. (B) Lycopene yield.

图选项

因为质粒表达基因时，往往因为质粒不稳定而使质粒大量丢失，从而影响工程菌目标产物的产量^[21]，为了使MVA途径基因稳定表达，本研究将MVA途径基因整合到LYC101的poxB位点。

分别扩增出构建poxB-N20质粒的3个条带，结果如图 4A所示，分别得到2.2 kb的骨架1和400 bp的骨架2，以及2.9 kb的poxB基因片段。将3个片段用Golden Gate方法连接后，取阳性克隆用P15A-YZ-Up/Pox-bsaI-R2引物进行菌落PCR，验证构建成功质粒，结果如图 4B所示，PCR得到1.25 kb条带，序列正确的质粒为poxB-N20。

图 4 构建质粒验证及重组验证 Fig. 4 Certify the correct plasmid and stain after MVA genes integrated. (A) PCR of backbone 1, backbone 2 and poxB gene for pPoxB-N20. (B) PCR verification of pPoxB-N20. (C) PCR verification of pPoxB- ALV23. (D) PCR verification of the recombination.

图选项

PCR方法扩增pALV23质粒上MVA途径几个基因及其启动子序列；用PCR方法扩增含poxB-N20质粒，得到含poxB同源臂和poxB基因中间一段gRNA识别序列的N20片段，将两片段用Golden Gate方法进行连接。将阳性克隆用P15A-YZ-Up/ mvaE-430-r进行PCR验证，结果如图 4C所示，约1.85 kb条带为正确克隆，得到pPoxB- ALV23，用于整合MVA途径基因。

CRISPR-Cas9系统是一种强大的基因组编辑工具，利用靶点特异性的RNA (Guide RNA，gRNA)将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割。本研究根据Zhao等文献报道，用CRISPR-Cas9系统辅助技术整合基因^[19]。在LYC101菌株中转化pRed_Cas9和pPoxB- ALV23质粒，然后用阿拉伯糖诱导cas9表达，对染色体poxB的N20区域进行切割，pPoxB-ALV23提供poxB同源臂和MVA途径基因及启动子进行整合。将诱导整合后菌液稀释涂含阿拉伯糖和氯霉素、硫酸卡那霉素平板，用mvaE-430-r/poxB- yz-up引物对生长出的菌落进行验证，结果如图 4D所示，PCR验证得到1.5 kb的条带，说明整合成功。将PCR验证正确菌株，用PCR扩增完整MVA基因片段送样测序，测序完全正确菌株为MVA途径整合到LYC101的poxB位点的菌株。因为质粒不稳定，将本菌株在不加抗生素的LB液体培养基中培养24 h，在LB平板上划线得到单菌落；挑取单菌落分别在LB平板和LB+氯霉素平板上划线，在LB平板上生长而在LB+氯霉素平板上不生长的菌落为质粒丢失成功菌株，命名为LYC102。

将整合成功菌株LYC102和出发菌株LYC101发酵，比较整合MVA途径对番茄红素产量的影响。

结果如图 5所示，将质粒pALV23的MVA途经基因整合后菌株LYC102细胞生长略有降低，OD₆₀₀从15.02降低到12.6，降低了12%，细胞生长变慢可能和MVA途径基因表达不够协调有关，MVA途径各基因表达不协调引起中间代谢物积累，产生细胞毒性，从而部分限制细胞生长^[15]。LYC102的番茄红素产量明显提高，从单位细胞产量18.68 mg/g增加到40.93 mg/g，增加了1.19倍，比用质粒表达MVA途径基因的菌提高了20%。LYC101菌株中MEP途径和中央代谢途径已经进行过精确调控，经MEP途径有效合成了萜类化合物合成的直接前体物质IPP和DMAPP，番茄红素产量达到18.68 mg/g DCW，添加MVA途径后，增加了IPP和DMAPP的供应，番茄红素产率达40.9 mg/g。进一步提高了番茄红素的单位细胞产量。

图 5 MVA途径基因整合后菌株番茄红素产量及生长 Fig. 5 Lycopene production and cell growth after integrating MVA genes.

图选项

本研究利用从RBS文库中筛选到的、使MVA途径协调表达、利于β-胡萝卜素合成的质粒pALV23和pALV145研究其对重组大肠杆菌产番茄红素的影响。结果表明，两个质粒在高、低产番茄红素的菌株中都可以有效提高番茄红素产量，但是，在高低产菌株中，两个质粒反应不同。在低产菌株LYC001中，pALV145质粒菌株番茄红素产量高于pALV23质粒菌株；而在高产菌株LYC101中，pALV23质粒菌株番茄红素产量高于pALV145质粒菌株。pALV23和pALV145是从DXS37-idi46菌株中筛选而来，和LYC001基因型比较相似^{[8, 22]}，所以pALV23和pALV145在LYC001中的表现和在DXS37-idi46一致，即pALV145使LYC001和DXS37-idi46产类胡萝卜素的量高于pALV23。而在番茄红素产量较高的菌株LYC101中，pALV23和pALV145质粒对类胡萝卜素产量的影响与它们在DXS37-idi46影响相反，在DXS37-idi46中产量低的pALV23，反而在LYC101中得到较高的类胡萝卜素产量。LYC101与DXS37-idi46相比，不仅MEP途径和类胡萝卜素合成途径进行过精确调控，中央代谢途径的关键基因也进行过调控，菌株环境发生了改变，所以两个质粒在菌株中反应也会不同。另外，pALV23和pALV145中MVA途径各基因RBS理论强度存在差别^[17]，推测pALV23前两个基因RBS强度较高，可能是pALV23质粒在高产菌中利于类胡萝卜素产量提高的关键因素。

本研究中MVA途径基因整合后与MVA基因质粒存在相比，番茄红素产量提高20%，推测是质粒在LYC101中不稳定引起的。Ye等研究发现^[21]，用质粒表达外源基因时，发酵24 h，90%以上菌株质粒丢失；因此，本研究中因为质粒不稳定性，MVA途径基因在质粒上以多拷贝形式存在时反而比染色体整合、单拷贝形式存在时番茄红素产量更低。

另外，目前在大肠杆菌进行无痕同源重组通常是用red重组酶辅助，sacB进行反筛^[22-23]。该方法需要进行两步同源重组，并且因为sacB基因不是一个完全致死基因，如果插入片段较大，整合很困难，在反筛时很难得到整合成功菌株。本研究用CRISPR-Cas9技术辅助将MVA途径基因和启动子一共6.7 kb条带一次性整合到LYC101菌株的染色体上，因为6.7 kb整合片段和同源臂在质粒上，在诱导过程中持续提供待整合片段，大大提高了整合效率^[19]。

本研究通过同源重组将平衡表达的MVA途经基因整合到LYC101中，得到遗传稳定的菌株LYC102，番茄红素产率达40.9 mg/g，是出发菌株LYC101产量的2.19倍，比用质粒表达MVA途径基因的菌株提高了20%。在重组大肠杆菌中同时表达合成萜类化合物前体物质的MVA途径和MEP途径，可以有效提高番茄红素产量；本研究构建了不含质粒的、遗传稳定的高产番茄红素菌株，为产业化合成番茄红素提供基础；同时构建平台菌株，可以用于其他萜类化合物合成。